具体实施方式

以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。

一、SSR分子标记AerM01的获得

试验地点：中国安徽省合肥市安徽农业大学；试验时间：2020年

材料：试验所用材料为毛花猕猴桃(Actinidia eriantha)‘华特(White)’和‘伴客(Blank)’品种的杂交群体。毛花猕猴桃是中国特有的猕猴桃种，果实口感酸甜，香气浓郁，维生素C含量极高，适应性广，抗逆性强，同时其根在传统中医药中常用于治疗肝炎、胃癌、鼻咽癌等疾病。

1、获取毛花猕猴桃雌雄株个体‘华特’和‘伴客’的测序基因组序列。其中毛花猕猴桃‘华特’基因组为2019年测序已发表，从猕猴桃国际基因组数据库KGD下载，网址为：http://kiwifruitgenome.org/；而毛花猕猴桃‘伴客’基因组为2020年测序待发表，其中包含有该SSR位点的一段长为4013bp序列(上下游各2000bp序列)如SEQ.ID No4。

2、利用MISA软件分别对‘华特’和‘伴客’的基因组序列进行SSR位点的鉴定。在此操作中，使用较严格的参数设定(包含一、二、三、四、五、六核苷酸的重复基序的最小重复次数分别为10、6、5、5、5、5次)，只保留单个重复基序串联排列的完美型SSR位点类型用于分子标记的筛选。

3、基于每个鉴定的SSR位点信息，在各自的基因组序列中获取其上下游200bp的侧翼序列；然后，将获得的侧翼序列与另一个基因组序列进行交叉比对(E值≤1e-5，同源性≥80)，任何比对上的侧翼序列被认为是非特异性位点而去除；最后，只保留没有比对上且同时具有上下游侧翼序列的SSR位点作为特异的SSR位点。

4、基于特异SSR位点的上下游侧翼序列，利用Primer3软件进行该位点上下游引物的批量设计，并利用e-PCR软件在基因组序列中鉴定其特异性；去除非特异性的引物，只保留特异性的引物用于后续实验验证。

5、将设计的引物送交生物公司进行引物的合成；利用合成的引物，对毛花猕猴桃雌雄株个体的叶片DNA进行PCR扩增，摸索合适的扩增条件，保证扩增条带的清晰度和稳定性；筛选得到本分子标记能在雄株中稳定性的扩增出一条清晰的条带，而在雌株中没有任何扩增条带，如图1所示。

6、将筛选得到的PCR引物用于猕猴桃属其他几个代表种(包括中华猕猴桃、美味猕猴桃、软枣猕猴桃等)已知雌雄性别个体的分子克隆和鉴定，确定了本分子标记特异性的应用于毛花猕猴桃，如图2所示。

二、SSR分子标记AerM01的应用

1、SSR分子标记在毛花猕猴桃杂交群体中的应用

采集安徽农业大学毛花猕猴桃(‘华特(White)’和‘伴客(Blank)’)杂交群体中20份鲜嫩叶片，其中包含10份雌株和10份雄株样品；同时，采集中华猕猴桃、美味猕猴桃、软枣猕猴桃等多个种(下文称为其他猕猴桃)的10份雌株和10份雄株样品。首先分别提取各个植株的基因组DNA，然后采用分子标记引物SEQ.ID No1和SEQ.ID No2对20份毛花猕猴桃及其他猕猴桃基因组DNA进行PCR扩展。

PCR反应扩增体系为：10μL反应体系包括正、反向引物各0.3μM，0.5mM dNTPs，1μL10X Taq buffer(包含MgCl₂)，0.3units Taq聚合酶，100ng DNA模板；

PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。

PCR扩增结果为：在毛花猕猴桃10份雄株样品中均扩增到一条大小为197bp的特异条带(SEQ.ID No3)，而在毛花猕猴桃10份雌株样品中均没有扩增到条带；在其他猕猴桃10份雄株和10份雌株样品中均没有扩增到条带。表1显示了本SSR分子标记在毛花猕猴桃杂交群体中随机选择的10株雄株和10株雌株中扩增的琼脂糖凝胶电泳结果；表2显示了本SSR分子标记在其他猕猴桃中随机选择的10株雄株和10株雌株中扩增的琼脂糖凝胶电泳结果，其中Aer001和Aer011为已知毛花猕猴桃的雄株和雌株，用于做正负对照。

