一种癌症和/或癌前病变检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物医药
技术领域
，尤其涉及一种癌症和/或癌前病变检测试剂盒，特别是用于癌症DNA甲基化检测试剂盒及其使用方法，涉及甲基化靶标、检测引物和探针、捕获试剂、检测试剂及试剂盒的应用，所述癌症优选为结直肠癌所述癌前病变是进展期腺瘤(AA)。技术背景
结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是世界第三大恶性肿瘤，占全部恶性肿瘤的10％，其在恶性肿瘤中居第3位，严重威胁着人类的健康。近年来，随着我国人民生活水平提高，饮食结构和习惯改变，预期寿命延长，人口老龄化趋势等的影响，近年来我国结直肠癌发病率逐年上升，在男性肿瘤发病率中排第5位，在女性肿瘤发病率中排第4位；尤其在近十年，结直肠癌发病率的增加每年>4％，远超2％的国际水平，估计每年约有40万新发病例，在我国消化系统恶性肿瘤中位列第二。结直肠癌在男性和女性肿瘤死亡率中都排在第5位。结直肠癌通常由癌前息肉经过一系列遗传学和表观遗传学改变及组织学与形态学的变化缓慢发展而来，大多数结直肠肿瘤生长缓慢、保持沉默或无症状，直到它们达到了一定的大小或发展阶段。因此，结直肠癌是可以通过筛查进行干预的理想靶标。早期结直肠癌患者手术5年生存率可高达90％以上，中、晚期患者5年生存率仅10％左右，而临床诊断的结直肠癌约80％为中晚期，这是导致其死亡率居高不下的关键因素之一。经有效治疗的早期结直肠癌患者其发病率降低60％，病死率降低80％，因此结直肠癌的早期发现、早期诊断及早期治疗显得尤为重要。
由于93％的结直肠癌源于腺瘤，早期多无特征性症状，而从腺瘤发展到癌症需要大约10年，这就为早期筛查提供了时间基础。因此，对结直肠癌高危人群的筛查，对结直肠癌患者的早发现、早诊断，从而实现结直肠癌患者早治疗，是提高患者总体生存率的重要方面。
腺瘤可以分为非进展期腺瘤(NAA)和进展期腺瘤(AA：指直径＞10mm或含有绒毛成份或有重度异型增生或高级别上皮内瘤变)。进展期腺瘤(AA)有较高风险继发结直肠癌，而非进展期腺瘤(NAA)发生继发性结直肠癌的风险与未发现息肉者相当。因此更有意义地是早发现、早诊断进展期腺瘤(AA)。
非专利文献1(“Methylation of NEUROG1in Serum Is a Sensitive Marker forthe Detectionof Early Colorectal Cancer”,Herbst et al,The American Journal ofGASTROENTEROLOGY,2011；106:1110–1118；doi:10.1038/ajg.2011.6)公开了一种通过NEUROG1检测早期结直肠癌的方法。在91％的特异性时，检测大肠癌的敏感性达到61％。
ES2683866A1公开了一种体外诊断和筛选晚期结直肠癌和腺瘤的方法，在人体生物液体中进行检测，其包括确定sCD26和NDKA蛋白质的总体水平、甲基化基因NEUROG1的百分比联合测定。
RU2630669C1公开了一种鉴定结肠和直肠恶性病变的方法，其中例举了数十种结直肠癌肿瘤标志物基因组，例如ADHFE1，ALX4，CNRIP1，EID3，ELMO1，ESR1，FBN1，HLTF，LAMA1，NEUROG1，NGFR，RARB，RXRG，RYR2，SDC2，SEPT9，SFRP2，SOCS3，SOX17，THBD，TMEFF2，UCHL1和VIM等，并具体给出了SEPT9的样本检测结果。
总体而言，目前结直肠癌筛查方法主要有四种：1)结肠镜检查，是CRC早期筛查的传统方法，也是结直肠癌检测和确诊的金标准。但因其需要复杂的肠道准备过程、具有一定的侵入性且需要专业的技术人员，导致它在中国的筛查依从性低；2)大便潜血试验(FOBT)，该方法虽然无创，但它对晚期肿瘤(27.1％)和侵袭性癌(65.8％)的敏感性较低；3)大便隐血免疫化学检测(FIT)，该方法无创，对结直肠癌的敏感性和特异性分别为79％和94％，但对进展期腺瘤的敏感性不足，一般仅20％～30％；4)血浆Septin9甲基化基因检测，该方法无创、方便，但它对I期CRC敏感性只有45％，对癌前息肉检测的敏感性极低(5％～15％)，说明该标记物识别癌前病变的能力差。因此结直肠癌及癌前病变(特别是进展期腺瘤AA)的检测亟需一种高灵敏性和特异性的无创检测方法。
粪便脱落细胞及基因检测(sDNA)是目前结直肠癌及进展期腺瘤筛查的最前沿技术，是一种非侵入性的筛查方法，与正常大肠黏膜相比，结直肠癌及进展期腺瘤细胞更新代谢速度明显增快，脱落细胞随之增加，通过对粪便脱落细胞DNA定量分析，可有效筛查出部分结直肠癌及进展期腺瘤。研究表明，患者粪便中脱落的肿瘤细胞中的甲基化基因和肿瘤组织本身的甲基化基因有很高的一致性。甲基化是一种表观遗传修饰，其异常变化可引起DNA构象及DNA与蛋白质相互作用方式等发生改变，从而控制基因表达。DNA甲基化在基因表达调控、细胞增殖分化、发育和基因印记等方面起着重要作用，与肿瘤的发生与发展有密切关系。研究表明，DNA甲基化异常是癌症发生的早期事件，在结直肠癌发生和发展中存在DNA甲基化水平和模式的改变，寻找特异性的甲基化片段，对结直肠癌的早期检测起到决定性的作用。
CN110343764A提供了一种检测结直肠癌相关基因甲基化的检测试剂的应用和试剂盒，所述相关基因选自SDC2基因和TFPI2基因中的一种和两种的组合。该申请能够检测结直肠癌和结直肠腺瘤，但是其对腺瘤的灵敏性低，即使联合检测两种基因的甲基化，灵敏性也仅为73-78％，而且更重要的是，其无法区分进展期腺瘤(AA)和非进展期腺瘤(NAA)。由于腺瘤中非进展期腺瘤(NAA)占绝大多数，因此其临床指导意义存在局限。
为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是：提供一种高敏感性、高特异性的检测癌症、特别是结直肠癌，更特别是进展期腺瘤(AA)的试剂盒。
发明内容
：本发明的主要目的，在于提供一种用于癌症和/或癌前病变、特别是结直肠癌、结直肠进展期腺瘤(AA)相关基因甲基化位点检测的试剂盒。
在一个方面，本发明提供一种癌症和/或癌前病变检测试剂盒，其包括用于检测NeuroG1基因甲基化的试剂和用于检测SDC2基因甲基化的试剂，所述癌症优选是结直肠癌，所述癌前病变是进展期腺瘤(AA)。
其中，用于检测NeuroG1基因甲基化的试剂和用于检测SDC2基因甲基化的试剂，可以根据探针法或者染料法来设计。从特异性和准确性的角度出发，优选根据探针法设计。
如前所述，在现有技术中，存在通过单独检测SDC2基因甲基化或者单独检测NeuroG1基因甲基化来鉴定结直肠癌的方法。但是这些方法特异性和灵敏度不足(尤其是进展期腺瘤)，特别是阴性预测值过低，总符合率低，这限制了它们的实际应用。本发明人令人惊奇地发现，通过联合检测NeuroG1基因甲基化和SDC2基因甲基化，能够极大地提高特异性、灵敏度，并且提高了阴性预测值，使得总符合率超过85％，从而改善了检测结果。
在一个优选实施方式中，所述用于检测NeuroG1基因甲基化的试剂针对NeuroG1DNA序列中的以下一个或多个检测区段：区段A(SEQIDNO:21)、区段A(SEQIDNO:22)和区段C(SEQIDNO:13)，和/或
所述用于检测SDC2基因甲基化的试剂针对SDC2 DNA序列中的检测区段D(SEQIDNO:17)；
优选地，所述用于检测NeuroG1基因甲基化的试剂针对以下一个或多个检测区段：区段A1(SEQIDNO:21的56-114位)、区段A2(SEQIDNO:21的151-227位)、区段A3(SEQIDNO:21的254-320位)、区段B1(SEQIDNO:22的91-170位)、区段B2(SEQIDNO:22的206-275位)、区段B3(SEQIDNO:22的273-344位)、区段C1(SEQIDNO:13的22-95位)、区段C2(SEQIDNO:13的84-150位)和区段C3(SEQIDNO:13的160-222位)；和/或
优选地，所述用于检测SDC2基因甲基化的试剂针对SDC2 DNA序列中的检测区段：区段D1(SEQIDNO: 17的141-194)、区段D1(SEQIDNO:17的183-256)和区段D3(SEQIDNO:17的259-326位)；
更优选地，所述试剂盒所含的用于检测NeuroG1基因甲基化状态或水平的试剂和用于检测SDC2基因甲基化状态或水平的试剂针对选自由以下组成的组中的检测区段的组合：C1D2、B3D2、B1D2、C3D2、A2D2、C1D3、C1D1、B3D3、B3D1、C3D3、B1D3、C3D1和B1D1。其中C1D2表示区段C1和区段D2的组合，其它以此类推。
特异位点的DNA甲基化检测方法主要包括：1、甲基化特异性PCR(MS-PCR)；2、亚硫酸氢盐处理+测序；3、联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)；4、荧光定量法(Methylight)；5、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析；6、焦磷酸测序。本文以具备高通量和高敏感性，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差的Methylight作为实例进行。但是本发明不限于此，也可以采用其他合适的DNA甲基化检测方法。
