长链非编码rna pralr用于诊断肿瘤紫杉醇化疗耐药的应用

文档序号：3393 发布日期：2021-09-17 浏览：34次英文

长链非编码RNA PRALR用于诊断肿瘤紫杉醇化疗耐药的应用

技术领域

本发明涉及生物医药

技术领域

，具体地说，涉及一种新的卵巢癌耐药相关的lncRNA，及其作为生物标志物在制备肿瘤紫杉醇化疗耐药诊断试剂盒中的用途。

背景技术

卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，其死亡率位居各妇科恶性肿瘤的首位。目前紫杉醇(paclitaxel，PTX)化疗是临床治疗晚期卵巢癌的一线治疗方案，但是化疗耐药导致卵巢癌复发依然是临床迫切需要解决的问题。

lncRNA，即长链非编码RNA，是一类长度超过200nt的基本没有编码蛋白功能的RNA分子的总称，它们广泛参与机体的生理和病理过程，包括肿瘤的发生发展和化疗耐药。

在UCSC数据库中收录了一个lncRNA(TCONS_00013523)序列，但是只记录了部分序列。本申请人前期从lncRNA(TCONS_00013523)序列开始，利用5’-RACE和3’-RACE技术从卵巢癌紫杉醇耐药细胞系OV3R-PTX中发现并命名了PRALR该lncRNA分子，进一步证实PRALR是一个新型的卵巢癌耐药相关lncRNA，敲低后卵巢癌紫杉醇耐药细胞的增殖、迁移和侵袭能力都有显著的下降，提示PRALR可作为逆转卵巢癌紫杉醇耐药的分子靶点，PRALR的抑制剂可作为治疗耐紫杉醇卵巢癌的有效药物。针对该部分研究，申请人于2018年递交了CN110123828A(公开日2019.08.16)、CN110129318A(公开日2019.08.16)和CN110129319A(公开日2019.08.16)三件专利申请。然而该lncRNA在肿瘤领域的相关研究尚且不足，未见报道。

我们知道，由于可变剪接的存在，一个基因可有多个转录本，编码不同的lncRNA分子，发挥不同的生物学作用。因此，研究PRALR基因的其他转录本是非常必要的，这对于进一步探索PRALR与耐药卵巢癌发生发展的关系及分子作用机制而言具有重要意义，有助于开发临床治疗药物及诊断试剂盒。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种紫杉醇耐药相关长链非编码RNA的新的转录本及其用途。

第一方面，本发明提供了序列如SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19所示的DNA或它们转录得到的lncRNA分子作为生物标志物在制备肿瘤化疗耐药诊断试剂盒中的应用。

作为一个优选例，所述肿瘤为卵巢癌或肺癌。

第二方面，本发明提供了检测样品中序列如SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19所示的DNA或它们转录得到的lncRNA分子的含量的试剂在制备肿瘤化疗耐药诊断试剂盒中的应用。

作为一个优选例，所述肿瘤为卵巢癌或肺癌。

作为另一优选例，所述样品为血液、血清、血浆、尿液、肿瘤组织或它们的外泌体。

第三方面，本发明提供了一种诊断肿瘤化疗耐药的试剂盒，其特征在于，含有检测样品中序列如SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19所示的DNA或它们转录得到的lncRNA分子。

第四方面，本发明提供了一种lncRNA分子，其特征在于，其由序列如SEQ ID NO:19所示的DNA转录而来。

第五方面，本发明提供了转录得到如上所述lncRNA分子的DNA。

本发明优点在于：

本发明在耐紫杉醇的卵巢癌细胞中，鉴定出lncRNA(TCONS_00013523)新的转录本全长序列，命名为PRALR-α。通过敲除和过表达PRALR-α，发现能增加或者降低卵巢癌细胞对PTX的敏感性，说明PRALR-α和卵巢癌细胞紫杉醇耐药密切相关。并通过qPCR，发现该lncRNA和多种肿瘤紫杉醇耐药相关，同时在卵巢癌和肺癌PTX耐药细胞上清外泌体中检测到该lncRNA在PTX敏感和耐药细胞中存在显著差异，提示它可以作为一个生物标记物用于诊断肿瘤化疗耐药，例如通过临床样本(血液、血清、血浆、尿液、肿瘤组织等)分离外泌体检测该lncRNA，用于监测化疗耐药。