表1 SSR分子标记AerM01在毛花猕猴桃杂交群体中随机选择的10株雄株和10株雌株中扩增的琼脂糖凝胶电泳结果

表2 SSR分子标记AerM01在其他猕猴桃中随机选择的10株雄株和10株雌株中扩增的琼脂糖凝胶电泳结果

由表1和表2结果可知，这种SSR分子标记AerM01能用于毛花猕猴桃的雌雄性别鉴定，不能对其他品种的猕猴桃进行雌雄性别鉴定，具有特异性，这种雌雄性别鉴定的SSR分子标记AerM01的获得方法，可应用于其他基因组序列已知的品种或物种中，具有普适性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 用于毛花猕猴桃雌雄性别鉴定的SSR分子标记AerM01及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aggtcgcaca tgtttggcta 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctctcaact ttcacaagca ct 22

<210> 3

<211> 197

<212> DNA

<213> 毛花猕猴桃(Actinidia eriantha)

<400> 3

aggtcgcaca tgtttggcta ctgtgtatgt gccatcctag tcgagatagg tatccatagc 60

cctgatgttt tcatctaaat ccttattatt atctcgttgt aatttttctc gagttaataa 120

tatttttctt ttgctgatca aaaaaaaaaa aagtcttatt tatagttgag tcttgagtgc 180

ttgtgaaagt tgagagc 197

<210> 4

<211> 4013

<212> DNA

<213> 毛花猕猴桃(Actinidia eriantha)

