具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种通过AcZIP家族基因差异性表达判断槟榔幼苗缺铁状态的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明实施例提供的快速检测槟榔缺铁的实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括一组基于ZIP家族的检测引物以及内参引物。

本发明实施例提供的基于ZIP家族的检测引物，包括特异性引物ZIP1和特异性引物ZIP2；其中，所述特异性引物ZIP1的核苷酸序列SEQ ID NO：1所示，所述特异性引物ZIP2的核苷酸序列SEQ ID NO：2所示；所述内参引物的核苷酸序列SEQ ID NO：3所示。

如图1所示，本发明实施例提供的通过AcZIP家族基因差异性表达判断槟榔幼苗缺铁状态的方法包括以下步骤：

S101，实验基地进行槟榔缺铁处理：以Hoagland为配方，采用水培的方法对一叶期进行适应性培养后的槟榔幼苗进行缺铁处理；

S102，样品采集：对出现黄化现象的槟榔幼苗的叶片以及主根进行收集，用75％的乙醇擦拭干净，用液氮冻干；

S103，ZIP家族分析：根据已有的植物ZIP基因设计引物进行PCR扩增，两组ZIP基因简单命名为ZIP1和ZIP2；

S104，引物设计：根据ZIP基因的序列，应用primer5软件设计每个基因的特异性引物；

S105，引物的特异性验证：以提取的正常样品的cDNA为模板，进行PCR扩增，测序，与核酸序列进行比较，检测该引物的特异性；

S106，实时荧光定量PCR：采用荧光定量PCR仪对cDNA模板进行荧光定量PCR检测以及熔解曲线分析，再一次验证扩增的特异性。

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步描述。

本发明开发量一个基于ZIP家族的实时荧光定量的槟榔缺铁的诊断试剂盒，只需提供样品，按照所提供的方法进行检测，即可确定槟榔幼苗是否缺铁，为后续预防提供依据。

本发明的目的是提供了一种通过AcZIP差异性表达来判断槟榔幼苗缺铁状态的试剂盒及应用，该试剂盒包含了一组AcZIP表达水平检测引物，一对槟榔内参基因。该试剂盒通过槟榔对缺铁和缺锌的响应，引起的槟榔相关基因的差异表达，以此来确定槟榔缺铁，具有特异性强、易于操作、结果可靠的特征，具有极大的潜在应用价值。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供了一种快速检测槟榔缺铁的实时荧光定量试剂盒，所述试剂盒包括一组基于ZIP家族的检测引物、以及内参引物。

本发明的完整步骤：

1、实验基地进行槟榔缺铁处理

在实验基地以Hoagland为配方，采用水培的方法对一叶期进行适应性培养后的槟榔幼苗进行缺铁处理，每隔一周时间进行培养液的更换，直到槟榔幼苗出现明显的表型。如图2-3所示，缺铁的槟榔幼苗的新叶出现叶片全部黄化。

2、样品的采集

对出现黄化现象的槟榔幼苗的叶片以及主根进行收集，用75％的乙醇擦拭干净，用液氮冻干，用天根多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取样品的RNA，cDNA合成根据TaKaRa公司反转录试剂盒操作进行，-20℃冻存。

3、ZIP家族分析

ZIP家族(PF02535)在植物铁转运中起到重要作用。根据已有的植物ZIP基因设计引物进行PCR扩增，两组ZIP基因简单命名为ZIP1和ZIP2。

4、引物设计

根据ZIP基因的序列，应用primer5软件设计每个基因的特异性引物。

ZIP1-F：TGAGCCCTGGTTCTACCTCACTCGC

ZIP1-R：GCCGCAAAGGACTTGGAGAAGACGA

ZIP2-F：CGTGCCTCAAGGACAACCCG

ZIP2-R：CGATGCCCAACTCCAAGACC

内参引物Actin-F：GTATCGTGCTTGATTATGG；

Actin-R：GCTACTCTTGGCTGTCTCC

其中，所述引物对中的两条单链DNA既可分贝单独包装，也可等摩尔混合包装。

5、引物的特异性验证

以提取的正常样品的cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增的目的条带的大小分别为229bp和100bp。回收PCR产物，连接T载，寄送至生工生物工程(上海)股份有限公司，进行测序，与下列的核酸序列进行比较，以检测该引物的特异性。

