针对Sorcin调控环路诊断、预测、逆转卵巢癌紫杉醇耐药
技术领域
本发明涉及生物医药
技术领域
，具体地说，涉及针对Sorcin调控环路诊断、预测、逆转卵巢癌紫杉醇耐药。背景技术
目前，铂类联合紫杉醇的化疗方案是晚期卵巢癌术后的标准治疗模式，多数患者初始化疗效果明显，但是后期约80％的患者又会出现化疗耐药和复发，化疗耐药的发生是卵巢癌治疗的重大难题。但是目前临床上并没有预测卵巢癌病人化疗反应的标志物。
文献(张淑军,邓梦霞,王前,等.Sorcin表达水平影响卵巢癌患者化学药物治疗耐药及生存时间.)探讨了可溶性耐药相关钙结合蛋白质(soluble resistance-relatedcalcium-binding protein，Sorcin，SRI)与卵巢癌化学药物治疗耐药的关系及对患者生存时间的影响，发现Sorcin可能与卵巢癌化疗耐药相关，Sorcin表达水平可能影响卵巢癌患者的生存时间。文献(王斌.过氧化物酶(PXDN)在卵巢癌中的功能和机制初步研究[D].南方医科大学.)公开了过氧化物酶促进卵巢癌增殖侵袭转移，分子机制是通过促进TGF-β通路中Snaill和Smad4的表达以及Smad2和Smad3的活化。
然而，锌指E盒结合蛋白1(Zinc Finger E-box Binding Homeobox 1，ZEB1)在人紫杉醇耐药卵巢癌中高表达，微小干扰RNA miR-142-5p和TGF-β信号转导蛋白Smad4在人紫杉醇耐药卵巢癌中低表达，Sorcin与三者形成Smad4/ZEB1/miRNA-142-5p/Sorcin负反馈环路介导卵巢癌紫杉醇耐药目前尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供Smad4/ZEB1/miRNA-142-5p/Sorcin负反馈环路在卵巢癌紫杉醇耐药中的用途。
第一方面，本发明提供了Sorcin、Smad4、ZEB1和miR-142-5p中的一个或几个作为诊断标志物在制备卵巢癌个体紫杉醇耐药性的检测试剂盒或卵巢癌紫杉醇耐药个体预后试剂盒中的应用。
作为本发明一种优选的实施方式，所述卵巢癌为高级别浆液型卵巢癌。
第二方面，本发明提供了检测Sorcin、Smad4、ZEB1和miR-142-5p中的一个或几个的表达水平的试剂在制备卵巢癌个体紫杉醇耐药性的检测试剂盒或卵巢癌紫杉醇耐药个体预后试剂盒中的应用。
作为本发明一种优选的实施方式，所述卵巢癌为高级别浆液型卵巢癌。
作为本发明另一种优选的实施方式，所述试剂选自：特异性扩增Sorcin、Smad4、ZEB1蛋白的编码基因的引物；或特异性识别Sorcin、Smad4、ZEB1蛋白的编码基因或其转录本的探针；或特异性抗Sorcin、Smad4、ZEB1蛋白的抗体；或特异性结合miR-142-5p或miR-142-5p对应的cDNA的探针；或特异性结合miR-142-5p或miR-142-5p对应的cDNA的引物。
作为本发明另一种优选的实施方式，所述试剂通过荧光染料法、数字PCR、共振光散射法、实时荧光定量PCR、测序或生物质谱法检测Sorcin、Smad4、ZEB1和miR-142-5p中的任一个或几个的表达水平。
第三方面，本发明提供了Sorcin的抑制剂、ZEB1的抑制剂、Smad4的促进剂和miR-142-5p的促进剂中的一个或几个在制备逆转卵巢癌紫杉醇耐药的药物中的应用。
作为本发明一种优选的实施方式，所述抑制剂选自以蛋白或其转录本为靶序列、且能够抑制蛋白表达或基因转录的小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸；或能表达或形成所述小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物；所述Smad4的促进剂选自Smad4或其活性片段或它们的编码序列的过表达载体；所述miR-142-5p的促进剂选自其模拟核酸。
更优选地，所述Sorcin的抑制剂为序列如SEQ ID NO:4所示的小干扰RNA。
