实时荧光定量pcr检测试剂盒、判断槟榔幼苗缺锌状态的方法
技术领域
本发明属于生物
技术领域
，尤其涉及一种实时荧光定量PCR检测试剂盒、判断槟榔幼苗缺锌状态的方法，尤其涉及一种通过AcZIP家族基因差异性表达判断槟榔幼苗缺锌状态的方法。背景技术
目前，锌(Zn)是植物生长所必需的微量元素，对植物的生长和代谢具有不可替代的作用。锌离子主要作为蛋白质的复合物和多种蛋白质的激活剂存在，参与多种生命活动，包括碳水化合物代谢、蛋白质合成、细胞膜完整性的维持、生长素合成的调节和花粉的形成。植物还需要调控和维持耐环境胁迫所需的基因表达，如高光强和高温。如果过量使用，可能会有潜在的毒性。过量的Zn则因其不受调节的高亲和力而与生物分子中的硫、氮和含氧官能团结合。
荧光定量PCR是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新的核酸定量实验技术，它的原理是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程，通过对产物量的实时分析，最终能够对模板的初始浓度，核酸种类、基因突变类型等信息作出准确的判定。目前，荧光定量PCR在生物学研究及个体化医学基因检测领域有着广泛的应用。
ZIP是一个在植物锌的转运中起重要作用的基因，响应植物缺锌，在水稻、玉米、小麦等植物中都得到验证。ZIP基因家族在缺锌的情况下可能会出现差异表达的现象，但现有技术中关于通过ZIP基因家族差异性表达来判断槟榔幼苗缺锌状态的方法尚未见报道。因此，亟需一种可以通过差异基因的表达来判断槟榔幼苗是否处于缺锌状态的方法。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术中没有详细的通过分子水平来检测槟榔缺锌的状态，多以生理生化指标来检测槟榔是否处于缺锌的状态，并且关于通过AcZIP基因家族差异性表达来判断槟榔幼苗缺锌状态的方法尚未见报道。
解决以上问题及缺陷的难度为：需要通过多个方面来验证槟榔ZIP基因会响应槟榔的缺锌，之后通过响应的程度挑选变化程度相对显著的基因，并且可以与槟榔其他金属离子的变化趋势不一致，来区分特异响应槟榔缺锌的ZIP基因。
解决以上问题及缺陷的意义为：通过分子水平上ZIP基因的响应情况，反应了槟榔的缺锌的状态，更为准确的说明了槟榔在缺锌情况下的分子响应。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种通实时荧光定量PCR检测试剂盒、判断槟榔幼苗缺锌状态的方法，尤其涉及一种通过荧光定量PCR技术，利用在缺锌中差异表达的基因，来检测槟榔差异基因表达水平的试剂盒及应用。
本发明是这样实现的，一种通过AcZIP家族基因差异性表达判断槟榔幼苗缺锌状态的方法，所述通过AcZIP家族基因差异性表达判断槟榔幼苗缺锌状态的方法包括以下步骤：
步骤一，实验基地进行槟榔缺锌的处理；
步骤二，进行样品的采集；
步骤三，进行ZIP家族分析；
步骤四，进行引物设计；
步骤五，进行引物的特异性验证；
步骤六，进行实时荧光定量PCR检测。
进一步，步骤一中，所述实验基地进行槟榔缺锌的处理，包括：
在实验基地以Hoagland为配方，采用水培的方法对一叶期进行适应性培养后的槟榔幼苗进行缺铁和缺锌的处理，每隔一周时间进行培养液的更换，直到槟榔幼苗出现明显的表型；其中，缺锌的槟榔幼苗的新叶呈网格状的黄化现象。
进一步，步骤二中，所述样品的采集，包括：
对出现黄化现象的槟榔幼苗的叶片以及主根进行收集，用75％的乙醇擦拭干净，用液氮冻干，用天根多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取样品的RNA，cDNA合成根据反转录试剂盒操作进行，-20℃冻存。
进一步，步骤三中，所述ZIP家族分析，包括：
ZIP家族PF02535在植物铁和锌的转运中起到重要作用；选取在转录组中差异表达的两组ZIP基因来区分缺锌，四组ZIP基因简单命名为ZIP1和ZIP2。
进一步，步骤四中，所述引物设计，包括：
根据ZIP基因的序列，应用primer5软件设计每个基因的特异性引物；其中，所述引物ZIP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述引物ZIP2核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述内参引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述引物对中的两条单链DNA既可分贝单独包装，也可等摩尔混合包装。
进一步，步骤五中，所述引物的特异性验证，包括：
