Timm13突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途
技术领域
本发明涉及疾病相关突变基因，具体涉及TIMM13突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途。
背景技术
在所有遗传性代谢疾病中，线粒体疾病的发病率最高。线粒体主要负责氧化磷酸化产生三磷酸腺苷。线粒体疾病的发病机制涉及两种不同的基因组：核基因组和母体遗传的16.6kb线粒体基因组。线粒体疾病可由这些基因组中的任何一个突变引起的。核DNA(nDNA)的缺陷会导致诸如呼吸链复杂结构、翻译和线粒体DNA(mtDNA)修复缺陷等问题。在儿童时期诊断的线粒体疾病中，大约25％是由于线粒体DNA异常引起的，而其余75％是由于nDNA缺陷引起的。严重的新生儿或婴儿起病的线粒体疾病通常会导致出生后一年内死亡，婴儿致死性线粒体疾病(lethal infantile mitochondrial disease,LIMD)约占儿童期起病线粒体疾病病例的8.5％，但LIMD的分子遗传诊断率很低，大多数LIMD病例是在受试者死亡后通过生物化学和遗传方法才得到诊断。因此，当父母再次怀孕时，这类新生儿发病的严重线粒体疾病由于诊断不及时，还有可能再次发生。虽然已发现近千种核基因组基因与线粒体的功能有关，仅仅有少部分确定与LIMD的发生有关，提示存在新的LIMD致病基因有待挖掘。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与婴儿致死性线粒体疾病有关的TIMM13突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种突变TIMM13基因或突变TIMM13蛋白，所述突变TIMM13基因与人类基因组参考序列GRCh37相比具有以下突变中的至少一种：
19号染色体物理位置为2427459的碱基由G突变为A、19号染色体物理位置为2427310的碱基由T突变为A；
所述突变TIMM13基因的cDNA序列与SEQ ID NO.1的序列相比具有如下突变中的至少一种：
c.73C>T、c.133A>T；
所述突变TIMM13蛋白的序列与SEQ ID NO.2的序列相比具有以下突变中的至少一种：
p.Gln25Ter(25位谷氨酰胺突变为终止密码子)、p.Lys45Ter(45位赖氨酸突变为终止密码子)。
TRANSLOCASE OF INNER MITOCHONDRIAL MEMBRANE 13(线粒体内膜转位酶13，TIMM13)基因位于19号染色体19p13.3位置，该基因含有3个外显子，其编码的TIMM13蛋白有80个氨基酸，分子量约为9KDa。TIMM13是线粒体膜间伴侣，介导多种多通道跨膜蛋白的导入和插入到线粒体内膜；还介导β-桶前体从TOM复合体转移到外膜形成SAM复合体。TIMM13作为一种类似伴侣的蛋白质，保护疏水前体不聚集，并引导它们通过线粒体膜间隙。TIMM8-TIMM13复合物介导诸如TIMM23、SLC25A12/ARALAR1和SLC25A13/ARALAR2等蛋白质的导入。目前TIMM13与疾病的相关性未见报道。
野生型TIMM13基因在Ensemble数据库(www.ensembl.org)中的基因编码为ENSG00000099800，该基因位于19号染色体。发明人在大量正常人和LIMD患者家系中利用遗传学研究筛选发现TIMM13基因发生基因突变可以导致婴儿致死性线粒体疾病。本发明提供了新的致病基因的致病突变位点，为该疾病的早期分子筛查提供了新的分子生物学基础。
上述第一种突变、第二种突变均位于翻译区，其中第一种突变的物理位置为2427459，碱基G突变为A；RNA水平：TIMM13基因的cDNA序列第73位碱基由C突变为T；蛋白水平：TIMM13基因编码蛋白第25位氨基酸由谷氨酰胺突变为终止密码子。
第二种突变的物理位置为2427310，碱基由T突变为A，RNA水平：TIMM13基因的cDNA序列第133位碱基由A突变为T；蛋白水平：TIMM13基因编码蛋白第45位氨基酸由赖氨酸突变为终止密码子。
一种检测突变TIMM13基因或突变TIMM13蛋白的方法，所述方法用于非诊断目的，所述方法包括检测TIMM13基因或TIMM13蛋白中是否存在突变位点；突变位点为如下至少一种：
Chr19(GRCh37):g.2427459G>A，cDNA序列发生c.73C>T，p.Gln25Ter(25位谷氨酰胺突变为终止密码子)；
Chr19(GRCh37):g.2427310T>A，cDNA序列发生c.133A>T，p.Lys45Ter(45位赖氨酸突变为终止密码子)。
