用于辨别菊花白色锈病抗性的caps分子标记及其应用
技术领域
本发明属于植物分子领域，具体涉及一种辨别菊花白色锈病抗性的CAPS分子标记及其应用，可用于菊花白色锈病抗性鉴定及分子标记辅助选择育种。
背景技术
菊花(Chrysanthemum morifolium)是菊科菊属多年生宿根草本植物，是我国十大传统名花之一。菊花种类繁多、花型多变、色彩丰富，具有极高的观赏与经济价值，在园林绿化中广泛应用。菊花白色锈病是由堀氏菊柄锈菌(Puccinia horiana Henn.)引起的菊花专性寄生病害，发病时危害菊花叶片、幼茎、花部，乃至整个植株枯萎死亡，极大的降低了菊花观赏性。菊花白色锈病是世界性检疫病害，传染范围广泛，是菊花生产过程中最重要的破坏性病害之一，大面积发病将造成菊花产业的巨大损失，严重制约了菊花产业的发展。
分子标记辅助育种具有快速鉴定目标性状，方法简便、价格低廉，主要应用在植物基因分型、分子标记辅助选择育种、品种鉴定等方面。目前尚无通过分子标记鉴定菊花白色锈病性状的方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种用于辨别菊花白色锈病抗性的分子标记及其应用，能够在菊花任意发育阶段辨别菊花材料对菊花白色锈病的抗性，加快菊花育种进程。本发明是通过如下技术方案实现的：
一种用于辨别菊花白色锈病抗性的分子标记，所述分子标记为酶切扩增多态性序列(CAPS)，所述酶切扩增多态性序列(CAPS)的原始序列的上游引物的核苷酸序列为SEQ IDNO：1，下游引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。
另一方面，本申请还保护一种根据上述的分子标记辨别菊花白色锈病抗性的方法，包括如下步骤：
(1)菊花基因组DNA提取：
采用CTAB法，提取待测菊花基因组DNA；
(2)PCR扩增全长序列：
PCR反应体系：包括2×高保真Taq酶缓冲液5μL，DNA模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，去离子水2μL；
PCR反应条件：98℃预变性3分钟；98℃变性10秒，45℃退火30秒，72℃延伸3分钟30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；4℃保存；
(4)全长序列纯化与克隆载体连接
①全长序列纯化：利用琼脂糖凝胶纯化回收试剂对目的片段进行纯化；
②目的片段连接克隆载体后转化大肠杆菌感受态；
(4)阳性质粒鉴定与测序：
选取单菌落至含有50mg/L的卡那霉素的LB液体培养基中，200rpm条件下在37℃孵育12小时，菌液浑浊后，进行PCR验证，引物为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；
利用质粒快速提取试剂盒提取质粒；
(5)用质粒为模板，PCR扩增所述分子标记原始序列
PCR反应体系：包括2×Taq酶缓冲液5μL，质粒模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，去离子水2μL；
PCR反应条件：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸45秒，35个循环；72℃延伸7分钟；4℃保存；
(6)限制性内切酶NlaШ酶切质粒PCR的产物：
限制性内切酶NlaШ识别序列为CATG^；
酶切反应体系：PCR产物6μL，NlaШ限制性内切酶0.5μL，10×酶切缓冲液1.5μL，去离子水4μL；
酶切反应条件：37℃酶切60分钟；
(7)酶切上述PCR产物后，进行琼脂糖凝胶电泳检测：
经凝胶成像仪成像后，当显示出523bp和99bp两条特异性条带时，为抗白色锈病的菊花；当显示出643bp特异性条带时，为感白色锈病的菊花。
进一步地，所述步骤(3)中②的具体步骤如下：
取①中获得的PCR纯化产物4μL，克隆载体溶液1μL，轻轻混合后25℃连接25分钟；连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，冰浴30分钟后42℃水浴热激90秒，再冰浴2分钟；加入LB液体培养基600μL，200rpm条件下在37℃孵育1小时；取浑浊菌液200μL均匀涂布于加入50mg/L的卡那霉素的LB固体培养基上，37℃条件下倒置培养过夜。
进一步地，所述Taq酶缓冲液含Taq酶0.2U、dNTPs 1μM及镁离子。
进一步地，所述方法在菊花发育任意时期均可鉴定菊花是否抗菊花白色锈病。
另一方面，本申请还保护一种用于辨别菊花白色锈病抗性的分子标记的获取方法，包括以下步骤：
(1)菊花的培育：分别培育抗菊花白色锈病和感菊花白色锈病的菊花材料；
(2)菊花基因组DNA提取：
采用CTAB法，分别提取抗菊花白色锈病和感菊花白色锈病的菊花基因组DNA；
(3)菊花白色锈病基因全长克隆引物设计：
全长克隆引物包括上游全长克隆引物和下游全长克隆引物，相应的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；
(4)PCR扩增：
PCR反应体系：包括2×高保真Taq酶缓冲液5μL，上游全长克隆引物1μL，下游全长克隆引物1μL，DNA模板1μL，去离子水2μL，总计10μL；
PCR反应条件：98℃预变性3分钟；98℃变性10秒，45℃退火50秒，72℃延伸3分钟30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；4℃保存；
(5)琼脂糖凝胶电泳：
将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪观察条带位置；
(6)扩增产物回收；
(7)回收产物连接克隆载体，转化大肠杆菌；
(8)测序：