以提取的正常样品的cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增的目的条带的大小分别为267bp和291bp；回收PCR产物，连接T载，进行测序，与ZIP1和ZIP2的核酸序列进行比较，以检测该引物的特异性；其中，所述ZIP1的核酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述ZIP2的核酸序列如SEQ ID NO：5所示。
其中，所述PCR反应体系，包括：
总反应体系：25μL；2*Vazyme LAMP Master Mix：12.5μL；ZIP-F：1μL；ZIP-R：1μL；cDNA：1μL；ddH2O：9.5μL。
所述PCR反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃补充延伸10min；PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳检测。
进一步，步骤六中，所述实时荧光定量PCR检测，包括：
利用iTaqTM Universal SYBR Green Supermix，即Bio-RAD试剂盒以及ZIP基因检测引物、内参引物，采用荧光定量PCR仪对cDNA模板进行荧光定量PCR检测；荧光定量PCR结束后对结果进行熔解曲线分析，再次验证扩增的特异性。
其中，所述荧光定量体系如下：
总反应体系20μL；2*LightCycler SYBR Green I Master：10μL；上游引物-F：0.5μL；下游引物-R：0.5μL；模板：1μL；ddH2O：加水至总体积20μL。
所述实时荧光定量PCR的过程中，扩增程序为：95℃预变性15min；95℃变性10s；60℃退火30s；共40个循环；PCR完成后按0.1℃s-1升温速率从72℃上升至95℃进行溶解曲线的分析验证；采用实时荧光定量PCR仪进行；循环结束后，采用仪器自带的分析软件，分析扩增结果。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述通过AcZIP家族基因差异性表达判断槟榔幼苗缺锌状态的方法的ZIP基因的实时荧光定量PCR检测试剂盒，所述ZIP基因的实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括一组AcZIP表达水平检测引物和一对槟榔内参基因。
本发明的另一目的在于提供一种所述ZIP基因的实时荧光定量PCR检测试剂盒在检测槟榔是缺铁还是缺锌中的应用，所述应用方法，包括：
提取待测样品的基因组RNA，逆转录为cDNA为模板，使用试剂盒中的ZIP基因检测引物与内参引物进行RT-qPCR反应，以正常样品为对照，按照2^(-ΔΔCt)计算相对丰度，得到基因的相对表达量；
根据AcZIP家族的相对表达量，若ZIP1在新叶中表达量没有显著变化，在根中表达量显著增加，ZIP2在新叶中表达量显著上调，在根中没有显著变化，说明植株受到缺锌胁迫。
进一步，所述待测样品包括槟榔叶片和槟榔主根。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的通过AcZIP家族基因差异性表达判断槟榔幼苗缺锌状态的方法，利用缺锌的处理引起基因表达量的差异，根据差异基因在不同处理的表达量的趋势变化不同，得到检测槟榔缺锌的检测引物；试剂盒内的检测引物具有很高的特异性，只需提供正常的样品以及出现黄化的样品，然后就通过实时荧光定量PCR技术判断槟榔幼苗是否处于缺锌状态，以便对后续处理提供依据。
本发明还开发出一个基于ZIP家族的实时荧光定量的槟榔缺锌的诊断试剂盒，只需提供样品，按照所提供的方法进行检测，即可确定槟榔幼苗缺铁和缺锌状态的原因，为后续预防提供依据。
本发明通过结构域的差异获得ZIP家族基因，并通过实时荧光定量PCR验证，获得可以判断槟榔缺锌的状态的AcZIP基因。本发明通过引物凝胶成像以及熔解曲线说明了引物的特异性，而实时荧光定量PCR结果的相互印证说明了结果的可靠性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的通过AcZIP家族基因差异性表达判断槟榔幼苗缺锌状态的方法流程图。
图2是本发明实施例提供的利用引物进行PCR验证引物特异性的凝胶成像验证图。
图3(a)和图3(b)是本发明实施例提供的利用荧光定量PCR方法检测槟榔基因相对表达量的结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种通过AcZIP家族基因差异性表达判断槟榔幼苗缺锌状态的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的通过AcZIP家族基因差异性表达判断槟榔幼苗缺锌状态的方法包括以下步骤：