附图说明

图1：pPRALR-α-Bleo质粒图谱。

图2：A、C.敲除和过表达PRLAR-α细胞系的效率验证；B、D.在过表达和敲除PRLAR-α细胞系中测定细胞对PTX的IC₅₀值。

图3：PTX敏感和耐药肿瘤细胞中PRALR-α的qPCR检测结果。A.来源于肺癌细胞A549的PTX敏感和耐药细胞中PRALR-α的qPCR检测结果；B.来源于卵巢癌细胞OVCAR-3的PTX敏感和耐药细胞中PRALR-α的qPCR检测结果；C.来源于卵巢癌细胞SK-OV-3的PTX敏感和耐药细胞中PRALR-α的qPCR检测结果(**：P<0.01)。

图4：来源于培养的卵巢癌细胞OVCAR-3的PTX敏感和耐药细胞分泌的外泌体中PRALR-α的qPCR检测结果(*：P<0.05)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

1材料

RNAiso Plus总RNA提取试剂(Takara 9109)；

RNA逆转录试剂盒(ROCHE 04897030001)；

SYBgreen法qPCR试剂盒(ROCHE 04913914001)；

高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara R045A)；

RACE 5’/3’Kit(TAKARA 634858)。

2方法

2.1鉴定TCONS_00013523新转录本全长序列

2.1.1 5’RACE和3’RACE扩增引物设计

从UCSC数据库中下载人的lncRNA TCONS_00013523序列，分别设计套式PCR的引物用于5’RACE和3’RACE扩增。扩增引物由苏州金唯智生物技术有限公司合成，引物序列见表1。

表1 5’RACE和3’RACE扩增的引物对序列

2.1.2 5’RACE和3’RACE扩增和测序

参见RACE 5’/3’Kit(TAKARA 634858)说明书进行扩增，简单说明如下：首先，从卵巢癌紫杉醇耐药细胞系OV3R-PTX中采用RNAiso Plus试剂提取新鲜RNA，再使用该试剂盒中逆转录引物，逆转录出用于5’RACE和3’RACE扩增用的cDNA。其次，采用outer和inner primers以及UPM引物在高保真酶体系中扩增出5’RACE和3’RACE全长序列。最后，采用试剂盒中In-Fusion Cloning方法将RACE扩增片段插入试剂盒自带的LineareizedpRACE vector中，然后选取8-10个克隆进行测序鉴定，最终确定5’RACE和3’RACE的序列，拼接出TCONS_00013523新转录本PRALR-α的全长序列。

2.2PRALR-α稳转过表达细胞系构建

2.2.1过表达质粒引物设计

根据载体序列和通过RACE实验鉴定的PRALR-α转录本全长序列设计过表达质粒引物，见表2。

表2过表达质粒构建的引物对序列

注：下划线为HindIII和XbaI的酶切位点。

2.2.2构建过表达细胞系

1)采用高保证酶从OV3R-PTX扩增出PRALR-αcDNA全长序列；

2)将骨架质粒pcDNA3.1(+)/zeo(Invitrogen V86020)采用HindIII和XbaI酶切线性化处理；

3)采用无缝克隆试剂盒将PRALR-α全长PCR产物和线性化质粒连接，转化进入DH5α感受态细胞；

4)采用质粒提取试剂盒提取pPRALR-Bleo质粒，冻存于-80度备用。质粒图谱见图1；

5)将对照质粒pcDNA3.1和pPRALR-Ble.o质粒转染OV3R-PTX细胞，48小时后加入100μg/ml的博来霉素进行细胞筛选，最后构建的稳定表达细胞分别命名为OV3R-PTX+Vector和OV3R-PTX+PRALR-α-OE。