基于Methylight方法，本发明检测的NeuroG1基因DNA序列转化方式如下所示，可通过检测DNA正反链的甲基化序列的全序列实现该基因甲基化状态或水平的检测。
NeuroG1DNA正链序列
acaCGactggcctcaggaccccttaagtaccCGgCGcaacaatgggCGcccccctcccttgccacctcCGccccCGCGgcagccCGggtgaatggagCGaggCGgcaggtcatcccCGtgcagCGccCGggtatttgcataatttatgctCGCGggaggcCGccatCGcccctcccccaaccCGgagtgtgccCGtaattacCGcCGgccaatCGgCGgCGtCGCGCGgcccCGggagtCGgctCGggctaagctggccagggCGtctccaggcagtgaaacagaggCGgggtCGgCGggCGattagCGgcCGaggcaCGctcctcttggggCGggctgggCGcccctCGctggggtgggaCG(SEQIDNO:13)
NeuroG1正链甲基化序列
TtCGgCGtaataatgggCGttttttttttttgttattttCGttttCGCGgtagttCGggtgaatggagCGaggCGgtaggttattttCGtgtagCGttCGggtatttgtataatttatgttCGCGggaggtCGttatCGttttttttttaattCGgagtgtgttCGtaattatCGtCGgttaatCGgCGgCGtCGCGCGgtttCGggagtCGgttCGggttaagttggttagggCGtttttaggtagtgaaatagaggCGgggtCGgCGggCGattagCGgtCGaggtaCGttttttttggggCGggttgggCGtttttCGttggggt(SEQIDNO:14)
NeuroG1DNA反链序列
CGtcccaccccagCGaggggCGcccagccCGccccaagaggagCGtgcctCGgcCGctaatCGccCGcCGacccCGcctctgtttcactgcctggagaCGccctggccagcttagccCGagcCGactccCGgggcCGCGCGaCGcCGcCGattggcCGgCGgtaattaCGggcacactcCGggttgggggaggggCGatggCGgcctccCGCGagcataaattatgcaaataccCGggCGctgcaCGgggatgacctgcCGcctCGctccattcaccCGggctgcCGCGggggCGgaggtggcaagggaggggggCGcccattgttgCGcCGggtacttaaggggtcctgaggccagtCGtgt(SEQIDNO:15)
NeuroG1反链甲基化序列
CGttttattttagCGaggggCGtttagttCGttttaagaggagCGtgtttCGgtCGttaatCGttCGtCGatttCGtttttgttttattgtttggagaCGttttggttagtttagttCGagtCGattttCGgggtCGCGCGaCGtCGtCGattggtCGgCGgtaattaCGggtatatttCGggttgggggaggggCGatggCGgtttttCGCGagtataaattatgtaaatattCGggCGttgtaCGgggatgatttgtCGtttCGttttatttattCGggttgtCGCGggggCGgaggtggtaagggaggggggCGtttattgttgCGtCGggtatttaaggggttttgaggttagtCGtgt(SEQIDNO:16)
基于Methylight方法，本发明检测的SDC2基因DNA序列转化方式如下所示，可通过检测DNA正反链的甲基化序列的全序列实现该基因甲基化状态或水平的检测。
SDC2 DNA序列
AccagaaactgaacctCGgcaCGggaaaggagtcCGCGgaggagcaaaaccacagcagagcaagaagagcttcagagagcagccttccCGgagcaccaactcCGtgtCGggagtgcagaaaccaacaagtgagagggCGcCGCGttccCGgggCGcagctgCGggCGgCGggagcaggCGcaggaggaggaagCGagCGccccCGagcccCGagccCGagtcccCGagcctgagcCGcaatCGctgCGgtactctgctcCGgattCGtgtgCGCGggctgCGcCGagCGctgggcaggaggcttCGttttgccctggttgcaagcagCGgctgggagcagcCGgtccctggggaatatgCGgCGCGCGtggatcctgctcaccttgggcttggtggcctgCGtgtCGgCGgagtCGagagcagagctgacatctgat(SEQIDNO:17)
SDC2甲基化序列
AttagaaattgaatttCGgtaCGggaaaggagttCGCGgaggagtaaaattatagtagagtaagaagagttttagagagtagttttttCGgagtattaatttCGtgtCGggagtgtagaaattaataagtgagagggCGtCGCGttttCGgggCGtagttgCGggCGgCGggagtaggCGtaggaggaggaagCGagCGttttCGagtttCGagttCGagttttCGagtttgagtCGtaatCGttgCGgtattttgtttCGgattCGtgtgCGCGggttgCGtCGagCGttgggtaggaggtttCGttttgttttggttgtaagtagCGgttgggagtagtCGgtttttggggaatatgCGgCGCGCGtggattttgtttattttgggtttggtggtttgCGtgtCGgCGgagtCGagagtagagttgatatttgat(SEQIDNO:18)
此外，也可通过检测DNA正反链的甲基化序列的部分序列实现基因甲基化状态或水平的检测，如NeuroG1可选择
cgtgcagcgcccgggtatttgcataatttatgctcgcgggaggccgccatcgcccctcccccaacccggagtgtgcccgtaattac cg(SEQIDNO:19)，SDC2可选择
gaggaagCGagCGccccCGagcccCGagccCGagtcccCGagcctgagcCGcaatCGctgCGgtactctg(SEQIDNO:20)。
在一个优选实施方式中，所述用于检测NeuroG1基因甲基化的试剂包括选自由以下组成的组中的引物对：SEQIDNO:31和SEQIDNO: 32；SEQIDNO:34和SEQIDNO:35；SEQIDNO:37和SEQIDNO:38；SEQIDNO:40和SEQIDNO:41；SEQIDNO:43和SEQIDNO:44；SEQIDNO:46和SEQIDNO:47；SEQIDNO:49和SEQIDNO:50以及SEQIDNO:52和SEQIDNO:53，优选SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。
在一个优选实施方式中，所述用于检测SDC2基因甲基化的试剂包括选自由以下组成的组中的引物对：SEQIDNO:1和SEQIDNO:2；SEQIDNO:55和SEQIDNO:56；以及SEQIDNO:58和SEQIDNO:59，优选SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。
但是，需要指出的是，本发明的引物和/或引物对并不限于上述那些。由于NeuroG1基因和SDC2基因都是已知的。本领域技术人员可以根据已知基因并参考上述引物对设计合适的引物，而无需付出过多的劳动。
在一个优选实施方式中，所述用于检测NeuroG1基因甲基化的试剂包括选自由以下组成的组中的捕获探针：SEQIDNO:8，SEQIDNO:94至SEQIDNO:101，优选SEQIDNO:8。
在一个优选实施方式中，所述用于检测SDC2基因甲基化的试剂包括选自由以下组成的组中的捕获探针：SEQIDNO:7，SEQIDNO:102和SEQIDNO:103，优选SEQIDNO:7。
但是，需要指出的是，本发明的捕获探针并不限于上述那些。由于NeuroG1基因和SDC2基因都是已知的。本领域技术人员可以根据已知基因并参考上述捕获探针设计合适的捕获探针，而无需付出过多的劳动。
另外，需要指出的是，捕获探针不是必需的。在例如组织、血液、血浆、血清等样品中，可以不使用捕获探针。而在诸如粪便样本等复杂样本中，干扰因素比较多，为了能够尽可能避免这些干扰因素，获得所需要的DNA，优选在从粪便样本中提取DNA的步骤中使用捕获探针来发挥上述功能。