测得抗菊花白色锈病的菊花核苷酸序列为SEQ ID NO：5，感菊花白色锈病的菊花核苷酸序列为SEQ ID NO：6；
(9)合成用于辨别菊花白色锈病抗性的分子标记
根据步骤(8)中所得的核苷酸序列SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，确定酶切位点为CATG^；设计合成所述酶切扩增多态性序列(CAPS)的原始序列的上游引物核苷酸序列SEQID NO：1和下游引物核苷酸序列SEQ ID NO：2。
进一步地，所述高保真Taq酶缓冲液含高保真Taq酶0.2U、dNTPs 1μM及镁离子。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
建立了一种应用CAPS分子标记在不受发育阶段影响的情况下，用于鉴定某菊花品种是否抗菊花白色锈病，在菊花白色锈病抗病新品种选育方面也具有指导意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为菊花‘C029’叶片图；
图2为菊花‘Jinba’叶片图；
图3为实施例2琼脂糖凝胶电泳检测；
图4为菊花品种‘早玉盘’叶片图；
图5为实施例3琼脂糖凝胶电泳检测图；
图6为菊花品种‘S20-4’叶片图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
参见图1和图2，本申请发明人前期以抗菊花白色锈病的菊花品种‘C029’和感菊花白色锈病的菊花品种‘Jinba’为试材，通过同源克隆，鉴定到一个菊花白色锈病相关基因，菊花白色锈病相关功能基因的挖掘为菊花白色锈病性状的育种提供理论依据。
培育菊花‘C029’和‘Jinba’扦插苗的方法如下：
剪取菊花‘C029’和‘Jinba’茎段，每段10-12cm，扦插于营养土中，每日喷水2-3次，30天后移栽上盆进行常规养护管理。
实施例1：
1.1分子标记的获得
(1)菊花的培育：采用常规扦插方法培育菊花抗白色锈病品种‘菊花的培育和感白色锈病品种‘Jinba’扦插苗；
(2)提取菊花基因组DNA
采用CTAB方法，分别提取‘C029’和‘Jinba’的DNA，具体方法如下：
①0.15g叶片于液氮保护下，充分研磨后迅速转移至2mL离心管中，加入65℃预热的2％β巯基乙醇-CTAB提取液700μL。于65℃水浴1小时，每隔10分钟轻柔振荡。
②室温冷却30分钟，加入氯仿/异戊醇(24：1)混合液700μL，充分振荡混匀，12000rpm，离心7分钟。
③取400μL上清液至新的1.5mL离心管中，加入800μL异丙醇(-20℃预冷)，置于-20℃下静置1小时。
④将上述混合物在12000rpm下离心7分钟，然后弃上清液。
⑤加入700μL 75％乙醇(-20℃预冷)洗涤DNA，12000r离心2分钟，弃上清。
⑥重复步骤⑤一次。室温晾干，加TE定容至50μL，-20℃保存。
(3)菊花白色锈病基因全长克隆引物设计：
在菊花基因组数据库中(http://www.amwayabrc.com/zh-cn/index.html)下载CHR00066647基因序列，设计该基因的全长序列扩增引物，所述引物序列为：
上游引物F(SEQ ID NO：3)：ATGAAACCACCTTCAGAAAC
下游引物R(SEQ ID NO：4)：TCAAATCGCGTACATTTTC
(4)PCR扩增
PCR反应体系：包括2×高保真Taq酶缓冲液(含高保真Taq酶0.2U、dNTPs1μM及镁离子)5μL，DNA模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，去离子水2μL；
PCR反应条件：98℃预变性3分钟；98℃变性10秒，47℃退火30秒，72℃延伸3分钟30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；4℃保存；
(5)琼脂糖凝胶电泳检测
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像仪观察条带。
(6)扩增产物回收
使用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收；
(7)纯化产物连接克隆载体，转化大肠杆菌，提取质粒；
(8)测序：将连接克隆载体的质粒测序，测得双亲全长序列如下：
>C029(SEQ ID NO：5)
ATGAAACCACCTTCAGAAACCGGGCTGCCACCCCCCACTCCTCGTAAAAAGATGGTGAAACAGGTGACAGGAAAACGCGATGACACCCCTTTGCATGCGGCCGCTAGAGCGGGGAACATTCACACGATCATAAATCTTTTGGGTGATTGTTACTCAGAAGAAGAATTTATTTCTTTGCTGTCGAAGCAGAATTATGCAGGCGAGACACCTTTGTATGTGGCAGCAGAATATGGTTATGTTGATTTGGTTAGACTCTTGATAGATCAATGTGATATTGCTACTGCTAGCATTAAAGCTAACAACGGTTTTGATGCTCTTCATATTGCTGCTAAACAAGGAGATTTAGGTAAGATATCACTTTTGTCTTTTAAGTATATTTATAGGGTGTTTGTAATTGCTTATTTATGATGATATCTGCTTATTTCTTAGCAGATTAGTTGAGTTTTTAAATAACTGCTTATTTGTATCTACTTGTTATTAAGTAGATACACTTTAAAATAAACAGTTTCAAGCACCCCTTAAATTTTATCAATACTATTATTATTTAGCTGTTTTTTAAACTATTTTCGCTCCTTTGGCGTGTAGAGATATTAAAAGTGTTAATGGAAGCACATCCGGAGTTATCAATGACGGTGGATATATCAAACACCACAGCTTTGCACACCGCGGCAATGCAAGGCAACATTGAGGTGATGAACTATCTACTAGAGATAGAGAGTAGTTTGGCATCGATAGCGAGAAGTAATGGGAAAACAGCATTACATTCGGCTTCAAGAAATGGGCATCTTAGAGTGGTGAAAGCTCTTTTGGAGAAGGCACCAGGGATTTCAGCGAGGAATGATAAGAAGGGGCAGACCGCCCTTCACATGGCTGCGAAAGGCCAGAATCATGAGTTGGTTGAGGAGTTGATCAAGGTGGATCCGTCGTTGATAAATATGGCTGATGCTAAGGGTAACACGGCTTTGCATATAGCAACACGTAAAGGACGTGTTCAGGTAAAAATTCGGTTTTGAGCATCTTGGTTAAATATAGTGATGTAGTTGCAGTCAGGAAAATATATGTAATATGCATTGTGCACATGCTTTAACATATATTTTACCCGGGGTAACCCATTACCCAAAAACATACATAATGTCCATTTAGGGATGCCATATGCACTAGTGTTGTAGTGCATATGGAGTCTAGGATGTCAAATGTGACTCGCTAGTAGGATTGTTAGTTTCCTAGTCTCACGCATTAGGTATTGTACTTTTATGCAGATTGTAAAGATGTTACTAGCTCGTAGCGAAACCAACACAAGAGCCGTGAATAGGTCGAATGAGACCGCCTTCGACACAGCTCAAAAAATGGGCCATCCCCACATTGGAATCATCTTACAAGAACACGGAGTCCCAAGTGCTCGGGTCCTAAAACCTCCAACGACTCCAGCTCGAGAGCTCAAGCAAACCGTGAGTGACATAAAACACGAGGTCCACCACCAATTAGAACACACACGTCAAACTCGAAGAAGAGTCCAAGGCATTGCAAAACATCTCAACAAAATGCACGCCGAAGGCCTCAACAATGCAATAAATTCAACGACGGTCGTTGCTGTTTTGATCGCCACCGTGGCCTTTGCAGCAATCTTTACAGTCCCGGGCCAATATGCCGATGACCCAAATAACATTCCCGAAGGGTTTTCGCTAGGTGAGGCGAACGTGGCACCACAACCATTATTTATAGTATTTTTTGTTTTTGACTCAGTGGCTCTATTTATTTCATTAGCCGTGGTCGTGGTTCAAACATCTGTGGTGGTTATCGAAAGTAAAGCGAAGAAGCAAATGATGGCCATAATCAACAAGCTAATGTGGTTAGCTTGTGTGCTTATCTCGGTGGCATTTTTGGCCCTTGCGTTTATTGTGGTTGGGGAGCATGAGAAATGGCTAGCGATTTGTGTCACCATTATTGGAACAACGATAATGGTCACGACTTTGGGTTTAATGTGTTACTGGGTTATCATGCATCGGATTGAAAGTAAGAATATGAGAAATTTGAGAAAGAACTCGTTGACGGGTAGTGGAAGTAGGTCTCGGTCAAGGTCTAGATCATGGTCGATGTCTGTACTTTCAGACACAGATGCAATGAATACGGAGTTTAAGAAAATGTACGCGATTGAA
>Jinba(SEQ ID NO：6)
ATGAAACCACCTTCAGAAACCGGGCTGCCACCCCCCACTCCTCGTAAAAAGATGGTGAAACAGGTGACAGGAAAACGCGATGATACCCCTTTGCATACGGCTGCTAGAGCGGGGAACATTCACACGATCATAAATCTTTTGGGTGATTGTTACTCAGAAGAAGAATTTATTTCTTTGCTGTCGAAGCAGAATTATGCAGGCGAGACACCTTTGTATGTGGCAGCGGAATATGGTTATGTTGATTTGGTTAGACTCTTGATAGATCAATGTGATATTGCTACTGCTAGCATTAAAGCAAACAACGGTTTTGATGCTCTTCATATTGCTGCTAAACAAGGAGATTTAGGTAAGATATCACTTTTGTCTTTTAAGTATATTTATAGGTTGTTTGAAATTGCTTATTTATATTGAAATCTGCTTATTTTTTTAACAGATTAGTAGTTTGAGTTTTTAAATAACTACTTATTTGTATCTTGTTATTTTTAAGCAGATACACTTTAAGATAAGCAGTTTCAAGCACTCCTTAAATAATTTATCAATAGTAACACTATTACTATTATTTAACTGTCTTTTAAACTGATTTCGCTCCTTTAATTTGGCGTATAGAGATATTAAAAGTGTTAATGGAAGCACATCCGGAGTTATCAATGACGGTGGATATATCAAACACCACGGCTTTGCACACCGCGGCCATGCAAGGCAACATTGAGGTGATGAACTATCTACTAGAGATAGAGAGTAGTTTGGCATCTATAGCGAGAAGTAATGGGAAAACAGCATTGCATTCGGCCTCAAGAAATGGGCATCTTAGAGTGGTGAAAGCTCTTTTGGAGAAGGCACCCGGGATTTCAGCGAGGAATGATAAGAAGGGGCAGACCGCCCTTCACATGGCTGCGAAAGGCCAGAATCATGAGGTGGTTGAGGAGTTGATAAAAGTGGATCCGTCGTTGATAAATATGGCTGATGCTAAGGGTAACACGGCTTTGCATATAGCAACACGTAAAGGACGTGTTCAGGTAAAAATTCGGTTTTGAGCATCTTGTAAAAGTAAAGTAACTCCCAGTACCGTCTTCCACGGGTTATGGGTCCCAATACCGTCTTCCACGGTGTATGGGGGAGGTTAAGACGTAGACAACCATACCCCTACCTAAGGTAGAGAGGCTGCTTCCGGTTCTACCAAAGGTAGAAAAGGACCTCCGGCCTTGCGAGGGGTGAGGATCGAACCTTGACCTCTGTCTCCAGAGGCAAAGGTGTTAACCACTTGATCCAACCTTGCTCCAGAGGCAAGGGTTTTGAGCATCTTGTAAAGTACTTAAATGTATTGATGTATTGTTGCAGTCTCACGCATTAAATATTGTACTTTTATGCAGATTGTAAAGATGTTACTAGCTCGCAGCGAAACCAACACGAAAGCTGTGAATAGGTCGAACGAGACTGCCTTCGACACAGCTCAAAAAATGGGTCATCCCCACATTGGAATCATCTTACAAGAACACGGAGTCCCAAGTGCTCGGGTTCTAAAACCTCCAACGACTCCAGCTCGAGAGCTCAAGCAAACCGTGAGTGACATAAAACACGAGGTCCACCACCAATTGGAACACACTCGTCAAACTCGAAGAAGAGTCCAAGGCATTGCAAAACATCTCAACAAAATGCATGCCGAAGGCCTCAACAATGCAATAAATTCAACGACGGTTGTTGCTGTTTTGATCGCCACCGTGGCCTTTGCAGCAATCTTTACAGTCCCGGGCCAATATGCCGATGACCCAAATAACATTCCCGAAGGGTTTTCGCTAGGTGAGGCGAACGTGGCACCACAACCTTTATTTATAGTATTTTTTGTTTTCGACTCAGTGGCTCTATTTATTTCATTAGCCGTGGTCGTGGTTCAAACATCTGTGGTGGTTATCGAAAGTAAAGCGAAGAAGCAAATGATGGCCATAATCAACAAGCTAATGTGGTTAGCTTGTGTGCTTATCTCGGTGGCATTTTTGGCCCTTGCGTTTATTGTGGTTGGGGAGCATGAGAAATGGCTAGCGATTTGTGTCACCATTATTGGAACAACGATAATGGTCACGACTTTGGGTTTAATGTGTTACTGGATTATCATGCATCGGATTGAAAGTAAGAATATGAGAAATTTGAGAAAGAACTCGTTGACGGGTAGTGGAAGTAGGTCTCGGTCAAGGTCTAGATCATGGTCGATGTCTGTACTTTCGGACACAGATGCTATGAATACGGAGTTTAAGAAAATGTACGCGATTGAA
(9)合成用于辨别菊花白色锈病抗性的分子标记
根据步骤(8)中所得具有所示的核苷酸序列，通过Multalin在线软件(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)比较差异位点；包含差异位点的序列在dCAPSFinder2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)引入零错配，确定酶切位点为CATG^；设计合成两条寡核苷酸引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，即用于辨别菊花白色锈病抗性的分子标记，SEQ ID NO：1：ATGAAACCACCTTCAGAAAC，SEQ ID NO：2：AACTCCGGATGTGCTTCCAT。
1.2分子标记的应用
可以在菊花发育的任何阶段辨别对菊花白色锈病的抗性。所述分子标记的使用方法包括如下步骤：
(1)提取菊花基因组DNA
采用CTAB方法提取菊花基因组DNA，具体方法如下：
①0.15g叶片于液氮保护下，充分研磨后迅速转移至2mL离心管中，加入65℃预热的2％β巯基乙醇-CTAB提取液700μL。于65℃水浴1小时，每隔10分钟轻柔振荡。
②室温冷却30分钟，加入氯仿/异戊醇(24：1)混合液700μL，充分振荡混匀，12000r，离心7分钟。
③取400μL上清液至新的1.5mL离心管中，加入800μL异丙醇(-20℃预冷)，置于-20℃下静置1小时。
④将上述混合物在12000r下离心7分钟，然后弃上清液。
⑤加入700μL 75％乙醇(-20℃预冷)洗涤DNA，12000r离心2分钟，弃上清。
⑥重复步骤⑤一次。室温晾干，加TE定容至50μL，-20℃保存。
(2)PCR扩增全长序列：
PCR反应体系：包括2×高保真Taq酶缓冲液5μL，DNA模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，去离子水2μL；
PCR反应条件：98℃预变性3分钟；98℃变性10秒，45℃退火30秒，72℃延伸3分钟30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；4℃保存；
(3)全长序列胶纯化回收并连接载体转入大肠杆菌
a.全长序列纯化
①利用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒纯化目的片段。
②目的片段连接克隆载体后转化大肠杆菌感受态。
(4)阳性质粒鉴定与测序：
挑取单菌落至含有卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养基中，200rpm，37℃孵育12小时。菌液浑浊后，进行PCR验证，引物为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。具体PCR反应体系及反应条件如下：