在一些实施方案中，本发明中所述的非诊断疾病的目的包括但不限于研究SNP分布和多肽性，用于家族演化研究。这样的应用是本领域技术人员可以理解的。
有些个体携带本发明的突变TIMM13基因但不患LIMD，例如仅一条染色体携带所述突变的杂合基因型。对这部分人群的检测可以不涉及任何诊断疾病的目的，因为这些个体本身并不患病。但对于他们进行检测的结果可以作为有用的信息使用，例如作为育前检查的重要指标，指导生育，或者用于突变携带者筛查，或者作为SNP分布和多态性研究的工具或者追踪基因突变或家族演化。这样的应用也是本领域技术人员可以理解的。因此，本发明提供的检测突变TIMM13基因或突变TIMM13蛋白的方法涉及检测杂合突变。
但本发明提供的检测突变TIMM13基因或突变TIMM13蛋白的方法也包括检测纯合突变。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述检测突变TIMM13基因或突变TIMM13蛋白的方法包括利用如下至少一组引物进行PCR扩增的步骤：
TIMM13_E1F:GACCTCGGTCCGGTTGACTT(SEQ ID NO:3)和
TIMM13_E1R:CCTGCTCGGAGTTGTCCAG(SEQ ID NO:4)；
TIMM13_E2F:CGAAAGTGCAGATCGCCGTG(SEQ ID NO:5)和
TIMM13_E2R:CGTGTTCCAGGCGTCCATGT(SEQ ID NO:6)。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述采用引物进行扩增的PCR反应程序包括：94-100℃，1-10min；94-95℃，3-5min，95-96℃，25-30s，58-60℃，25-30s，循环30-40次，70-72℃，1-10min。
检测突变TIMM13基因的方法包括如下步骤：
(1)建立LIMD患者家系临床与遗传资源库，收集LIMD家系的临床信息与血液样本，提取基因组DNA；
(2)设计覆盖TIMM13基因全外显子序列的扩增和测序引物进行测序；
(3)比对正常人和LIMD患者家系样本的测序结果。
在其中一种实施方式中，上述序列测定是Sanger序列测定。
在其他实施方式中，上述检测突变TIMM13基因的方法还可以选自如下的技术进行：
电泳、核酸杂交、原位杂交、PCR、逆转录酶链反应和变性高效液相色谱。
在其他实施方式中，还涉及检测TIMM13基因外显子和外显子/内含子边界突变的方法，其包括如下步骤：
(1)从受试者提取DNA样本；
(2)对上述DNA样品的外显子组和所有外显子/内含子边界序列进行测序得到测序片段；
(3)将上述测序片段与参考序列比对，得到基因外显子和外显子/内含子边界突变。
一种检测突变TIMM13基因的试剂，所述试剂为核酸检测探针或引物；
所述核酸检测探针与突变TIMM13基因互补；所述突变TIMM13基因与人类基因组参考序列GRCh37相比具有以下突变中的至少一种：
19号染色体物理位置为2427459的碱基由G突变为A、19号染色体物理位置为2427310的碱基由T突变为A；
所述突变TIMM13基因的cDNA序列与SEQ ID NO.1的序列相比具有如下突变中的至少一种：
c.73C>T、c.133A>T；
所述核酸检测探针与突变TIMM13基因互补的区域包括选自如下至少一种的物理位置或cDNA序列位置：
物理位置第2427459位、第2427310位；cDNA序列第73位、第133位；
所述引物为具有如下序列的至少一组引物：
TIMM13_E1F:GACCTCGGTCCGGTTGACTT(SEQ ID NO:3)和
TIMM13_E1R:CCTGCTCGGAGTTGTCCAG(SEQ ID NO:4)；
TIMM13_E2F:CGAAAGTGCAGATCGCCGTG(SEQ ID NO:5)和
TIMM13_E2R:CGTGTTCCAGGCGTCCATGT(SEQ ID NO:6)。
核酸检测探针通过与突变TIMM13基因的互补区核酸配对从而实现突变TIMM13基因的检测。
在其他实施方式中，检测突变TIMM13基因的试剂还包括缓冲液，酶，无机盐。
采用检测突变TIMM13基因的引物对模板DNA进行扩增，通过测序或凝胶电泳对扩增产物进行突变鉴定。
一种检测突变TIMM13基因的试剂盒，它包括所述的试剂。
在其他实施方式中，上述检测突变TIMM13基因的试剂盒还包括缓冲液、使用说明书。
一种检测突变TIMM13基因或突变TIMM13蛋白的试剂在制备婴儿致死性线粒体疾病检测试剂中的应用；
所述婴儿致死性线粒体疾病检测试剂为基因芯片用试剂、DNA扩增用试剂、反转录扩增用试剂、限制性内切酶酶切方法用试剂或测序用试剂。
基因芯片用试剂可以是cDNA芯片用探针。