2.3CRISPR-Cas9系统敲除PRALR-α细胞系的构建

2.3.1单链guid RNA序列设计

根据PRALR-α全长序列设计敲除PRALR-α的SpaCas9蛋白识别序列位点：

识别序列1：TTCTTCAAGCATAATTGCCTGGG(SEQ ID NO:8)；

识别序列2：GTAAAGCGTTTAATAAGGCCTGG(SEQ ID NO:9)。

2.3.2构建敲除PRALR-α细胞系

1)合成构建敲除质粒的引物序列如下：

SgRNA1F：CACCGTTCTTCAAGCATAATTGCCT(SEQ ID NO:10)；

SgRNA1R：AAACAGGCAATTATGCTTGAAGAAC(SEQ ID NO:11)；

SgRNA2F：CACCGTAAAGCGTTTAATAAGGCC(SEQ ID NO:12)；

SgRNA2R：AAACGGCCTTATTAAACGCTTTAC(SEQ ID NO:13)。

2)引物磷酸化与退火

将合成引物用去离子水稀释至100μM，然后按照T4 Polynucleotide Kinase说明书要求，配制反应体系为10μl，随后磷酸化和退火在PCR仪中进行，反应条件如下：

37℃,30min；

95℃,5min；

PCR梯度降温到42℃，共53个循环，每个循环降低1℃，时间为1min；

PCR梯度降温到24℃，共9个循环，每个循环降低2℃，时间为1min。

放置在冰上或者保存在-20℃冰箱备用。

3)Guide RNA克隆载体质粒PX459(Addgene货号：62988)，采用BsaI对PX459载体的BbsI酶切，割胶回收载体，测定载体浓度。

4)采用T4连接酶将退火引物和酶切的PX459在16度连接2h以上，转化并鉴定阳性克隆。

5)采用质粒提取试剂盒提取阳性克隆质粒，冻存于-80度备用。

6)将敲除质粒瞬时转染进入OV3R-PTX细胞72h后加入puromycin进行筛选。

7)形成克隆后，用胰酶消化单克隆计数，梯度稀释接种96孔板。

8)挑选出单克隆细胞然后扩大培养，并进行敲除基因的鉴定，最后构建稳定敲除PRALR-α的细胞系，命名为OV3R-PTX^PRALR-/-。

2.4过表达PRALR-α和敲除PRALR-α细胞针对紫杉醇化疗药的半抑制浓度(halfmaximal inhibitory concentration，IC₅₀)测定实验

1)加药前一天，分别对OV3R-PTX+Vector和OV3R-PTX+PRALR-α-OE或者OV3R-PTX和OV3R-PTX^PRALR-α-/-细胞进行消化计数，按照10000个细胞/孔铺入96孔板中。

2)细胞培养24h后，采用梯度稀释的方式，配制PTX的药物浓度梯度，每个加药浓度设置3个细胞复孔。OV3R-PTX+Vector和OV3R-PTX+PRALR-α-OE实验组PTX使用浓度为10μM，5μM，4μM，2μM，1μM，0.5μM，0.1μM，0.05μM，0.01μm，0μM。OV3R-PTX和OV3R-PTX^PRALR-α-/-实验组PTX使用浓度为5μM，4μM，2μM，1μM，0.5μM，0.1μM，0.05μM，0.01μm，0.005μM，0μM。

3)加入PTX药物处理48h后，每孔加入10μl的CCK8溶液，反应2小时后，在450nm波长下，测定吸光度OD值。

4)根据不同浓度的OD值，绘制药物抑制和PTX浓度曲线，计算出各实验组IC50值。

2.5利用qPCR方法在PTX敏感和耐药细胞中检测PRALR-α

所用PTX敏感和耐药细胞，耐PTX特性如下：

注：OVCAR-3和SK-OV-3为卵巢癌细胞；A549为肺癌细胞。

按照试剂盒说明书操作，采用RNAiso Plus总RNA提取试剂分别裂解肿瘤细胞中RNA，然后采用RNA逆转录试剂盒取500ng的总RNA进行逆转录成cDNA。采用针对鉴定PRALR-α全长序列设计的引物，进行qPCR半量分析，使用GAPDH作为定量的对照。引物序列如下：