菌液PCR反应体系：包括2×Taq酶缓冲液5μL，菌液3μL，上游引物1μL，下游引物1μL；
菌液PCR反应条件：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；4℃保存；PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测
利用质粒快速提取质粒。
(5)用质粒PCR扩增所述分子标记原始序列
PCR反应体系：包括2×Taq酶缓冲液5μL，质粒模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，去离子水2μL；
PCR反应条件：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸45秒，35个循环；72℃延伸7分钟；4℃保存；
(6)限制性内切酶NlaШ酶切质粒PCR产物：
限制性内切酶NlaШ识别序列为CATG^；
酶切反应体系：PCR产物6μL，NlaШ限制性内切酶0.5μL，10×酶切缓冲液1.5μL，去离子水4μL；
酶切反应条件：37℃酶切60分钟；
(7)酶切后PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测：
经凝胶成像仪成像后，当显示出523bp和99bp两条特异性条带时，为抗白色锈病的菊花；当显示出643bp特异性条带时，为感白色锈病的菊花。
实施例2：
验证该分子标记为菊花白色锈病抗病品种‘早玉盘’的特异性分子标记。
具体方法如下：
1.菊花的培育：扦插菊花白色锈病抗病品种‘早玉盘’。
剪取菊花‘早玉盘’茎段，每段10-12cm，扦插于营养土中，每日喷水2-3次，30天后移栽上盆进行常规养护管理。
2.CAPS分子标记的检测：
(1)提取菊花基因组DNA
采用CTAB方法提取菊花基因组DNA，具体方法如下：
①0.15g叶片于液氮保护下，充分研磨后迅速转移至2mL离心管中，加入65℃预热的2％β巯基乙醇-CTAB提取液700μL。于65℃水浴1小时，每隔10分钟轻柔振荡。
②室温冷却30分钟，加入氯仿/异戊醇(24：1)混合液700μL，充分振荡混匀，12000r，离心7分钟。
③取400μL上清液至新的1.5mL离心管中，加入800μL异丙醇(-20℃预冷)，置于-20℃下静置1小时。
④将上述混合物在12000r下离心7分钟，然后弃上清液。
⑤加入700μL 75％乙醇(-20℃预冷)洗涤DNA，12000r离心2分钟，弃上清。
⑥重复步骤⑤一次。室温晾干，加TE定容至50μL，-20℃保存。
(2)PCR扩增全长序列：
PCR反应体系：包括2×高保真Taq酶缓冲液5μL，DNA模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，去离子水2μL；
PCR反应条件：98℃预变性3分钟；98℃变性10秒，45℃退火30秒，72℃延伸3分钟30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；4℃保存；
(3)全长序列胶纯化回收并连接载体转入大肠杆菌
①利用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒纯化目的片段。
②目的片段连接克隆载体后转化大肠杆菌感受态
(4)阳性质粒鉴定与测序：
挑取单菌落至含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，200rpm，37℃孵育12小时。菌液浑浊后，进行PCR验证，引物为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。具体PCR反应体系及反应条件如下：
菌液PCR反应体系：包括2×Taq酶缓冲液5μL，菌液3μL，上游引物1μL，下游引物1μL；
菌液PCR反应条件：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；4℃保存；PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测
利用质粒快速提取质粒。
(5)用质粒PCR扩增所述分子标记原始序列
PCR反应体系：包括2×Taq酶缓冲液5μL，质粒模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，去离子水2μL；
PCR反应条件：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸45秒，35个循环；72℃延伸7分钟；4℃保存；
(6)限制性内切酶NlaШ酶切质粒PCR产物：
限制性内切酶NlaШ识别序列为CATG^；
酶切反应体系：PCR产物6μL，NlaШ限制性内切酶0.5μL，10×酶切缓冲液1.5μL，去离子水4μL；
酶切反应条件：37℃酶切60分钟；
(7)酶切后PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测：
酶切后的PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪拍摄电泳照片。菊花抗白色锈病品种‘早玉盘’序列可以被限制性内切酶NlaШ识别并切割为523bp和99bp的特异性条带(见图3)。
3.CAPS分子标记的应用：CAPS分子标记成功验证了菊花品种‘早玉盘’抗菊花白色锈病(图4)。
实施例3：
验证该分子标记为菊花白色锈病感病品种‘S20-4’的特异性分子标记。
具体方法如下：
1.菊花的培育：扦插菊花白色锈病感病品种‘S20-4’。
剪取菊花‘S20-4’茎段，每段10-12cm，扦插于营养土中，每日喷水2-3次，30天后移栽上盆进行常规养护管理。
2.CAPS分子标记的检测：
(1)提取菊花基因组DNA