DNA扩增用试剂可以是引物，探针。
反转录扩增用试剂可以是反转录扩增引物，反转录扩增缓冲液。
限制性内切酶酶切方法用试剂可以是含限制性内切酶位点的引物，无缝克隆缓冲液。
测序用试剂可以是引物，检测缓冲液。
一种检测突变TIMM13基因的试剂在婴儿致死性线粒体疾病早期分子筛查中的应用，该应用为非疾病的诊断目的。
一种检测突变TIMM13基因的试剂盒在婴儿致死性线粒体疾病早期分子筛查中的应用，该应用为非疾病的诊断目的。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：
本发明提供了一种TIMM13突变基因、检测其的试剂、引物、试剂盒和方法以及其用途，创造性的挖掘出一种LIMD致病基因TIMM13，并提供了TIMM13突变基因位点，这为婴儿致死性线粒体疾病的早期分子筛查、家族遗传研究、遗传咨询提供了重要的依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为家系图；
图2为TIMM13突变序列的高通量测序图。
图3为TIMM13突变序列的Sanger测序图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例对多个婴儿致死性线粒体疾病(lethal infantile mitochondrialdisease,LIMD)患者的家系进行全外显子组高通量测序检测，其包括如下依次进行的步骤：
(1)样本收集和基因组DNA的提取。
收集家系成员的临床资料以及血液样本(EDTA抗凝)，样本为送检至福瑞医学检验实验室有限公司的血液样本。
根据血液DNA提取试剂盒(Magen,HiPure Blood&Tissue DNA Kit)的说明书步骤提取家系各成员的血液基因组DNA。使用Nanodrop one测量DNA的纯度，所得基因组DNA的OD260nm/OD280nm均位于1.7-2.0之间，使用Nanodrop one测量DNA的浓度，所得基因组DNA的浓度为50-100ng/μL，总量为5-10μg。置于-20℃保存。
(2)外显子组测序和生物信息学分析。
为了找到LIMD其他的致病基因，我们应用外显子组测序筛选1个LIMD家系中潜在的遗传变异(家系图参照图1所示)，而从现有已知的LIMD致病基因检测中并没有发现病理变异。
外显子组测序是在先证者身上进行。简而言之，将基因组DNA片段化，并通过使用KAPA公司的试剂盒(KAPA HyperPlus Library Preparation Kit)对基因组DNA进行酶切片段化、末端修复、3'末端加A、链接接头和PCR扩增；采用IGT公司的文库构建试剂盒(xGenExome Research Panel v2)捕获外显子区域。在Novaseq测序仪(Illumina，圣地亚哥，CA，美国)上对文库进行测序(测序深度为150X)。使用Novocraft NovoAlign将NGS测序结果和人类参考基因组UCSC NCBI37/hg19进行比对，获得比对到基因组上的唯一比对序列。利用VarScan mpileup2snp和VarScan mpileup2indel检测确定靶区域的变异。利用Remove RunCommon Variants和Remove Global Common Variants软件用来去除dbSNP和ExAC数据库中的常见变异。然后利用Interactive Biosoftware Alamut Batch对变异进行注释。注释用到的数据库包括：dbSNP、ExAC、1000g、ClinVar、OMIM等。利用filterAlamut.py将注释后的变异按照High，Medium，Low排序。在High和Medium分组中，给予变异一个优先级值和分级理由。所有的变异最初都在Low组别中，当一个变异符合某些标准时，则可以被划分为更高级别的变异。并利用FATHMM、FATHMMMKL、METALR、METASVM、MUTATIONASSESSOR、MUTATIONTASTERAGVGD、AGVGD、LRT,PROVEAN、SIFT软件进行SNP功能预测。
通过对图1中的1个LIMD家系TIMM13基因的全外显子测序和生物信息学分析后，我们发现了先证者携带2个复合杂合突变，突变测序结果的BAM文件参照图2所示，所述的TIMM13基因在Ensemble数据库(www.ensembl.org)中的基因编码为ENSG00000099800，其中突变TIMM13 p.Gln25Ter，物理位置为2427459的碱基由G突变为A；RNA水平：TIMM13基因编码RNA第73位碱基由C突变为T；蛋白水平：TIMM13基因编码蛋白第25位氨基酸由谷氨酰胺突变为终止密码子；突变TIMM13 p.Lys45Ter，物理位置为2427310的碱基由T突变为A；RNA水平：TIMM13基因编码RNA第133位碱基由A突变为T；蛋白水平：TIMM13基因编码蛋白第45位氨基酸由赖氨酸突变为终止密码子；并未发现其他可疑的致病基因的突变位点。