第四方面，本发明提供了一种筛选逆转卵巢癌紫杉醇耐药的潜在物质的方法，包括：(1)用候选物质处理表达Sorcin、Smad4、ZEB1和/或miR-142-5p的体系；(2)检测所述体系中Sorcin、Smad4、ZEB1和/或miR-142-5p的表达；若所述候选物质可降低Sorcin、ZEB1的表达或升高ZEB1、miR-142-5p的表达，则表明该候选物质是需要的潜在物质，反之则表明该候选物质是非需要的潜在物质。
本发明优点在于：
本发明通过细胞实验和肿瘤大数据证实可溶性耐药相关钙结合蛋白(Sorcin)，锌指E盒结合蛋白1(ZEB1)在人紫杉醇耐药卵巢癌中高表达，而微小干扰RNA miR-142-5p和TGF-β信号转导蛋白Smad4在人紫杉醇耐药卵巢癌中低表达，且表达量均与卵巢癌患者的生存期密切相关，其四者之间形成Smad4/ZEB1/miRNA-142-5p/Sorcin负反馈环路介导卵巢癌紫杉醇耐药，作用于这一环路(如用miRNA-142-5p降低Sorcin)可以逆转卵巢癌紫杉醇耐药。基于此，本发明提供了检测卵巢癌紫杉醇耐药和预测卵巢癌紫杉醇耐药病人预后的分子标志物，为逆转卵巢癌紫杉醇耐药提供了新的靶点。
附图说明
图1：(A)与卵巢癌紫杉醇敏感细胞OVCAR-3比，Sorcin在卵巢癌紫杉醇耐药细胞OV3R-PTX中高表达；(B)与卵巢癌紫杉醇敏感细胞SKOV-3比，Sorcin在卵巢癌紫杉醇耐药细胞SK3R-PTX中高表达；(C)在GSE51373数据集中，与化疗敏感的卵巢癌患者组织相比，Sorcin在人卵巢癌化疗耐药的组织中趋向于高表达；(D)与卵巢癌紫杉醇敏感细胞OVCAR-3和SKOV-3比，ZEB1在卵巢癌紫杉醇耐药细胞OV3R-PTX和SK3R-PTX中高表达；(E)在GSE51373数据集中，与化疗敏感的卵巢癌患者组织相比，ZEB1在人卵巢癌化疗耐药的组织中高表达；(F)与卵巢癌紫杉醇敏感细胞SKOV-3比，miR-142-5p在卵巢癌紫杉醇耐药细胞SK3R-PTX中低表达；(G)与卵巢癌紫杉醇敏感细胞OVCAR-3和SKOV-3比，SMAD4在卵巢癌紫杉醇耐药细胞OV3R-PTX和SK3R-PTX中低表达；(H)在GSE51373数据集中，与化疗敏感的卵巢癌患者组织相比，SMAD4在人卵巢癌化疗耐药的组织中低表达。
图2：(A)Sorcin的高表达与卵巢癌患者缩短的总生存期密切相关；(B)ZEB1的高表达与卵巢癌患者缩短的总生存期密切相关；(C)miR-142的高表达与卵巢癌患者更长的总生存期密切相关；(D)Smad4的低表达可以预测卵巢癌患者更短的总生存期。
图3：Smad4/ZEB1/miRNA-142-5p/Sorcin负反馈轴介导卵巢癌紫杉醇耐药。(A和B)在OV3R-PTX和SK3R-PTX细胞中，干预TGF-β，敲低SMAD4以及两者联合处理后，Western blot检测ZEB1，P-SMAD2，SMAD2和SMAD4表达的变化；数字代表灰度值的半定量分析；(C和D)在OV3R-PTX和SK3R-PTX细胞中，敲低ZEB1后，Pri-miR-142的表达上调；(E和F)在OV3R-PTX和SK3R-PTX细胞中，转染miR-142-5p mimic后，Sorcin的表达显著下调；(G和H)RT-qPCR检测在SK3R-PTX和SKOV3细胞中，敲低Sorcin后ZEB1的表达水平(左)；Western blot分析在SK3R-PTX和SKOV3细胞中，敲低Sorcin后ZEB1的表达水平(右)；(I)细胞核质分离实验Western blot检测在SK3R-PTX细胞中敲低Sorcin后，SMAD2和SMAD4在胞浆和胞核中的表达上调；(J)细胞免疫荧光共聚焦实验分析在SK3R-PTX细胞中敲低Sorcin后，SMAD4的细胞核转位细胞的比例明显多于NC对照组。