ZIP1的序列：

ATGTCTTTCTTTGAGGATCTTGAGCCCTGGTTCTACCTCACTCGCTTCCGCGACCAGCTGAGCGTTTTCTCTGAAACCATGTCAGCATCGATGGCGACGGCGAGCTGCACCGACGACGCGGCGGACGAGTGCCGCGATGACGCGGCGGCGCTGCGGCTGAAAATGGTAGCGATAGTGACGATCCTTGTGGCGGGGGTGACCGGGGTGACGATCCCCCTGGTGGGGCGCAAGCGGCGGTTACTGCGCACCGACGGCGGCCTCTTCGTCTTCTCCAAGTCCTTTGCGGCCGGCGTCATCCTTGCAACGGGGTTCGTCCACATGCTCCACGACGCCCAGTCGTCGCTGACGGACCCCTGCCTCCCGGAGTCGCCATGGCGGCGATTCCCGTTCTCCGGCTTCGTGGCAATGATGGCGGCGCTGGGGACCCTCTTGGTCGACTTCGTCGGGACTCAGTTCTACGAGCGGAAGCACCGGGAAGAGGCCAGGGGGGTCAAGGCGGCCACCGTGGCGGCGGTTGAGGCGGCGACAGCGGCCGAGGAGGATATCACCGTCATCTCGGTCTCGCCGGAGCCGGAAGAGGCGGCGGACGGCGTCAAGAGCCCGATGCACATTGTGGGGATGCACGCCCACGCGGCGGCGCACCGGCATAGCCACCCCTACGAGCACGGGGCGTGCGACGGCCCCGCGCTGCGGGAACGCGTCCCTGGCCACGCCCACGAGGACGAGGGCGTGGGCGAGGTCCCTTCTCATGTGCGCCACGTGGTCGTATCCCAGATACTGGAACTAGGAATCGTGTCCCACTCGGTGATCATCGGGTTGTCACTCGGTGTCTCCCGGAGTCCGTGCACCATAAGGCCACTCATTGCAGCCTTATCCTTCCACCAGTTCTTCGAAGGCTTCGCATTGGGTGGATGCATCTCCCAGGCACAGTTCAGGAACTTGTCGGCCGCGCTGATGGCGTGCTTCTTTGCGATCACGACGCCGACCGGCATCGGCGTCGGAGCGGGTGTTGCGTCGTTCTACAACGCCAACAGCCCGAGGGCGCTGGTGGTGGAGGGGATACTGGACTCGATATCCGCCGGCATTCTCATCTACATGGCATTGGTTGATCTAATCGCGGCGGATTTTCTTAGCAGGAGGATGAGCTGCAATGTTAGGCTTCAGGTGGCGTCTTACATGGCCCTTTTTCTTGGCGCTGGTTCCATGTCCGCCCTCGCAGTCTGGGCTTGA

ZIP2的序列：

ATGAGACCCCTGGCCCTTCTCTTCCTCCTCTCCCTCCTCCTATTGCCTCTTTTCACCGTCGTCGCCGGAGACTGCGACTGCTCCGCCGACGAGGAGGACCGCAGCAAATCCAAAGCCCGGCCGCTCAAAATCGCCGCGTTCTTCTCCATCCTCGTCTGCGGCGCCATTGGCGTCTGCCTCCCACTCTTGAGCAAATACATCCCCGCTCTCAGTCCCGAGAAGGATATCTTCTTCGTGATCAAAGCCTTCGCCGCCGGCGTCATACTCGCCACGGGATTCATCCACATACTTCCGGACGCTTTCGACAACCTGACATCGCCGTGCCTCAAGGACAACCCGTGGGGGAAGTTTCCGTTCGCTGGATTCGGGGCCATGCTTGGTGCCCTCGGGACGCTGATGGTGGACGCTGTGGCGACGAGCTATTTCAGCCGGTCGGTGACGGCGGCGATCGATGGTGATGACAAAGGGGATGAGGGGGTGACTGCACCTGCGGGAGAGTATGTGGTCCACGTCCACGCCACGCACGGGCATGCTCATGGGCCCTCCACCGATGGCTCGGAGAAGCTCGTCCGCCATCGCGTCATCTCCCAGGTCTTGGAGTTGGGCATCGTGGTCCATTCGGTAATAATTGGGATATCTCTGGGTGCATCGGATAGTCCCTCTACCATAAGGCCCCTGGTAGCAGCTTTGAGCTTTCATCAATTCTTTGAGGGCATGGGGCTTGGGGGATGTATTGCTCAGGCAAATTTTAAAATCAAGTCAACGGCAACAATGATCCTCTTCTTCTCCCTCACCACTCCCGTTGGAATAGCAATCGGTTTTGGAATATCATCGGTTTACAATGAGAATAGCCCCACTGCTCTAATTGTCGAAGGTTGTCTCAATTCAGTAGCTGCTGGAATTTTAATCTACATGGCTCTTGTTGATCTTCTAGCTGAAGATTTTATGAACCCAAAGGTACAGAGCAGGGGAAAGCTACAATTGGGGATAAATGTCTCCCTCCTTATAGGAGCAGGCTTGATGTCACTTCTTGCTAAATGGGCATAG