S101，实验基地进行槟榔缺锌的处理；
S102，进行样品的采集；
S103，进行ZIP家族分析；
S104，进行引物设计；
S105，进行引物的特异性验证；
S106，进行实时荧光定量PCR检测。
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
本发明开发出一个基于ZIP家族的实时荧光定量的槟榔缺锌的诊断试剂盒，只需提供样品，按照所提供的方法进行检测，即可确定槟榔幼苗缺铁和缺锌状态的原因，为后续预防提供依据。
本发明的目的是提供了一种通过AcZIP差异性表达来判断槟榔幼苗缺锌的状态的试剂盒及应用，该试剂盒包含了一组AcZIP表达水平检测引物，一对槟榔内参基因。该试剂盒通过槟榔对缺锌的响应，引起的槟榔相关基因的差异表达，以此来确定槟榔是否缺锌，具有特异性强、易于操作、结果可靠的特征，具有极大的潜在应用价值。
本发明提供了一种快速检测槟榔缺锌的实时荧光定量试剂盒，所述试剂盒包括一组基于ZIP家族的检测引物、以及内参引物。
本发明的完整步骤：
1、实验基地进行槟榔缺锌的处理
在实验基地以Hoagland为配方，采用水培的方法对一叶期进行适应性培养后的槟榔幼苗进行缺铁和缺锌的处理，每隔一周时间进行培养液的更换，直到槟榔幼苗出现明显的表型。缺锌的槟榔幼苗的新叶呈网格状的黄化现象。
2、样品的采集
对出现黄化现象的槟榔幼苗的叶片以及主根进行收集，用75％的乙醇擦拭干净，用液氮冻干，用天根多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取样品的RNA，cDNA合成根据TaKaRa公司反转录试剂盒操作进行，-20℃冻存。
3、ZIP家族分析
ZIP家族(PF02535)在植物铁和锌的转运中起到重要作用。选取在转录组中差异表达的两组ZIP基因来区分缺锌(结果如图2-3所示)，四组ZIP基因简单命名为ZIP1和ZIP2。
4、引物设计
根据ZIP基因的序列，应用primer5软件设计每个基因的特异性引物。
ZIP1-F：ATAGCCATTGCTTCGATTCTGACG
ZIP1-R：CGGCGAACGGGAAGTTATGC
ZIP2-F：CTGTCCTTCCACCAGTTC
ZIP2-R：CAAAGAAGCACGCCATCA
内参引物：Actin-F：GTATCGTGCTTGATTATGG；
Actin-R：GCTACTCTTGGCTGTCTCC
其中，所述引物对中的两条单链DNA既可分贝单独包装，也可等摩尔混合包装。
5、引物的特异性验证
以提取的正常样品的cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增的目的条带的大小分别为267bp和291bp。回收PCR产物，连接T载，寄送至生工生物工程(上海)股份有限公司，进行测序，与下列的核酸序列进行比较，以检测该引物的特异性。
ZIP1的序列：
ATGAAGCCTCTTTTTCTCCTCTCCTCCATCTTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCCTCTCCATGTTCTAGCAGACTGCGAGTGCACCAGCAACCCCGAAGGCCTCGACACACCGAAGGCTCTAAAGCTGAAGTTTATAGCCATTGCTTCGATTCTGACGGCGGGTGCGATTGGAGTCCTCCTTCCGATCCTCGGGAGGTCGGTCGCAGCCCTCCGGCCGGAGAACGATGTGTTCTTCGTAATCAAGACCTTTGCGGCCGGTGTCATACTTGCGACCGGCCTGATTCACATCCTCCCGGCCGCCTTCGAGAGCTTGACATCTCCTTGTCTAAAGGATGATCCATGGCATAACTTCCCGTTCGCCGGCTTTGTGGCCATGCTGTCGGCCATCGGGACGATGATGGTGGACTCGTTTGCCACCAGCTACTATAGAAGGTCTCACTTCAGCAAGGCGCGGCCTGTGGAAGGAGACGAGGGGGGTATCGGGGATGAGGAGAACTCGGTAGGCCATGCTGACCACGTGCATGTCCACACGCACGCCACCCATGGCCACGCGCATGGCTCGGTGCCGGTCTCGCCGGAGGACGCCTCCCTTGCTGAAAGAATCCGGCATCGGATTATTTCCCAAGTTTTGGAGTTGGGCATTGTAGTACATTCTCTGGTTATTGGTATTTCTCTGGGTGCTTCTGAAAGGCCCTCCACCATAAGGCCTTTGCTGGGAGCCCTGAGTTTCCATCAATTCTTTGAAGGTATAGGACTTGGTGGATGCATAGTGCAGGCAAACTTTAGAGCTAAGGCTACGGTGATCATGGCAGTCTTTTTCTCTCTCACAGCTCCAATTGGCATTGCATTAGGGATTGCAATATCATCAAGCTATGACGAAAATAGCGCAATTGCCCTTATCATTGAGGGTATTTTCAATGCTGCCTCTGCTGGAATTCTAATTTATATGGCTCTCGTTGATCTCTTGGCAGCTGATTTAGCCAACCCTAAGATACAAAATAATGGGAGGCTTCAACTAAGAACACATCTTGCCCTTCTTCTTGGTGCAGCTTTAATGTCCATTCTTGCCAAATGGGCTTAG