在一个优选实施方式中，所述用于检测NeuroG1基因甲基化的试剂包括选自由以下组成的组中的检测探针：SEQIDNO:11、SEQIDNO:33、SEQIDNO:36、SEQIDNO:39、SEQIDNO:42、SEQIDNO:45、SEQIDNO:48、SEQIDNO:51和SEQIDNO:54，优选SEQIDNO:11。
在一个优选实施方式中，所述用于检测SDC2基因甲基化的试剂包括选自由以下组成的组中的检测探针：SEQIDNO:10、SEQIDNO:57和SEQIDNO：60，优选SEQIDNO:10。
但是，需要指出的是，本发明的检测探针并不限于上述那些。由于NeuroG1基因和SDC2基因都是已知的。本领域技术人员可以根据已知基因并参考上述检测探针设计合适的检测探针，而无需付出过多的劳动。
在一个优选实施方式中，所述试剂盒用于检测来自受试对象的样品中的NeuroG1和SDC2基因的甲基化，所述样品优选为组织样品或排泄物，所述组织样品优选是肠组织，所述排泄物优选是粪便。
在一个优选实施方式中，所述试剂盒用于检测来自受试对象的样品中的NeuroG1和SDC2基因的甲基化，所述样品优选为体液，优选所述体液是血液、痰液、尿液或唾液。
在另一个方面，本发明提供用于检测NeuroG1基因甲基化的试剂和用于检测SDC2基因甲基化的试剂在制备癌症和/或癌前病变检测试剂盒中的应用，所述癌症优选为结直肠癌，所述癌前病变是进展期腺瘤(AA)。
在又一个方面，本发明提供上述引物对、捕获探针或检测探针在制备甲基化检测试剂或试剂盒、或者癌症和/或癌前病变检测试剂盒中的应用，所述癌症优选为结直肠癌，所述癌前病变是进展期腺瘤(AA)。
另外，本发明还提供了一种检测癌症和/或癌前病变的方法，该方法包括(a)检测来自受试者的样品中的NeuroG1基因甲基化，和(b)检测所述样品中的SDC2基因甲基化；这两个步骤没有先后顺序，可以同时进行，也可以依次进行。
其中，(a)检测来自受试者的样品中的NeuroG1基因甲基化，和(b)检测所述样品中的SDC2基因甲基化，可以根据探针法或者染料法来进行。从特异性和准确性的角度出发，优选根据探针法进行，
所述癌症优选为结直肠癌，所述癌前病变是进展期腺瘤(AA)。
更具体而言，
1、本发明的目的在于提供一种特异性强、敏感度高的癌症、特别是结直肠肿瘤、更特别是进展期腺瘤(AA)检测试剂和试剂盒，检测基因为NeuroG1和SDC2基因；
2、本发明的另一个目的在于提供NeuroG1和SDC2基因甲基化检测中可以用于结直肠肿瘤早筛、辅助诊断的检测区段；
3、本发明的另一个目的在于提供检测上述检测区段的一系列引物、探针，及其在制备检测结直肠肿瘤试剂或试剂盒中的应用。
4、本发明的另一个目的在于提供捕获上述检测区段的一系列捕获序列，及其在制备检测结直肠肿瘤试剂或试剂盒中的应用。
5、本发明的又一目的还在于提供一种检测癌症，特别是结直肠癌及癌前病变、更特别是进展期腺瘤(AA)的方法，该方法通过联合检测NeuroG1和SDC2基因的甲基化而进行。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的甲基化检测试剂包括针对NeuroG1和SDC2基因组合中的每个基因的启动子区或所述启动子区附近区域的CpG岛获得的捕获序列、引物和/或探针。通常来说，CpG岛是指富含CpG二核苷酸的一些区域，通常位于启动子及其附近的区域，本发明中的CpG岛，不仅指启动子及其附近的区域富含CpG二核苷酸，也包括杂合甲基化的CpG位点，或者是孤立的CpG位点。
本发明中的“NeuroG1”又称“NeuroD3或neurogenin1或NeuroG1N1”。位于人类基因组5号染色体上。
本发明中的“检测”同诊断，除了结直肠肿瘤的早期诊断，还包括结直肠肿瘤中期和晚期的诊断，且也包括结直肠进展期腺瘤的检测。其中，早期诊断指的是在肠癌细胞转移之前发现癌症、甚至是肠细胞癌化之前提示肠癌风险，优选在可观察到组织或者细胞的形态学变化之前。
所述的NeuroG1和SDC2基因组合的甲基化联合检测试剂可以是现有技术中的甲基化检测试剂。现有技术中，已经有多种方法可以检测目的基因的甲基化，如甲基化特异性PCR(MSP)、甲基化特异性定量PCR(qMSP)、甲基化DNA特异性结合蛋白的PCR，定量PCR以及DNA芯片、甲基化敏感的限制性内切酶、重亚硫酸盐测序法或者焦磷酸测序等等。每种检测方法均有其相对应的试剂，这些试剂均可以用于本发明检测NeuroG1和SDC2基因组合的甲基化。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明提供的试剂盒还包括试剂盒中的常用试剂，如qMSP中常用转化剂，用于将非甲基化的胞嘧啶碱基都转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶碱基保持不变。所述的转化剂无特别限制，现有技术中报道的可实现胞嘧啶到尿嘧啶转化的试剂均可以，如肼盐、重亚硫酸氢盐和亚硫酸氢盐(例如偏亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铯、亚硫酸氢铵等)中的一种或几种。又如扩增NeuroG1基因中常用的DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+离子和缓冲液等等。
本发明还提供了上述的甲基化检测试剂、试剂盒、捕获序列、引物、探针在制备甲基化检测的试剂或试剂盒，或者制备检测癌症、特别是结直肠肿瘤的试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供了上述的甲基化检测试剂、试剂盒、捕获序列、引物、探针在甲基化检测中的应用，或者在检测癌症、特别是结直肠肿瘤中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明所述的组织为肠组织。
在本发明的一些具体实施方案中，所述排泄物为粪便，所述体液为血液、痰液、尿液或唾液。
与现有的检测肠癌的标志物相比，本发明提供的引物、捕获试剂、核酸探针以及NeuroG1和SDC2基因组合和技术方案能够以极高的敏感性和特异度来检测结直肠癌，本发明的技术方案对结直肠癌的检测敏感性为97.8％，对进展期腺瘤的敏感度为89.5％，特异性为82.2％，阳性预测值为90.59％，阴性预测值为88.09％。具体有以下几点：
1、本发明的技术方案对NeuroG1和SDC2基因组合的甲基化进行联合检测，该方法可以实现对多基因的联合检测，极大的降低了试验的复杂程度，提高了检测效率。
2、本技术发明中，NeuroG1和SDC2基因组合的甲基化检测试剂在粪便标本中能够在特异性为82.2％时，检测出97.8％的结直肠癌和89.5％的进展期腺瘤，仅以粪便作为检测样本，对结直肠癌进行可靠的诊断。粪便样品获得非常容易，取样无创简单，而且不会对病人造成任何的痛苦和不便。本发明可以改善阴性预测值，极大地提高总符合率。
3、上述的一个技术方案中含有NeuroG1和SDC2基因组合的甲基化检测试剂，提取检测方法能非常方便、准确地判断出结直肠癌高风险(结直肠癌、进展期腺瘤)和结直肠癌低风险(非进展期腺瘤、健康人)，该基因组合的甲基化检测试剂有望用于粪便基因检测试剂盒，并服务于肠癌的临床检测。
4、上述的一个技术方案中的试剂/试剂盒是通过甲基化水平来检测和诊断癌症，越来越多的研究证实甲基化改变是肿瘤发生过程中的早期事件，检测甲基化异常更易发现早期病变。
附图说明
图1显示SDC2石蜡组织检测Ct值散点图
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
实施例1
NeuroG1、SDC2基因与结直肠癌相关启动子区域筛选。
在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载NeuroG1、SDC2基因序列，使用MethPrimer分析CpG岛集中区域，针对该区域分别设计扩增引物，采用结直肠癌、进展期腺瘤、非进展期腺瘤患者石蜡组织样本扩增，扩增子送苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，测序引物及扩增子见表1，从中筛选出结直肠癌相关启动子区域。
测序结果显示结直肠癌样本与NeuroG1、SDC2基因的甲基化序列相关位点如下：
NeuroG1-ⅠDNA序列：
GTAGGTGAAGTCTTmCGGAGGmCGGCTGGGCTACTGGGGTCAGAGAGmCGGGGAGGmCGGmCGGmCGGCACCTGAGCCCCAGGACTCmCGmCGTmCGCTGGmCGGGGCTTGGGGGACmCGGGCAGGCAGGGGAmCGCACTGmCGGmCGGCAGGAGGmCGCTCCmCGGGCACmCGCCTCmCGGGCAGCCCTTGATCmCGCCAGGmCGCAGTGTCTmCGGCCAGAGCCCAGATGTAGTTGTAGGmCGAAGmCGCAGmCGTCTmCGATTTTGGTGAGCTTGGTGTmCGTmCGGGGAAmCGAGGGCAGCAmCGCTGmCGCAGTGmCGTCCAGGGCmCGmCGTTCAAGTTGTGCATGmCGGTTGmCGCTmCGmCGATmCGTTGGCCTTGAmCGmCGCmCGGCTCCTGmCGCAGmCGA(SEQIDNO:21)
NeuroG1-ⅡDNA序列：