<400> 4

actatgatga aacgtttagt ccaatggcga aacttacaac aatacgagtc ctacttgcac 60

ttgcagccaa caaacatgga atttgtggca gatggatgtg aacaatgctt ttcttcatgg 120

agagctggat cgagagatct acataatcca accaatgggt tttcagagcc aagatcatct 180

tgaatttgtg tgtaagctgc ggaaagcatt ttacttgatt gaaacaagca cccagggtgt 240

ggtatggtaa gattactgaa tttttaacac aaagtggtta ttcagtaaca cctgcagatt 300

ccaacctgtt ttgtcaaagc caatgaagga aactagctat cgtgctagtg tatgtggatg 360

acttaatcat aaccggtgat gatgagacag aaattcttcg aacgaaggag aatttattag 420

tccgttttca aatgaaggaa cttggacagc tcaaacactt cctttgttca gaggttgatc 480

acacacaaga aggaatattt ctttgtcaac aaaaatattc caaagatttg ttgaagaggt 540

tcggaatact cgaatgcaag ccaatttcga cgccgatgga accaaaattc aaaatgtgtt 600

gcacatgaag gaaaagattt ggaagatgcg acgatgtatc gacaattggt aggcagcctg 660

atttacttaa ccttgacttg acctgacatt tcttatgcag ttagtgtgat gagtcggtac 720

atgcaaaatt caaagaagcc tcatttggaa gtagttcgat gaatactgag atatgtaaat 780

catacaattg actatggtct ttttacaaga aaggtgaaga ctacaagtta gttggatact 840

acgatgctga ctatgcaaga gatcatgaca ccatgagatc aataactggg tacgtgttta 900

agcttggttc cggaataatt tcttggtgta gcaaaagaca gccgacgata tcattatcaa 960

ccactaaagt gaagtatcga gcagcagcaa tggcagctca agaaagtaca tggttgatac 1020

agctaatgaa taatctacat caactattag attatgtagt tccgttatac tatgacaatc 1080

agtcggcaat tcgtttggac gagaatccga tttttcatgc aagaactaag catgttgaag 1140

tgcactatca ttttatcaga gaaaaagttc tgcaagaaaa ttgagatgag acagatcaag 1200

acggatgatc aagttgcgga tttgttcaca aagtctaagt acaggcaagc tcgaaatgtt 1260

tcgtctacag cttgacatag tacagtgaat gagagctgac attgagggga ggttaagaat 1320

taatgtcagt caaaagtcaa atccaagcta tcatacaatg tccaagccca agtcctctct 1380

caagaattta ttgaagccca tagacacttc tcaaacatat aatagatatg ttgtggcaag 1440

tttgttgcaa agcaccttgt gtggatacaa attaattagc cttttattat ttgtgtggta 1500

agaaattaat tagtttaaat aaatgtgtgg tgtgtatttc atatagcttg ctataaatac 1560

ccaagttctc gagccttgta aattattaag gagtaaagaa ctaaataaga ctaaaaagtc 1620

ttatttatca aatattgatg tgaatggttt tgctgaaatg attaaacatt ggtggctgct 1680

agggcagatt atgtgtgcaa ttggattttt gttgctctga acaatttggg tgctgatgtt 1740

ttgcttctgt ttggatcctc ccttgcttga gagttgctta gcatagggtg ctttagattt 1800

ttgccttgtg tttttatgtt tctgtttgta tcttgccaac tttctacgat tttttgggtt 1860

taggtcgcac atgtttggct actgtgtatg tgccatccta gtcgagatag gtatccatag 1920

ccctgatgtt ttcatctaaa tccttattat tatctcgttg taatttttct cgagttaata 1980

atatttttct tttgctgatc aaaaaaaaaa aaagtcttat ttatagttga gtcttgagtg 2040

cttgtgaaag ttgagagctt tttttatatt ttttttagtt taataaaatc ttttgatgtg 2100

tctccaattt ttgagtgaat ttctttttga gatgtaaaat ttagagttgt atattctaaa 2160

ttttttctca acaataagtt tgttttgttt tacatgcaac aaatgagttc attttttctc 2220

ttccttcgtg taatttttgt ttattctgtg gctagctcac taactctgat ttctgtttga 2280

ctctctctcc tttctcaggc aaggtttctg ctgttagttt ggaaattctt tttcaaggtc 2340

aaagtaaaca taggctacgt tggattatag attttgaggg tgaaattgga ctattaatcg 2400

tgtggggccc actttaacta tattttagtg caaaaaacta aaccatgggc taaagtttat 2460

tgggattgtt aatcctctaa catggaggat taagaatccc aacatggagg ttaagaatcc 2520

cattggggtt ggtattacca atccaatccc atgggactat taatctaagg gaattgggat 2580

tggattgcta acctatcaaa ttaaaatctg ttattagacg tggccataat gataagcgaa 2640

agtgagaggt tatattttgt gtaattgaca tatcaaagtg gtagaatggt ctctacactg 2700

cacgtaggcc cgtagaaacg aggttttaag aggcgaatac accactataa tgcacccatt 2760

acacatataa aaccccctac ttaagtaggg gctgaaccac ttccacatgt ggactattta 2820

gggactttaa ttcattactc acacttgtgg gaactacggg gaactttttg aactggacta 2880

gacctaatac atcacagtat ataagaatgt ggttaaaacg cactgggaac tttggacaga 2940

tgagacattt ctgggatgca taaagagcac aattaattat gacacttttc tgaggcaata 3000

cgtggtttgg tatctcagca agagagaaaa ttaatgtcta atagcattca ctgaaaacaa 3060

acacatcctt atcttttcaa attgaaataa atgatttccc atctgtccca acagatctag 3120

gcctttgaaa gtgttcgacc cggtgcccag aataaacttc agggggcagt gcgtcatttg 3180

tgagcaggtt ttgtggcacc accccataaa tgtccgacat gtcaacttgg tggtggtgct 3240

ggcggactgg gccagcaacc accccatcgt cattgtccaa taatgggtgc aaccggtcaa 3300

aagtggcatt cgcgaatgat gcagccatta tgacaacggg acccgatgca actagtgcac 3360

caaccacagc cccacccgcg accaggcctt gtgcccccgc taagtaaatg gtcagcccgg 3420

tgacccctgg cggtgcaggt ggaggtaaga tggatccgag gagtgagagt atctcaaagc 3480

gtccatggag tgtcgccatt gcccccatga ggccggttga cgcaaagtaa cattggtgac 3540

gcaaccggtg gcgtttagta cacagatgcc tcgctgcttc ctccttgcaa agttggtcaa 3600

gctcttgctt atgtcacacc cagaggtcac ctccatggca tgagcccgga gagcatttgg 3660

gctgtcccgg tgatgataat gggctgcttg ggcttattct tcgagcccac tggcctgcca 3720

cgagtcctcc gaatggtttc tccctcagtc actgttggca tcgccttggg gactttattc 3780

atactgctat tctctggttc tgaacctttg gactcaatgc aaggaagagt agtaagatca 3840

gccattgatg gagttgttgt ttggcttgca gaggacgaga acatcactaa accttacctg 3900

tctggaaatg agtataaata agcaactcaa cctataaaat tatgatgaaa actaagagaa 3960

aaaatgaggg ttaggacatg gttaagtaac actaaccctg tatttgccta act 4013