ZIP2的序列：
ATGGTGGCGGGCGATGGAGAATGCCGTGACGACGAGGCTGCGATACCCTTGAAACTGGCCGCAATCGCCGCGATCCTCGTCGCCAGCATAGCCGGTGTGGCGATCCCGCTCGCCGGGAGACGGCGGCCGTTCCTCCTCCCCGACGGTGGCGGGTTCCTCTTCGTCAAGGCCTTTGGAGCGGGCTTGATCCTGGCGACGGGATTCGTCCACATGCTCCCCGAGGCGGCGGAGTCGCTGGCGGACGCCGCCATGTCGGCGCGGGCGTGGCCTGAGTTCCCATTCGCGGGCTTTGCGGCGATATATGGTGGCCGCCCTCGCTACGTTCGTGCTGGACTTCGTCGGAACGACGTTCTACGAGCGGGAGCACGGAACGGAGGAGGGAAGCAGGAGGCGAGGGTTTGGGTCCGGTCCCCGGGGAGTGGCGAGTCAGGCTTGTCCTTGGGGATATCACAAAACCGATGCACGATTAGGCCCCTGAAATCTGCCCTGTCCTTCCACCAGTTCTTCGAGGGTTTTGCGCTGGGGGGATACATCTCTCAGGCTCAATTCAGCAGTCTCAAAGAAACGGTGATGGCGTGCTTCTTTGGCCTTGACAACACCTGGAGGGATCGGCCTGGGGCTCTCAGTGGCATCATTTTATGA
普通的PCR反应体系(总反应体系25μL)其中具体体系如下：
2*Vazyme LAMP Master Mix：12.5μL
ZIP-F：1μL
ZIP-R：1μL
cDNA：1μL
ddH2O：9.5μL
普通PCR反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃补充延伸10min。PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳检测。
6、实时荧光定量PCR
利用iTaqTM Universal SYBR Green Supermix(Bio-RAD)试剂盒及本发明ZIP基因检测引物、内参引物，采用荧光定量PCR仪对cDNA模板进行荧光定量PCR检测。荧光定量PCR结束后对结果进行熔解曲线分析，再一次验证扩增的特异性。
荧光定量体系如下(总反应体系20μL)：
LightCycler SYBR Green I Master(2*)：10μL
上游引物-F：0.5μL
下游引物-R：0.5μL
模板：1μL
ddH2O：加水至总体积20μL
所述实时荧光定量PCR的过程中，扩增程序为：95℃预变性15min；95℃变性10s；60℃退火30s；共40个循环。PCR完成后按0.1℃s-1升温速率从72℃上升至95℃进行溶解曲线的分析验证。采用实时荧光定量PCR仪进行。循环结束后，采用仪器自带的分析软件，分析扩增结果。
每个qPCR反应重复三次。记录qPCR反应体系的Ct值。根据2^(-ΔΔCt)计算基因在不同处理下的相对表达量，可以看出ZIP1在叶片中几乎不表达，在缺锌的根中表达量显著增加，ZIP1在新叶中表达量没有显著变化，在根中表达量显著增加，ZIP2在新叶中表达量显著上调，在根中没有显著变化。
本发明所用RNA提取方法、反转录方法以及所用试剂皆可在确认原理的情况下进行替换。
本发明通过结构域的差异获得ZIP家族基因，并通过实时荧光定量PCR验证，获得可以判断槟榔缺锌的状态的AcZIP基因。引物凝胶成像以及熔解曲线说明了引物的特异性，而实时荧光定量PCR结果的相互印证说明了结果的可靠性。
本发明试剂盒以天根多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取样品的RNA，cDNA合成根据TaKaRa公司反转录试剂盒操作进行，利用iTaqTM Universal SYBR Green Supermix(Bio-RAD)试剂盒及本发明ZIP基因检测引物、内参引物，采用荧光定量PCR仪对cDNA模板进行荧光定量PCR检测。