CmCGGCTCCTGmCGCAGmCGAGTGCAGCAGmCGCCTmCGGAGmCGGACCmCGmCGTCmCGGCmCGmCGGmCGCmCGCmCGCCTCTCCTGCTmCGTmCGTCCTGTGCCCCTGGAACCTCAGAmCGCCmCGGGAGATATTGGGmCGmCGCCCCTGmCGGGCmCGGmCGmCGGGmCGGCCCmCGAAGmCGGAGGCTGCCTGTTGGAGTCTGGCACAGTCTTCCTmCGTmCGGTGAGGAAGCmCGGATAGGTCACTGCmCGCTGCTGCTGGmCGCAGTmCGAGGTmCGGAGATGCAGGTCTCAAGGmCGGGCTGGCATmCGTTGmCGCTGTGCAGGACmCGAmCGGACAGATAGAAAGGmCGCTCAGAGmCGCTGCAGCCmCGGACTGAGGGCAGAG(SEQIDNO:22)
NeuroG1-IIIDNA序列：
ACAmCGACTGGCCTCAGGACCCCTTAAGTACCmCGGmCGCAACAATGGGmCGCCCCCCTCCCTTGCCACCTCmCGCCCCmCGmCGGCAGCCmCGGGTGAATGGAGmCGAGGmCGGCAGGTCATCCCmCGTGCAGmCGCCmCGGGTATTTGCATAATTTATGCTmCGmCGGGAGGCmCGCCATmCGCCCCTCCCCCAACCmCGGAGTGTGCCmCGTAATTACmCGCmCGGCCAATmCGGmCGGmCGTmCGmCGmCGGCCCmCGGGAGTmCGGCTmCGGGCTAAGCTGGCCAGGGmCGTCTCCAGGCAGTGAAACAGAGGmCGGGGTmCGGmCGGGmCGATTAGmCGGCmCGAGGCAmCGCTCCTCTTGGGGmCGGGCTGGGmCGCCCCTmCGCTGGGGTGGGAmCG(SEQIDNO:13)
SDC2-ⅠDNA序列：
ACCAGAAACTGAACCTmCGGCAmCGGGAAAGGAGTCmCGmCGGAGGAGCAAAACCACAGCAGAGCAAGAAGAGCTTCAGAGAGCAGCCTTCCmCGGAGCACCAACTCmCGTGTmCGGGAGTGCAGAAACCAACAAGTGAGAGGGmCGCmCGmCGTTCCmCGGGGmCGCAGCTGmCGGGmCGGmCGGGAGCAGGmCGCAGGAGGAGGAAGmCGAGmCGCCCCmCGAGCCCmCGAGCCmCGAGTCCCmCGAGCCTGAGCmCGCAATmCGCTGmCGGTACTCTGCTCmCGGATTmCGTGTGmCGmCGGGCTGmCGCmCGAGmCGCTGGGCAGGAGGCTTmCGTTTTGCCCTGGTTGCAAGCAGmCGGCTGGGAGCAGCmCGGTCCCTGGGGAATATGmCGGmCGmCGmCGTGGATCCTGCTCACCTTGGGCTTGGTGGCCTGmCGTGTmCGGmCGGAGTmCGAGAGCAGAGCTGACATCTGAT(SEQIDNO:17)
备注：mCG表示CpG岛的C发生了甲基化修饰。
表1
备注：寡核苷酸名称中F指Forward primer，即上游引物；R指Reverse primer,即下游引物。
实施例2
根据上述筛选出的区域，设计用于结直肠癌或肠进展期腺瘤辅助诊断的试剂盒，其包括用于检测结直肠癌相关基因甲基化状态或水平的检测试剂，其中，结直肠癌相关基因为NeuroG1基因、SDC2基因。
NeuroG1基因检测靶区域选自下列区段的任意一种或几种的组合：区段A、区段B、区段C。三个区段分别选自NeuroG1-Ⅰ、NeuroG1-Ⅱ、NeuroG1-III的DNA全序列及其互补序列。
SDC2基因检测靶区域选自SDC2-Ⅰ的DNA全序列及其互补序列。
实施例3
本实施例提供的用于结直肠癌或肠进展期腺瘤辅助诊断的试剂盒与实施例2基本相同，不同的是，在本实施例中，对实施例2筛选出的区域进一步筛选如下：
区段A选自NeuroG1-Ⅰ的DNA部分序列及其互补序列。具体的，
区段A1选自NeuroG1-Ⅰ：56-114
区段A2选自NeuroG1-Ⅰ：151-227
区段A3选自NeuroG1-Ⅰ：254-320
区段B选自NeuroG1-Ⅱ的DNA部分序列及其互补序列。具体的，
区段B1选自NeuroG1-Ⅱ：91-170
区段B2选自NeuroG1-Ⅱ：206-275
区段B3选自NeuroG1-Ⅱ：273-344
区段C选自NeuroG1-III的DNA部分序列及其互补序列。具体的，
区段C1选自NeuroG1-III：22-95
区段C2选自NeuroG1-III：84-150
区段C3选自NeuroG1-III：160-222
区段D选自SDC2的DNA部分序列及其互补序列。具体的，
区段D1选自SDC2-Ⅰ：141-194
区段D2选自SDC2-Ⅰ：183-256
区段D3选自SDC2-Ⅰ：259-326
进一步地，本实施例的试剂盒还包括检测上述各靶区域的引物对和荧光探针，具体序列见下表2。
表2
备注：寡核苷酸名称中F指Forwardprimer，即上游引物；R指Reverse primer,即下游引物针。
实施例4
一种使用实施例2-3的试剂盒进行结直肠癌或结直肠进展期腺瘤辅助诊断的方法，如下：
1.DNA提取：
a.组织样本：
使用商品化试剂盒：采用天根石蜡组织提取试剂盒提取DNA，测定浓度后，取1ug硫化处理。
b.血液样本：
使用商品化试剂盒：2mL血浆样本，采用凯捷商品化试剂盒(QIAampDNA BloodMini Kit，货号51104)提取cfDNA，按照说明书操作。
c.粪便样本：
按照专利CN110699427A实施例2的操作步骤进行处理。
d.尿液样本：
使用商品化试剂盒：起始4mL尿液，首先3500rpm离心20分钟，弃掉上清，保留沉渣。尿沉渣用500ul尿液漂洗液重悬，3500rpm离心10分钟，弃掉上清，然后再用500ul尿液漂洗液重悬，采用天根商品化试剂盒(血液/组织/细胞基因组提取试剂盒，货号DP304-02)提取DNA，按照说明书操作。
2.DNA硫化转化：
使用商品化的试剂盒：ZYMO(EZ DNA Methylation Gold Kit)，按照说明书操作，硫化纯化DNA片段。
3.PCR检测
(1)检测体系：见下表3
表3
(2)PCR反应条件：如下表4
表4
所采用的仪器为Roche LightCycler 480II。
结果判读：对于同一个样本，NeuroG1和SDC2分别采用任意一个或多个区域联检时：
每个基因的Ct值≤CutOff值，则该样本判读为该基因阳性；每个基因的Ct值＞CutOff值或不扩增，则该样本判读为该基因阴性；
每个基因的任一检测区域为阳性，则样本判读为该基因阳性；每个基因的全部检测区域为阴性，则样本判读为该基因阴性；
任一基因判读为阳性，则样本判读为阳性；两个基因均判读为阴性，则样本判读为阴性。
实施例5NeuroG1不同检测区域在结直肠癌诊断效果上的差异
样本类型：45例具有临床诊断结果的组织样本，其中结直肠癌(CRC)、进展期腺瘤(AA：指直径＞10mm或含有绒毛成份或有重度异型增生或高级别上皮内瘤变)和非进展期腺瘤(NAA)石蜡组织各15例。
试验方法：使用实施例3提供的试剂盒，采用实施例4提供的使用方法进行检测，其中检测NeuroG1-Ⅰ、NeuroG1-Ⅱ、NeuroG1-III的引物、探针见实施例3表2。
实验结果：如下表5、表6所示(检出数/总数)，各区段检测效果比较接近，尤以A1、A2、B2、B3、C1、C3检测效果较优。
表5
表6、NeuroG1检测石蜡组织样本信息
实施例6SDC2不同检测区域在结直肠癌和其进展期腺瘤诊断效果上的差异
样本类型：30例具有临床诊断结果的组织样本，其中CRC、AA和NAA石蜡组织各10例。
试验方法：使用实施例2提供的试剂盒，采用实施例4提供的使用方法进行检测，其中检测SDC2-Ⅰ、SDC2-Ⅱ、SDC2-III的引物、探针见实施例3表2。
实验结果：如下表7、图1所示：散点图结果显示，投入等同量的甲基化DNA进行检测，CRC和AA石蜡组织样本的检测Ct值与NAA石蜡组织样本检测的Ct值差异明显(p<0.05)，检测D区域各段效果基本一致。
表7、SDC2检测石蜡组织样本信息
实施例7、NeuroG1和SDC2不同检测区域联合在结直肠癌和其进展期腺瘤诊断效果上的差异
试验1：在粪便样本上的检测效果
样本类型：127例具有临床诊断结果的粪便样本，其中CRC44例、AA 38例和NAA 21例、健康人24例，均经肠镜或病理确认。
试验方法：使用实施例2提供的试剂盒，采用实施例4提供的使用方法进行检测，其中检测NeuroG1、SDC2的引物、探针见实施例3表2，捕获探针如下表8。
表8
备注：寡核苷酸名称中Capure指捕获探针。
结果显示在以下表9-13中。
如表9所示，在综合分析总符合率、阳性预测值和阴性预测值的情况下，C1和D2分别是NeuroG1和SDC2基因各区段检测中最优的扩增子，总符合率分别为73.23％和80.31％，虽然阳性预测值都超过90％，然而阴性预测却仅有58.21％和66.13％。