采用CTAB方法提取菊花基因组DNA，具体方法如下：
①0.15g叶片于液氮保护下，充分研磨后迅速转移至2mL离心管中，加入65℃预热的2％β巯基乙醇-CTAB提取液700μL。于65℃水浴1小时，每隔10分钟轻柔振荡。
②室温冷却30分钟，加入氯仿/异戊醇(24：1)混合液700μL，充分振荡混匀，12000r，离心7分钟。
③取400μL上清液至新的1.5mL离心管中，加入800μL异丙醇(-20℃预冷)，置于-20℃下静置1小时。
④将上述混合物在12000r下离心7分钟，然后弃上清液。
⑤加入700μL 75％乙醇(-20℃预冷)洗涤DNA，12000r离心2分钟，弃上清。
⑥重复步骤⑤一次。室温晾干，加TE定容至50μL，-20℃保存。
(2)PCR扩增全长序列：
PCR反应体系：包括2×高保真Taq酶缓冲液5μL，DNA模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，去离子水2μL；
PCR反应条件：98℃预变性3分钟；98℃变性10秒，45℃退火30秒，72℃延伸3分钟30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；4℃保存；
(3)全长序列胶纯化回收并连接载体转入大肠杆菌
①利用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒纯化全长片段。，
②目的片段连接克隆载体后转化大肠杆菌感受态
(4)阳性质粒鉴定与测序：
挑取单菌落至含有卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养基中，200rpm，37℃孵育12小时。菌液浑浊后，进行PCR验证，引物为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。具体PCR反应体系及反应条件如下：
菌液PCR反应体系：包括2×Taq酶缓冲液5μL，菌液3μL，上游引物1μL，下游引物1μL；
菌液PCR反应条件：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；4℃保存；PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测
提取质粒参照质粒快速提取试剂盒的说明书，具体步骤如下：
①阳性菌液于2mL离心管中12000rpm离心1分钟，富集菌体，弃掉上清。
②加入缓冲溶液250μL，旋涡震荡，彻底悬浮菌体。
③加入裂解溶液250μL，轻柔混匀，室温静置4分钟。
④加入SDS裂解溶液350μL，轻柔混匀，13000rpm离心10分钟。
⑤小心吸取上清，加入吸附柱中，12000rpm离心1分钟，弃废液。
⑥加入500μL去蛋白液，12000rpm离心1分钟，弃废液。
⑦加入600μL漂洗液，12000rpm离心1分钟，弃废液。重复一次。空管13000rpm离心3分钟。
⑧将吸附柱放入新的离心管中，室温放置10分钟。在吸附膜中央加入40μL洗脱缓冲液，室温静置5分钟，12000rpm离心2分钟。-20℃保存备用。测序委托上海生工生物有限公司。
(5)用质粒PCR扩增所述分子标记原始序列
PCR反应体系：包括2×Taq酶缓冲液5μL，质粒模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，去离子水2μL；
PCR反应条件：94℃预变性5分钟；94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸45秒，35个循环；72℃延伸7分钟；4℃保存；
(6)限制性内切酶NlaШ酶切质粒PCR产物：
限制性内切酶NlaШ识别序列为CATG^；
酶切反应体系：PCR产物6μL，NlaШ限制性内切酶0.5μL，10×酶切缓冲液1.5μL，去离子水4μL；
酶切反应条件：37℃酶切60分钟；
(7)酶切后PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测：
酶切后的PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪拍摄电泳照片。菊花感白色锈病品种‘S20-4’序列无法被限制性内切酶NlaШ识别和切割，出现了643bp的特异性条带(图5)。
3.CAPS分子标记的应用：通过使用该CAPS分子标记，成功检验了菊花品种‘S20-4’确实为菊花白色锈病感病品种(图6)。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 沈阳农业大学
<120> 用于辨别菊花白色锈病抗性的CAPS分子标记及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaaaccac cttcagaaac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aactccggat gtgcttccat 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgaaaccac cttcagaaac 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcaaatcgcg tacattttc 19
<210> 5
<211> 2156
<212> DNA
<213> 菊花(Chrysanthemum morifolium)
<400> 5
atgaaaccac cttcagaaac cgggctgcca ccccccactc ctcgtaaaaa gatggtgaaa 60
caggtgacag gaaaacgcga tgacacccct ttgcatgcgg ccgctagagc ggggaacatt 120