图4：敲低Sorcin蛋白能够增加卵巢癌紫杉醇耐药细胞对紫杉醇的敏感性，导致耐药细胞活力下降、细胞增殖减缓、细胞凋亡增加。(A)转染Si-Sorcin后，Sorcin的蛋白水平显著下降；(B和C)浓度梯度和时间梯度实验，在OV3R-PTX中，CCK8实验检测敲低Sorcin后PTX对细胞活力的改变。(D)集落形成实验分析在OV3R-PTX细胞沉默Sorcin对细胞集落形成的影响以及细胞集落数的统计分析；(E)流式细胞仪分析OV3R-PTX细胞中Si-Sorcin组和NC组的凋亡率以及两组总凋亡细胞所占比例的定量。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
一、Sorcin、Smad4、ZEB1和miR-142-5p在人卵巢癌紫杉醇敏感细胞系和卵巢癌紫杉醇耐药细胞中的表达比较。
实验方法：
1.将OVCAR3，OV3R-PTX，SKOV3和SK3R-PTX细胞(OV3R-PTX和SK3R-PTX来源如专利CN104388389A所述)加入适量的裂解液SDS，放冰上裂解30min。后通过刮取细胞裂解液，4度离心后加入合适体积的SDS loading buffer，金属浴100℃加热10min后得到细胞总蛋白样品。
2.蛋白样品进行蛋白免疫印迹实验(Western blot)，孵育相应的Sorcin，ZEB1和SMAD4一抗过夜后，Actin为内部参照，第二天孵育二抗，TBST清洗数次后化学发光显影。
3.使用RNA提取试剂盒提取SKOV3和SK3R-PTX细胞的总RNA，后通过逆转录和荧光定量PCR的方法检测miR-142-5p的表达。
4.GSE51373数据集包括12例化疗耐药和16例化疗敏感的高级别浆液型卵巢癌患者，提取各样本的表达谱矩阵，比较SRI，ZEB1和SMAD4的mRNA在化疗敏感和化疗耐药患者中的表达差异。
实验结果：
Sorcin、Smad4、ZEB1和miR-142-5p是卵巢癌紫杉醇耐药的相关标志物：Sorcin和ZEB1在人紫杉醇耐药卵巢癌中表达增高，miR-142-5p和Smad4在人紫杉醇耐药卵巢癌细胞中表达下调。Sorcin和ZEB1在人卵巢癌化疗耐药的组织中有表达上调，SMAD4在人卵巢癌化疗耐药的组织中表达下调(图1)。
二、Sorcin、Smad4、ZEB1和miR-142-5p对卵巢癌患者的生存预后的影响。
实验方法：
使用KM-PLOTTER在线卵巢癌数据库评价Sorcin，Smad4，ZEB1和miR-142-5p对卵巢癌患者的生存预后的影响。对于Sorcin使用208920_s_at探针，高低表达临界值为287；对于ZEB1使用239952_at探针，高低表达临界值为78；对于SMAD4使用202526_at探针，高低表达临界值为79；对于miR-142-5p使用探针has-miR-142，高低表达临界值为2。
实验结果：在卵巢癌中，Sorcin和ZEB1的高表达与患者不良的总生存期密切相关，而SMAD4和miR-142的低表达与患者不良的总生存期密切相关(图2)。
三、Smad4/ZEB1/miRNA-142-5p/Sorcin负反馈环路介导卵巢癌紫杉醇耐药。
实验方法：
1.在OV3R-PTX和SK3R-PTX细胞中，干预10ng/ml TGF-β1，转染Si-SMAD4(序列信息5’→3’：GCUCCUAGACGAAGUACUUTT，SEQ ID NO:1，其中TT为保护碱基)，48小时后提取细胞总蛋白，后通过Western blot检测ZEB1，P-SMAD2和SMAD4的表达。在OV3R-PTX和SK3R-PTX细胞中，转染Si-ZEB1(序列信息5’→3’：GCUGAGAAGCCUGAGUCCUTT，SEQ ID NO:2，其中TT为保护碱基)，48小时后提取细胞总RNA，后通过RT-qPCR检测Pri-miR-142的表达。
2.在OV3R-PTX和SK3R-PTX细胞中，干预miR-142-5p mimic(CAUAAAGUAGAAAGCACUACU，SEQ ID NO:3)或Sh-Sorcin(序列信息5’→3’：GCUGGAGACAACACUUUAUTT，SEQ ID NO:4，其中TT为保护碱基)，后通过Western blot检测Sorcin或ZEB1的表达。