为了提高检测结果与临床的符合率，对双基因各个扩增子进行两两组合，结果显示C1D2、B3D2、B1D2、C3D2、A2D2、C1D3、C1D1、B3D3、B3D1、C3D3、B1D3、C3D1、B1D1组合的检测灵敏度均超过90％，特异性超过80％，阳性预测值89.16％-90.59％，阴性预测值81.81％-88.09％，总符合率在86.61％-89.76％，检测结果优于上述任一检测区段。
表9、NeuroG1和SDC2粪便样本单独检测、各区段联合检测结果
表11、进展期腺瘤粪便样本信息
试验2：在血液样本上的检测效果
样本类型：选取30例CRC患者血浆样本，30例健康人血浆样本(均经肠镜或病理确认)，使用试剂盒处理血浆提取DNA，硫化使用ZYMO试剂盒，并按如下所述技术方案操作，
试验方法：使用实施例2提供的试剂盒，采用实施例4提供的使用方法进行检测，其中检测引物、探针同实施例4，检测组合为C1D2。
结果如表14所示，NeuroG1、SDC2基因甲基化联合检测，对CRC敏感性高达86.6％，对健康人特异性为83.3％。
表14、血浆样本检测结果
试验3：在尿液样本上的检测效果
样本类型：85例具有临床诊断结果的尿液样本，其中CRC30例、AA 22例和NAA 18例、健康人15例，均经肠镜或病理确认。
试验方法：使用实施例2提供的试剂盒，采用实施例4提供的使用方法进行检测，其中检测引物、探针同实施例4，检测组合为C1D2。
结果如表15所示，NeuroG1、SDC2基因甲基化联合检测，对CRC敏感性高达90％，AA敏感性为81.8％，对NAA和健康人特异性分别为88.9％和93.8％，总特异性达到90.9％。
表15、尿液样本检测结果
实施例8、扩增靶区域不同引物对的检测效果
样本类型：30例具有临床诊断结果的组织样本，其中CRC、AA和NAA三种组织各10例。
试验方法：使用实施例2提供的试剂盒，采用实施例4提供的使用方法进行检测，其中检测引物、探针见下表16。
优选出来的基因检测区域的不同引物，备选引物检测结果类似，效果差异不大(表17)。
表16
备注：寡核苷酸名称中F指Forward primer，即上游引物；R指Reverse primer,即下游引物；P指Probe，即探针。
表17
实施例9、扩增靶区域不同捕获探针捕获效果评估
样本类型：10例具有临床诊断结果的CRC患者粪便样本。
试验方法：使用实施例2提供的试剂盒，采用实施例4提供的使用方法进行检测，其中捕获探针见下表18。
结果如表19所示，显示C1-c1和D2-1捕获探针效果较好，其Ct值提前1-2个。
表18
表19
编号
C1-c1
C1-c2
C1-c3
C1-c4
D2-c1
D2-c2
D2-c3
D2-c4
CRC01
31.59
31.43
33.39
34.32
31.32
32.84
33.64
33.65
CRC02
38.18
39.17
40.98
39.12
34.11
35.88
35.96
36.97
CRC03
不扩增
不扩增
不扩增
不扩增
34.88
35.82
36.34
35.69
CRC04
不扩增
不扩增
不扩增
不扩增
31.59
33.58
32.23
32.21
CRC05
32.29
33.82
34.72
33.83
26.03
28.38
28.47
28.69
CRC06
38.65
40.38
40.12
40.96
32.05
34.14
34.97
34.07
CRC07
34.74
36.81
35.84
36.21
27.87
29.30
28.27
28.08
CRC08
不扩增
不扩增
不扩增
不扩增
31.91
32.47
33.30
33.30
CRC09
35.32
36.85
37.08
36.47
30.01
32.95
31.85
32.99
CRC10
不扩增
不扩增
不扩增
不扩增
29.27
30.36
31.24
30.78
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏为真生物医药技术股份有限公司
苏州普瑞迈德医学检验所有限公司
<120> 一种癌症和/或癌前病变检测试剂盒
<130> GAI20CN7603
<160> 104
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 1
ggaggaggaa gcgagcg 17
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 2
caaaataccg caacgattac g 21
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 3
tcgtgtagcg ttcgggt 17
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 4
cactccgaat taaaaaaaaa acg 23
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 5
gtgatggagg aggtttagta agtt 24
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物
<400> 6
ccaataaaac ctactcctcc cttaa 25
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 捕获探针
<400> 7
ttgcggctca ggctcgggga ctcgggctc 29
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 捕获探针
<400> 8
actccgggtt gggggagggg cgatggcggc ctcccgcgag cataaa 46
<210> 9
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 捕获探针
<400> 9
ggttcacagt ccagaagact tgctgagcct cctccatcac c 41
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 检测探针
<400> 10
caaactcgaa aactcgaact cgaaa 25
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 检测探针
<400> 11
acgacctccc gcgaacata 19
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 检测探针
<400> 12
accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 30
<210> 13
<211> 363
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> NeuroG1 DNA正链序列
<400> 13
acacgactgg cctcaggacc ccttaagtac ccggcgcaac aatgggcgcc cccctccctt 60
gccacctccg cccccgcggc agcccgggtg aatggagcga ggcggcaggt catccccgtg 120
cagcgcccgg gtatttgcat aatttatgct cgcgggaggc cgccatcgcc cctcccccaa 180
cccggagtgt gcccgtaatt accgccggcc aatcggcggc gtcgcgcggc cccgggagtc 240
ggctcgggct aagctggcca gggcgtctcc aggcagtgaa acagaggcgg ggtcggcggg 300
cgattagcgg ccgaggcacg ctcctcttgg ggcgggctgg gcgcccctcg ctggggtggg 360
acg 363
<210> 14
<211> 328
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> NeuroG1正链甲基化序列
<400> 14
ttcggcgtaa taatgggcgt tttttttttt tgttattttc gttttcgcgg tagttcgggt 60
gaatggagcg aggcggtagg ttattttcgt gtagcgttcg ggtatttgta taatttatgt 120
tcgcgggagg tcgttatcgt ttttttttta attcggagtg tgttcgtaat tatcgtcggt 180
taatcggcgg cgtcgcgcgg tttcgggagt cggttcgggt taagttggtt agggcgtttt 240
taggtagtga aatagaggcg gggtcggcgg gcgattagcg gtcgaggtac gttttttttg 300
gggcgggttg ggcgtttttc gttggggt 328
<210> 15
<211> 363