cacacgatca taaatctttt gggtgattgt tactcagaag aagaatttat ttctttgctg 180
tcgaagcaga attatgcagg cgagacacct ttgtatgtgg cagcagaata tggttatgtt 240
gatttggtta gactcttgat agatcaatgt gatattgcta ctgctagcat taaagctaac 300
aacggttttg atgctcttca tattgctgct aaacaaggag atttaggtaa gatatcactt 360
ttgtctttta agtatattta tagggtgttt gtaattgctt atttatgatg atatctgctt 420
atttcttagc agattagttg agtttttaaa taactgctta tttgtatcta cttgttatta 480
agtagataca ctttaaaata aacagtttca agcacccctt aaattttatc aatactatta 540
ttatttagct gttttttaaa ctattttcgc tcctttggcg tgtagagata ttaaaagtgt 600
taatggaagc acatccggag ttatcaatga cggtggatat atcaaacacc acagctttgc 660
acaccgcggc aatgcaaggc aacattgagg tgatgaacta tctactagag atagagagta 720
gtttggcatc gatagcgaga agtaatggga aaacagcatt acattcggct tcaagaaatg 780
ggcatcttag agtggtgaaa gctcttttgg agaaggcacc agggatttca gcgaggaatg 840
ataagaaggg gcagaccgcc cttcacatgg ctgcgaaagg ccagaatcat gagttggttg 900
aggagttgat caaggtggat ccgtcgttga taaatatggc tgatgctaag ggtaacacgg 960
ctttgcatat agcaacacgt aaaggacgtg ttcaggtaaa aattcggttt tgagcatctt 1020
ggttaaatat agtgatgtag ttgcagtcag gaaaatatat gtaatatgca ttgtgcacat 1080
gctttaacat atattttacc cggggtaacc cattacccaa aaacatacat aatgtccatt 1140
tagggatgcc atatgcacta gtgttgtagt gcatatggag tctaggatgt caaatgtgac 1200
tcgctagtag gattgttagt ttcctagtct cacgcattag gtattgtact tttatgcaga 1260
ttgtaaagat gttactagct cgtagcgaaa ccaacacaag agccgtgaat aggtcgaatg 1320
agaccgcctt cgacacagct caaaaaatgg gccatcccca cattggaatc atcttacaag 1380
aacacggagt cccaagtgct cgggtcctaa aacctccaac gactccagct cgagagctca 1440
agcaaaccgt gagtgacata aaacacgagg tccaccacca attagaacac acacgtcaaa 1500
ctcgaagaag agtccaaggc attgcaaaac atctcaacaa aatgcacgcc gaaggcctca 1560
acaatgcaat aaattcaacg acggtcgttg ctgttttgat cgccaccgtg gcctttgcag 1620
caatctttac agtcccgggc caatatgccg atgacccaaa taacattccc gaagggtttt 1680
cgctaggtga ggcgaacgtg gcaccacaac cattatttat agtatttttt gtttttgact 1740
cagtggctct atttatttca ttagccgtgg tcgtggttca aacatctgtg gtggttatcg 1800
aaagtaaagc gaagaagcaa atgatggcca taatcaacaa gctaatgtgg ttagcttgtg 1860
tgcttatctc ggtggcattt ttggcccttg cgtttattgt ggttggggag catgagaaat 1920
ggctagcgat ttgtgtcacc attattggaa caacgataat ggtcacgact ttgggtttaa 1980
tgtgttactg ggttatcatg catcggattg aaagtaagaa tatgagaaat ttgagaaaga 2040
actcgttgac gggtagtgga agtaggtctc ggtcaaggtc tagatcatgg tcgatgtctg 2100
tactttcaga cacagatgca atgaatacgg agtttaagaa aatgtacgcg attgaa 2156
<210> 6
<211> 2267
<212> DNA
<213> 菊花(Chrysanthemum morifolium)
<400> 6
atgaaaccac cttcagaaac cgggctgcca ccccccactc ctcgtaaaaa gatggtgaaa 60