普通的PCR反应体系(总反应体系25μL)其中具体体系如下：

2*Vazyme LAMP Master Mix：12.5μL

ZIP-F：1μL

ZIP-R：1μL

cDNA：1μL

ddH₂O：9.5μL

普通PCR反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃补充延伸10min。PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳检测。

6、实时荧光定量PCR

利用iTaq^TM Universal SYBR Green Supermix(Bio-RAD)试剂盒及本发明ZIP基因检测引物、内参引物，采用荧光定量PCR仪对cDNA模板进行荧光定量PCR检测。荧光定量PCR结束后对结果进行熔解曲线分析，再一次验证扩增的特异性。

荧光定量体系如下(总反应体系20μL)：

LightCycler SYBR Green I Master(2*)：10μL

上游引物-F：0.5μL

下游引物-R：0.5μL

模板：1μL

ddH₂O：加水至总体积20μL

所述实时荧光定量PCR的过程中，扩增程序为：95℃预变性15min；95℃变性10s；60℃退火30s；共40个循环。PCR完成后按0.1℃s^-1升温速率从72℃上升至95℃进行溶解曲线的分析验证。采用实时荧光定量PCR仪进行。循环结束后，采用仪器自带的分析软件，分析扩增结果。

每个qPCR反应重复三次。记录qPCR反应体系的Ct值。根据2^(-ΔΔCt)计算基因在不同处理下的相对表达量，可以看出ZIP1在叶片中和根中的表达量没有显著差异，而ZIP2在新叶中表达量急剧下降，在根中没有明显变化。

本发明所用RNA提取方法、反转录方法以及所用试剂皆可在确认原理的情况下进行替换。

本发明通过结构域的差异获得ZIP家族基因，并通过实时荧光定量PCR验证，获得可以判断槟榔处于缺铁状态的AcZIP基因。引物凝胶成像以及熔解曲线说明了引物的特异性，而实时荧光定量PCR结果提供了依据。

本发明试剂盒以天根多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取样品的RNA，cDNA合成根据TaKaRa公司反转录试剂盒操作进行，利用iTaq^TM Universal SYBR Green Supermix(Bio-RAD)试剂盒及本发明ZIP基因检测引物、内参引物，采用荧光定量PCR仪对cDNA模板进行荧光定量PCR检测。

本发明还提供所述ZIP基因的实时荧光定量PCR检测试剂盒在检测槟榔是缺铁还是缺锌中的应用，所述应用的方法为提取待测样品的基因组RNA，逆转录为cDNA为模板，使用试剂盒中的ZIP基因检测引物与内参引物进行RT-qPCR反应，以正常样品为对照，按照2^(-ΔΔCt)计算相对丰度，得到基因的相对表达量。根据AcZIP家族的相对表达量，若ZIP1在叶片中和根中的表达量没有显著差异，而ZIP2在新叶中表达量急剧下降，在根中没有明显变化，则说明植株受到缺铁胁迫。