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> NeuroG1 DNA反链序列
<400> 15
cgtcccaccc cagcgagggg cgcccagccc gccccaagag gagcgtgcct cggccgctaa 60
tcgcccgccg accccgcctc tgtttcactg cctggagacg ccctggccag cttagcccga 120
gccgactccc ggggccgcgc gacgccgccg attggccggc ggtaattacg ggcacactcc 180
gggttggggg aggggcgatg gcggcctccc gcgagcataa attatgcaaa tacccgggcg 240
ctgcacgggg atgacctgcc gcctcgctcc attcacccgg gctgccgcgg gggcggaggt 300
ggcaagggag gggggcgccc attgttgcgc cgggtactta aggggtcctg aggccagtcg 360
tgt 363
<210> 16
<211> 363
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> neurog1反链甲基化序列
<400> 16
cgttttattt tagcgagggg cgtttagttc gttttaagag gagcgtgttt cggtcgttaa 60
tcgttcgtcg atttcgtttt tgttttattg tttggagacg ttttggttag tttagttcga 120
gtcgattttc ggggtcgcgc gacgtcgtcg attggtcggc ggtaattacg ggtatatttc 180
gggttggggg aggggcgatg gcggtttttc gcgagtataa attatgtaaa tattcgggcg 240
ttgtacgggg atgatttgtc gtttcgtttt atttattcgg gttgtcgcgg gggcggaggt 300
ggtaagggag gggggcgttt attgttgcgt cgggtattta aggggttttg aggttagtcg 360
tgt 363
<210> 17
<211> 437
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> sdc2 dna序列
<400> 17
accagaaact gaacctcggc acgggaaagg agtccgcgga ggagcaaaac cacagcagag 60
caagaagagc ttcagagagc agccttcccg gagcaccaac tccgtgtcgg gagtgcagaa 120
accaacaagt gagagggcgc cgcgttcccg gggcgcagct gcgggcggcg ggagcaggcg 180
caggaggagg aagcgagcgc ccccgagccc cgagcccgag tccccgagcc tgagccgcaa 240
tcgctgcggt actctgctcc ggattcgtgt gcgcgggctg cgccgagcgc tgggcaggag 300
gcttcgtttt gccctggttg caagcagcgg ctgggagcag ccggtccctg gggaatatgc 360
ggcgcgcgtg gatcctgctc accttgggct tggtggcctg cgtgtcggcg gagtcgagag 420
cagagctgac atctgat 437
<210> 18
<211> 437
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> sdc2甲基化序列
<400> 18
attagaaatt gaatttcggt acgggaaagg agttcgcgga ggagtaaaat tatagtagag 60
taagaagagt tttagagagt agttttttcg gagtattaat ttcgtgtcgg gagtgtagaa 120
attaataagt gagagggcgt cgcgttttcg gggcgtagtt gcgggcggcg ggagtaggcg 180
taggaggagg aagcgagcgt tttcgagttt cgagttcgag ttttcgagtt tgagtcgtaa 240
tcgttgcggt attttgtttc ggattcgtgt gcgcgggttg cgtcgagcgt tgggtaggag 300
gtttcgtttt gttttggttg taagtagcgg ttgggagtag tcggtttttg gggaatatgc 360
ggcgcgcgtg gattttgttt attttgggtt tggtggtttg cgtgtcggcg gagtcgagag 420
tagagttgat atttgat 437
<210> 19
<211> 88
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> NeuroG1 DNA序列 片段
<400> 19
cgtgcagcgc ccgggtattt gcataattta tgctcgcggg aggccgccat cgcccctccc 60
ccaacccgga gtgtgcccgt aattaccg 88
<210> 20
<211> 70
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> SDC2 DNA序列 片段
<400> 20
gaggaagcga gcgcccccga gccccgagcc cgagtccccg agcctgagcc gcaatcgctg 60
cggtactctg 70
<210> 21
<211> 369
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> NeuroG1-Ⅰ DNA序列
<400> 21
gtaggtgaag tcttcggagg cggctgggct actggggtca gagagcgggg aggcggcggc 60
ggcacctgag ccccaggact ccgcgtcgct ggcggggctt gggggaccgg gcaggcaggg 120
gacgcactgc ggcggcagga ggcgctcccg ggcaccgcct ccgggcagcc cttgatccgc 180
caggcgcagt gtctcggcca gagcccagat gtagttgtag gcgaagcgca gcgtctcgat 240
tttggtgagc ttggtgtcgt cggggaacga gggcagcacg ctgcgcagtg cgtccagggc 300
cgcgttcaag ttgtgcatgc ggttgcgctc gcgatcgttg gccttgacgc gccggctcct 360
gcgcagcga 369
<210> 22
<211> 351
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> neurog1-Ⅱ dna序列
<400> 22
ccggctcctg cgcagcgagt gcagcagcgc ctcggagcgg acccgcgtcc ggccgcggcg 60
ccgccgcctc tcctgctcgt cgtcctgtgc ccctggaacc tcagacgccc gggagatatt 120
gggcgcgccc ctgcgggccg gcgcgggcgg ccccgaagcg gaggctgcct gttggagtct 180
ggcacagtct tcctcgtcgg tgaggaagcc ggataggtca ctgccgctgc tgctggcgca 240
gtcgaggtcg gagatgcagg tctcaaggcg ggctggcatc gttgcgctgt gcaggaccga 300
cggacagata gaaaggcgct cagagcgctg cagcccggac tgagggcaga g 351
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物
<400> 23
agttttcgga ggcggttg 18
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物
<400> 24
tcgctacgca aaaaccga 18
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物
<400> 25
tcggtttttg cgtagcga 18
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物
<400> 26
caatccgaac tacaacgctc ta 22