本发明还提供所述ZIP基因的实时荧光定量PCR检测试剂盒在检测槟榔是缺铁还是缺锌中的应用，所述应用的方法为提取待测样品的基因组RNA，逆转录为cDNA为模板，使用试剂盒中的ZIP基因检测引物与内参引物进行RT-qPCR反应，以正常样品为对照，按照2^(-ΔΔCt)计算相对丰度，得到基因的相对表达量。根据AcZIP家族的相对表达量，若ZIP1在新叶中表达量没有显著变化，在根中表达量显著增加，ZIP2在新叶中表达量显著上调，在根中没有显著变化，说明植株受到缺锌胁迫。
本发明中，提取待测样品的RNA以及反转的方法不受限制，可以采用任何已知的提取方法或者试剂盒进行。
本发明所述的样品包括槟榔叶片和槟榔主根。
本实验利用缺锌的处理引起基因表达量的差异，根据差异基因在不同处理的表达量的趋势变化不同，得到检测槟榔缺锌的检测引物；试剂盒内的检测引物具有很高的特异性，只需提供正常的样品以及出现黄化的样品，然后就通过实时荧光定量PCR技术判断槟榔幼苗是否处于缺锌状态，以便对后续处理提供依据。
在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上；术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”、“前端”、“后端”、“头部”、“尾部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 海南大学
<120> 实时荧光定量PCR检测试剂盒、判断槟榔幼苗缺锌状态的方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atagccattg cttcgattct gacgcggcga acgggaagtt atgc 44
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgtccttcc accagttcca aagaagcacg ccatca 36
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtatcgtgct tgattatggg ctactcttgg ctgtctcc 38
<210> 4
<211> 1080
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgaagcctc tttttctcct ctcctccatc ttcctcctcc tcctcctcct ccctctccat 60
gttctagcag actgcgagtg caccagcaac cccgaaggcc tcgacacacc gaaggctcta 120
aagctgaagt ttatagccat tgcttcgatt ctgacggcgg gtgcgattgg agtcctcctt 180
ccgatcctcg ggaggtcggt cgcagccctc cggccggaga acgatgtgtt cttcgtaatc 240
aagacctttg cggccggtgt catacttgcg accggcctga ttcacatcct cccggccgcc 300
ttcgagagct tgacatctcc ttgtctaaag gatgatccat ggcataactt cccgttcgcc 360
ggctttgtgg ccatgctgtc ggccatcggg acgatgatgg tggactcgtt tgccaccagc 420
tactatagaa ggtctcactt cagcaaggcg cggcctgtgg aaggagacga ggggggtatc 480
ggggatgagg agaactcggt aggccatgct gaccacgtgc atgtccacac gcacgccacc 540
catggccacg cgcatggctc ggtgccggtc tcgccggagg acgcctccct tgctgaaaga 600
atccggcatc ggattatttc ccaagttttg gagttgggca ttgtagtaca ttctctggtt 660
attggtattt ctctgggtgc ttctgaaagg ccctccacca taaggccttt gctgggagcc 720
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<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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