上述TIMM13基因的突变p.Gln25Ter、p.Lys45Ter未被gnomAD等正常人群数据库收录，将导致先证者TIMM13蛋白功能的完全丧失，严重影响TIMM13蛋白的生理功能。根据已知生物学功能结果，与先证者LIMD的临床症状高度相符。
根据我们所设计的筛选流程，借助于高通量深度测序及生物信息学分析，我们成功发现TIMM13基因为LIMD新致病基因，突变p.Gln25Ter、p.Lys45Ter为该疾病新的致病位点。
(3)Sanger测序验证，鉴定突变基因。
Sanger测序用于验证外显子测序检测出的TIMM13基因的2个突变：c.73C>T、c.133A>T(参照图3所示)。采用Primer 3引物设计软件设计引物序列SEQ ID NO.3～SEQ IDNO.6，该引物序列扩增包含TIMM13基因突变位点在内的基因组DNA片段。
PCR扩增体系(20μl)包括：PCR 5×buffer mix 10μl，正向引物(10μmol)1μl，与正向引物对应的反向引物(10μmol)1μl，ddH2O 6μl，DNA2μl。PCR反应程序：95℃5min，35个循环(95℃5min，95℃30s，60℃30s)，72℃10min，4℃保存。PCR扩增完成后采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收PCR产物凝胶，并用Taq酶纯化回收产物。将所有PCR产物分别以正、反向引物测序。测序结果参考图3所示。
综上，本发明鉴定出的突变TIMM13基因可用于LIMD患者早期临床筛查，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 福州福瑞医学检验实验室有限公司
<120> TIMM13突变基因、检测其的引物、试剂盒和方法以及其用途
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 243
<212> DNA
<213> 人(human)
<400> 1
atggagggcg gcttcggctc cgatttcggg ggctccggca gcgggaagct ggacccaggg 60
ctcataatgg agcagaggat gacggacaag tgtttccgga agtgtatagg gaaacctggg 120
ggctccctgg acaactccga gcagaagtgc atcgccatgt gcatggaccg ctacatggac 180
gcctggaaca ccgtgtctcg cgcctacaac tcgcggctgc agcgggaacg agccaacatg 240
tga 243
<210> 2
<211> 80
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 2
Met Glu Gly Gly Phe Gly Ser Asp Phe Gly Gly Ser Gly Ser Gly Lys
1 5 10 15
Leu Asp Pro Gly Leu Ile Met Glu Gln Arg Met Thr Asp Lys Cys Phe
20 25 30
Arg Lys Cys Ile Gly Lys Pro Gly Gly Ser Leu Asp Asn Ser Glu Gln
35 40 45
Lys Cys Ile Ala Met Cys Met Asp Arg Tyr Met Asp Ala Trp Asn Thr
50 55 60
Val Ser Arg Ala Tyr Asn Ser Arg Leu Gln Arg Glu Arg Ala Asn Met
65 70 75 80
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gacctcggtc cggttgactt 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctgctcgga gttgtccag 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgaaagtgca gatcgccgtg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgtgttccag gcgtccatgt 20