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物
<400> 27
gagcgaggcg gtaggtta 18
<210> 28
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物
<400> 28
tacctcgacc gctaatc 17
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物
<400> 29
ttagaaattg aatttcggta cgg 23
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物
<400> 30
atcaaatatc aactctactc tcgactc 27
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物
<400> 31
gcggcggtat ttgagtttt 19
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物
<400> 32
ctacccgatc ccccaaac 18
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 检测探针
<400> 33
cgccaacgac gcgaaatc 18
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物
<400> 34
ggtatcgttt tcgggtagtt 20
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物
<400> 35
gcttcgccta caactacatc t 21
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 检测探针
<400> 36
cgaaacacta cgcctaacga at 22
<210> 37
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物
<400> 37
gtgtcgtcgg ggaacgag 18
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物
<400> 38
gcatacacaa cttaaacgcg 20
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 检测探针
<400> 39
aacgcactac gcaacgtac 19
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物
<400> 40
ttttggaatt ttagacgttc gg 22
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物
<400> 41
aaacaacctc cgcttcgaa 19
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 检测探针
<400> 42
cgcaaaaacg cgcccaat 18
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物
<400> 43
aagtcggata ggttattgtc gt 22
<210> 44
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物
<400> 44
caacccgcct taaaacct 18
<210> 45
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 检测探针
<400> 45
tccgacctcg actacgcca 19
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物
<400> 46
ttggtatcgt tgcgttgtgt a 21
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物
<400> 47
tcaatccgaa ctacaacgct c 21
<210> 48
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 检测探针
<400> 48
acgcctttct atctatccgt cgat 24
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物
<400> 49
taattcggag tgtgttcgta att 23
<210> 50
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物
<400> 50
aaccgactcc cgaaacc 17
<210> 51
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 检测探针
<400> 51
ccgccgatta accgacgat 19
<210> 52
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物
<400> 52
ttggttaggg cgtttttag 19
<210> 53
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物
<400> 53
cctcgaccgc taatcgc 17
<210> 54
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 检测探针
<400> 54
gccgaccccg cctcta 16
<210> 55
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物
<400> 55
cgcgttttcg gggc 14
<210> 56
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物
<400> 56
gcttcctcct cctacgc 17
<210> 57
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 检测探针
<400> 57
cgccgcccgc aacta 15
<210> 58
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物
<400> 58
tcggattcgt gtgcgcg 17
<210> 59
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物
<400> 59
tacttacaac caaaacaaaa cg 22
<210> 60
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 检测探针
<400> 60
acccaacgct cgacgca 17
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物
<400> 61
cgtgtagcgt tcgggtattt 20
<210> 62
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物
<400> 62
aaccgacgat aattacgaac aca 23
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物
<400> 63
ttcgtgtagc gttcgggtat 20
<210> 64
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物
<400> 64
cgataattac gaacacactc cgaat 25
<210> 65
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物
<400> 65
tcgtgtagcg ttcgggt 17
<210> 66
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物
<400> 66
cgataattac gaacacactc cg 22
<210> 67
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物
<400> 67
cgtgtagcgt tcgggt 16
<210> 68
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物
<400> 68
cgacgataat tacgaacaca ctc 23
<210> 69