本发明中，提取待测样品的RNA以及反转的方法不受限制，可以采用任何已知的提取方法或者试剂盒进行。

本发明所述的样品包括槟榔叶片和槟榔主根。

本实验利用缺铁处理引起基因表达量的差异，根据差异基因在不同处理的表达量的趋势变化不同，得到检测槟榔缺铁的检测引物；试剂盒内的检测引物具有很高的特异性，只需提供正常的样品以及出现黄化的样品，然后就通过实时荧光定量PCR技术判断槟榔幼苗是否缺铁的情况，以便对后续处理提供依据。

在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上；术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”、“前端”、“后端”、“头部”、“尾部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 海南大学

<120> 检测槟榔缺铁的试剂盒及判断槟榔幼苗缺铁状态的方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgagccctgg ttctacctca ctcgcgccgc aaaggacttg gagaagacga 50

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgtgcctcaa ggacaacccg cgatgcccaa ctccaagacc 40

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtatcgtgct tgattatggg ctactcttgg ctgtctcc 38

<210> 4

<211> 1230

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgtctttct ttgaggatct tgagccctgg ttctacctca ctcgcttccg cgaccagctg 60

agcgttttct ctgaaaccat gtcagcatcg atggcgacgg cgagctgcac cgacgacgcg 120

gcggacgagt gccgcgatga cgcggcggcg ctgcggctga aaatggtagc gatagtgacg 180

atccttgtgg cgggggtgac cggggtgacg atccccctgg tggggcgcaa gcggcggtta 240

ctgcgcaccg acggcggcct cttcgtcttc tccaagtcct ttgcggccgg cgtcatcctt 300

gcaacggggt tcgtccacat gctccacgac gcccagtcgt cgctgacgga cccctgcctc 360

ccggagtcgc catggcggcg attcccgttc tccggcttcg tggcaatgat ggcggcgctg 420

gggaccctct tggtcgactt cgtcgggact cagttctacg agcggaagca ccgggaagag 480

gccagggggg tcaaggcggc caccgtggcg gcggttgagg cggcgacagc ggccgaggag 540

gatatcaccg tcatctcggt ctcgccggag ccggaagagg cggcggacgg cgtcaagagc 600

ccgatgcaca ttgtggggat gcacgcccac gcggcggcgc accggcatag ccacccctac 660

gagcacgggg cgtgcgacgg ccccgcgctg cgggaacgcg tccctggcca cgcccacgag 720

gacgagggcg tgggcgaggt cccttctcat gtgcgccacg tggtcgtatc ccagatactg 780

gaactaggaa tcgtgtccca ctcggtgatc atcgggttgt cactcggtgt ctcccggagt 840

ccgtgcacca taaggccact cattgcagcc ttatccttcc accagttctt cgaaggcttc 900

gcattgggtg gatgcatctc ccaggcacag ttcaggaact tgtcggccgc gctgatggcg 960

tgcttctttg cgatcacgac gccgaccggc atcggcgtcg gagcgggtgt tgcgtcgttc 1020

tacaacgcca acagcccgag ggcgctggtg gtggagggga tactggactc gatatccgcc 1080

ggcattctca tctacatggc attggttgat ctaatcgcgg cggattttct tagcaggagg 1140

atgagctgca atgttaggct tcaggtggcg tcttacatgg ccctttttct tggcgctggt 1200

tccatgtccg ccctcgcagt ctgggcttga 1230

<210> 5

<211> 1047

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgagacccc tggcccttct cttcctcctc tccctcctcc tattgcctct tttcaccgtc 60

gtcgccggag actgcgactg ctccgccgac gaggaggacc gcagcaaatc caaagcccgg 120

ccgctcaaaa tcgccgcgtt cttctccatc ctcgtctgcg gcgccattgg cgtctgcctc 180

ccactcttga gcaaatacat ccccgctctc agtcccgaga aggatatctt cttcgtgatc 240

aaagccttcg ccgccggcgt catactcgcc acgggattca tccacatact tccggacgct 300

ttcgacaacc tgacatcgcc gtgcctcaag gacaacccgt gggggaagtt tccgttcgct 360

ggattcgggg ccatgcttgg tgccctcggg acgctgatgg tggacgctgt ggcgacgagc 420

tatttcagcc ggtcggtgac ggcggcgatc gatggtgatg acaaagggga tgagggggtg 480

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ttgggcatcg tggtccattc ggtaataatt gggatatctc tgggtgcatc ggatagtccc 660

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