PRALR-α-F：ATGCTCATCAATGACAGATCG(SEQ ID NO:14)；

PRALR-α-R：AGAGCCAAAGGGACTGAGAG(SEQ ID NO:15)；

GAPDH-F：GCACCGTCAAGGCTGAGAAC(SEQ ID NO:16)；

GAPDH-R：TGGTGAAGACGCCAGTGGA(SEQ ID NO:17)。

2.6分离外泌体，qPCR方法检测PRALR-α表达

首先，收集耐药或者敏感细胞的细胞上清外液15ml，采用100kDa的超滤管浓缩至1-2ml，然后按照外泌体分离试剂盒(Qiagen 76064)说明书要求进行后续外泌体分析，最后外泌体溶解于400μL的bufferXE。取出200μL按照2.5的方法半定量分析PRALR-α表达。

3结果

3.1lncPRALR新转录本全长序列鉴定

采用5’RACE和3’RACE扩增出PRALR基因的全长序列(SEQ ID NO:18)。其中，用于转录获得PRALR-α分子的序列如SEQ ID NO:19所示。

3.2PRALR-α稳转过表达细胞系构建

构建得到稳定过表达PRALR-α的细胞OV3R-PTX+PRALR-α-OE，载体中插入的PRALR-α基因片段的序列如SEQ ID NO:20所示。

3.3PRALR-α敲除细胞系构建

基于CRISPR-Cas9系统构建了稳定敲除PRALR-α的细胞系OV3R-PTX^PRALR-α-/-，经鉴定敲除的序列如SEQ ID NO:21所示。

3.4细胞敲除和过表达PRALR-α实验结果

通过PCR方法对敲除PRALR-α的细胞系进行检测，发现敲除效率达到100％(图2中A)，显著高于研究过程中以其他sgRNA构建的敲除细胞系。在稳定过表达PRALR-α细胞系中发现，相比较于空载体组，PRALR-α过表达提高了21倍(图2中C)，显著高于研究过程中构建的其他过表达细胞系。

3.5CCK-8细胞活力实验结果

过表达PRALR-α和敲除PRALR-α细胞针对紫杉醇化疗药的半抑制浓度见图2，分别为6.323μM和0.292μM。卵巢癌耐药细胞敲除PRALR-α后，细胞对紫杉醇化疗敏感性增加(图2中B)；卵巢癌耐药细胞过表达PRALR-α后，细胞对紫杉醇化疗耐药性增加(图2中D)。

3.6PTX敏感和耐药肿瘤细胞中PRALR-α的qPCR检测结果

见图3，结果表明，PRALR-α在卵巢癌及肺癌PTX耐药细胞高表达。

3.7PTX敏感和耐药肿瘤细胞上清分离外泌体中PRALR-α的qPCR检测结果

见图4，结果表明，在细胞上清分离的外泌体中发现它和PTX耐药密切相关，呈高表达。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学附属金山医院

<120> 长链非编码RNA PRALR用于诊断肿瘤紫杉醇化疗耐药的应用

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aggaagctct gagatacttc cttttcttac ttaataagaa tagaccttgg aggtctggac 180

ctggacatga acgtacactt ttctaaagaa gatatacaca tggccaacaa gcatgtgaaa 240

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ctcacaccag tcagaatggc tattattaaa aactcaaaaa ataacagatg ctggcgaggt 360

tgcagagaaa agggaacact tatacactgt tggtgggagt gtaaattagt tcaactattg 420

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cacctttgat gag 1093

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gtgacctcat tgagccgcag ccggccgaga agatcggcaa gatgaagaag ttgcggagaa 120

ctttgtcgga gagtttcagt cgcattgctt tgaagaaaga tgacaccacc tttgatgagg 180

gaaaccccca tgagactaca ggtgtgaagc aagatagaag catcagtgca aaagagattc 240

tcttactgag ataccttgga acatggtttg aataatattg ctctaacttc tttcatgtca 300

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