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物
<400> 69
tcgtgtagcg ttcggg 16
<210> 70
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物
<400> 70
cgattaaccg acgataatta cg 22
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 检测探针
<400> 71
acgataacga cctcccgcga 20
<210> 72
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 检测探针
<400> 72
tttatgttcg cgggaggtcg ttatcg 26
<210> 73
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 检测探针
<400> 73
acgacctccc gcgaacata 19
<210> 74
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物
<400> 74
gaggaagcga gcgttttc 18
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物
<400> 75
aaaataccgc aacgattacg a 21
<210> 76
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物
<400> 76
ggaagcgagc gttttcg 17
<210> 77
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物
<400> 77
caaaataccg caacgattac g 21
<210> 78
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物
<400> 78
ggaagcgagc gttttcga 18
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物
<400> 79
cgaaacaaaa taccgcaacg 20
<210> 80
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物
<400> 80
ggaggaggaa gcgagcg 17
<210> 81
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物
<400> 81
gaatccgaaa caaaataccg c 21
<210> 82
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物
<400> 82
aagcgagcgt tttcgagt 18
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物
<400> 83
aataccgcaa cgattacgac 20
<210> 84
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物
<400> 84
aagcgagcgt tttcgag 17
<210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物
<400> 85
aaataccgca acgattacga c 21
<210> 86
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 检测探针
<400> 86
caaactcgaa aactcgaact cgaaa 25
<210> 87
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 检测探针
<400> 87
caaactcgaa aactcgaact cgaa 24
<210> 88
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 检测探针
<400> 88
caaactcgaa aactcgaact cga 23
<210> 89
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 捕获探针
<400> 89
cactccgggt tgggggaggg gcgatggcgg cctcccg 37
<210> 90
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 捕获探针
<400> 90
gaggggcgat ggcggcctcc cgcgagcata aat 33
<210> 91
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 捕获探针
<400> 91
acgggcacac tccgggttgg gggaggggcg atggcggcct cccgcg 46
<210> 92
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 捕获探针
<400> 92
agtaccgcag cgattgcggc tcaggctcgg ggactcgggc tcg 43
<210> 93
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 捕获探针
<400> 93
ccgcagcgat tgcggctcag gctcggggac tcgggc 36
<210> 94
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 捕获探针
<400> 94
ccgccgcagt gcgtcccctg cctgcccggt cccccaa 37
<210> 95
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 捕获探针
<400> 95
agctcaccaa aatcgagacg ctgcgcttcg cctacaacta catctg 46
<210> 96
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 捕获探针
<400> 96
atcgcgagcg caaccgcatg cacaacttga acgcggc 37
<210> 97
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 捕获探针
<400> 97
gaagactgtg ccagactcca acaggcagcc tccgcttcgg ggccgccc 48
<210> 98
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 捕获探针
<400> 98
gtcctgcaca gcgcaacgat gccagcccgc cttgagacc 39
<210> 99
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 捕获探针
<400> 99
ctctgccctc agtccgggct gcagcgctct gagcgccttt 40
<210> 100
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
cgatggcggc ctcccgcgag cataaattat gcaaataccc gggcgct 47
<210> 101
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 捕获探针
<400> 101
gactcccggg gccgcgcgac gccgccgatt ggccggcggt aattacgg 48
<210> 102
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 捕获探针
<400> 102
ctcggggctc gggggcgctc gcttcctcct cctg 34
<210> 103
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 捕获探针
<400> 103
ccagccgctg cttgcaacca gggcaaaacg aagcct 36
<210> 104
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 捕获探针
<400> 104
ttgcggctca ggctcgggga ctcgggctc 29
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