3.敲低Sorcin后，分别提取OV3R-PTX和SK3R-PTX细胞浆和细胞核成分，后通过Western blot检测SMAD4表达。免疫荧光实验检测敲低Sorcin后SMAD4在细胞核的定位情况。
实验结果：
在卵巢癌紫杉醇耐药细胞中，TGF-β/Smad4直接调控转录因子ZEB1的表达，ZEB1转录抑制miR-142-5p的表达，而miR-142-5p又能沉默Sorcin的表达，最后Sorcin通过介导Smad4核转位负反馈调控ZEB1表达。综上所述，Sorcin通过ZEB1/miR-142-5p/SMAD4负反馈调控轴介导卵巢癌的紫杉醇耐药(图3)。
四、敲低Sorcin能显著逆转卵巢癌细胞的紫杉醇耐药。
实验方法：
1.使用Si-Sorcin(序列信息5’→3’：GCUGGAGACAACACUUUAUTT，SEQ ID NO:4)转染OV3R-PTX细胞，48小时后提蛋白通过Western blot检测Sorcin的敲低效率。
2.在PTX耐药细胞转染Si-Sorcin，转染后24h后胰酶消化待处理细胞。每孔104个细胞接种于96孔板，隔日加入浓度梯度含有PTX的完全培养基。48h后每孔加入配制好的110μl含有CCK8的培养基，孵育2小时后，酶标仪检测样本吸光度值。细胞活力占比(％)＝[PTX干预组－空白组]/[0μM PTX组－空白组]×100，空白组即没有细胞的孔的吸光度值。
3.在PTX耐药细胞转染Si-Sorcin，转染后24h后胰酶消化待处理细胞。每孔103个细胞接种于6孔板，两天后等细胞贴壁状态，在相应组加入不同浓度PTX。两个星期后，拿出孔板，弃旧培养基，PBS洗涤2遍。4％多聚甲醛溶液固定，1％结晶紫染色，PBS洗涤2遍。相机拍照保存数据，ImageJ计数细胞集落数。
4.双蒸水配制1×binding buffer无水乙醇并放在4度冰箱预冷。取待处理的细胞，收集培养基于离心管中。PBS清洗一遍并回收，后用不含EDTA的胰酶消化细胞，4度离心收集的细胞悬液。弃上清，预冷PBS清洗细胞2遍，4度离心。弃上清，吸取100μl的1×bindingbuffer混匀细胞沉淀。后加入Annexin V和PI，室温避光放置15min。每管补足400μl的1×binding buffer后上机检测。
实验结果：
在卵巢癌紫杉醇耐药细胞中，沉默Sorcin表达能够逆转卵巢癌细胞的紫杉醇耐药，增加耐药细胞对紫杉醇的敏感性；并且沉默Sorcin表达能够促进卵巢癌细胞凋亡和抑制卵巢癌细胞的增殖(图4)。
综上所述，Sorcin和ZEB1在人紫杉醇耐药卵巢癌中表达增高，Smad4和miR-142-5p在人紫杉醇耐药卵巢癌中表达降低，且均与卵巢癌患者生存预后相关。在卵巢癌中，它们构成Smad4/ZEB1/miRNA-142-5p/Sorcin负反馈环路调节卵巢紫杉醇耐药。Sorcin、ZEB1、Smad4和miR-142-5p可以预测卵巢癌紫杉醇耐药的生物标记物以及潜在逆转耐药的靶点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 复旦大学附属金山医院
<120> 针对Sorcin调控环路诊断、预测、逆转卵巢癌紫杉醇耐药
<130> /
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcuccuagac gaaguacuu 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcugagaagc cugaguccu 19
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
cauaaaguag aaagcacuac u 21
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcuggagaca acacuuuau 19