caggtgacag gaaaacgcga tgatacccct ttgcatacgg ctgctagagc ggggaacatt 120
cacacgatca taaatctttt gggtgattgt tactcagaag aagaatttat ttctttgctg 180
tcgaagcaga attatgcagg cgagacacct ttgtatgtgg cagcggaata tggttatgtt 240
gatttggtta gactcttgat agatcaatgt gatattgcta ctgctagcat taaagcaaac 300
aacggttttg atgctcttca tattgctgct aaacaaggag atttaggtaa gatatcactt 360
ttgtctttta agtatattta taggttgttt gaaattgctt atttatattg aaatctgctt 420
atttttttaa cagattagta gtttgagttt ttaaataact acttatttgt atcttgttat 480
ttttaagcag atacacttta agataagcag tttcaagcac tccttaaata atttatcaat 540
agtaacacta ttactattat ttaactgtct tttaaactga tttcgctcct ttaatttggc 600
gtatagagat attaaaagtg ttaatggaag cacatccgga gttatcaatg acggtggata 660
tatcaaacac cacggctttg cacaccgcgg ccatgcaagg caacattgag gtgatgaact 720
atctactaga gatagagagt agtttggcat ctatagcgag aagtaatggg aaaacagcat 780
tgcattcggc ctcaagaaat gggcatctta gagtggtgaa agctcttttg gagaaggcac 840
ccgggatttc agcgaggaat gataagaagg ggcagaccgc ccttcacatg gctgcgaaag 900
gccagaatca tgaggtggtt gaggagttga taaaagtgga tccgtcgttg ataaatatgg 960
ctgatgctaa gggtaacacg gctttgcata tagcaacacg taaaggacgt gttcaggtaa 1020
aaattcggtt ttgagcatct tgtaaaagta aagtaactcc cagtaccgtc ttccacgggt 1080
tatgggtccc aataccgtct tccacggtgt atgggggagg ttaagacgta gacaaccata 1140
cccctaccta aggtagagag gctgcttccg gttctaccaa aggtagaaaa ggacctccgg 1200
ccttgcgagg ggtgaggatc gaaccttgac ctctgtctcc agaggcaaag gtgttaacca 1260
cttgatccaa ccttgctcca gaggcaaggg ttttgagcat cttgtaaagt acttaaatgt 1320
attgatgtat tgttgcagtc tcacgcatta aatattgtac ttttatgcag attgtaaaga 1380
tgttactagc tcgcagcgaa accaacacga aagctgtgaa taggtcgaac gagactgcct 1440
tcgacacagc tcaaaaaatg ggtcatcccc acattggaat catcttacaa gaacacggag 1500
tcccaagtgc tcgggttcta aaacctccaa cgactccagc tcgagagctc aagcaaaccg 1560
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taaattcaac gacggttgtt gctgttttga tcgccaccgt ggcctttgca gcaatcttta 1740
cagtcccggg ccaatatgcc gatgacccaa ataacattcc cgaagggttt tcgctaggtg 1800
aggcgaacgt ggcaccacaa cctttattta tagtattttt tgttttcgac tcagtggctc 1860
tatttatttc attagccgtg gtcgtggttc aaacatctgt ggtggttatc gaaagtaaag 1920
cgaagaagca aatgatggcc ataatcaaca agctaatgtg gttagcttgt gtgcttatct 1980
cggtggcatt tttggccctt gcgtttattg tggttgggga gcatgagaaa tggctagcga 2040
tttgtgtcac cattattgga acaacgataa tggtcacgac tttgggttta atgtgttact 2100
ggattatcat gcatcggatt gaaagtaaga atatgagaaa tttgagaaag aactcgttga 2160
cgggtagtgg aagtaggtct cggtcaaggt ctagatcatg gtcgatgtct gtactttcgg 2220
acacagatgc tatgaatacg gagtttaaga aaatgtacgc gattgaa 2267
