具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

检测黑色素瘤靶向用药相关基因突变的引物组

本实施例的黑色素瘤靶向用药相关基因及位点从COSMIC数据库中筛选而来，依据相关基因序列进行靶向药物相关突变位点引物设计，设计范围包含了黑色素瘤靶向用药相关基因中的药物选择相关突变。

本实施例的所述3个基因的82个DNA突变位点如表1所示，对应的突变位点扩增引物如表2所示：

表1黑色素瘤靶向用药相关基因DNA突变位点

表2黑色素瘤靶向用药相关基因DNA突变位点扩增引物

实施例2

一种检测黑色素瘤靶向用药相关基因突变的试剂盒

本实施例中所述检测黑色素瘤靶向用药相关基因突变的试剂盒包括：

(1)扩增引物：用于扩增待测样本目标基因上的多个目标区域，扩增范围至少覆盖目标基因的热点突变区域，引物序列如表2中SEQ ID NO.1-28所示；

(2)阳性DNA质控品、阴性质控品、建库试剂，所述建库试剂包括5×Ion AmpliSeq^TMHiFi Mix、Pre-ligation Enzyme、Barcording buffer、Barcoding enzyme、Adapter。

实施例3

一种检测黑色素瘤靶向用药相关基因突变的方法

本实施例的检测方法包括如下步骤：

(1)从待测样本中提取DNA，并对DNA进行浓度和纯度检测，DNA浓度要求大于5ng/uL；样本为为新鲜手术组织和/或穿刺组织、冷冻的手术组织和/或穿刺组织、福尔马林固定石蜡包埋的组织样本的一种或多种；

(2)以上步骤提取的DNA为模板，用SEQ ID NO.1-28所示的引物进行第一轮PCR扩增，扩增反应体系如表3所示：

表3第一轮PCR扩增体系

(3)充分震荡混匀后，短暂离心，按下表程序与PCR仪上进行反应，反应程序表4所示：

表4第一轮PCR扩增程序

(4)取出PCR管后，短暂离心，在10μL的PCR产物中加入1μLPre-ligation Enzyme；

(5)充分振荡混匀，轻度离心将液体收集到管底，PCR管放入PCR仪，按表5所示程序运行；

表5第二轮PCR扩增程序

(6)第二轮PCR扩增产物中加入2μL Barcoding buffer，1μL barcording enzyme和1μL adapter；

(7)充分振荡混匀，轻度离心将液体收集到管底，按表6所示程序运行；

表6第三轮PCR扩增程序

(8)纯化文库

a.用水补齐液体体积至30ul，并转移至1.5mL EP管中，并向每个文库中加入45微升(1.5×样本体积)的XP试剂。用枪吹打5次使DNA与磁珠悬浮液充分混匀；

b.将混合液置于室温5分钟；

c.将1.5mL EP管置于磁力架上，静置2分钟或者等溶液变清澈。小心地吸走并弃掉上清，不要扰动磁珠；

d.向孔中加入150μL新鲜配制的70％乙醇，在磁力架上来回移动EP管来洗涤磁珠，然后小心地弃去上清，不要扰动磁珠。

e.重复上一步，进行第二次洗涤；

f.确保乙醇液滴已全部从孔中吸走。将板放置于磁力架上，室温空气干燥5分钟，注意不要过度干燥；

g.将EP管从磁力架上拿开，在每孔中加入50μL Low TE充分浸润磁珠，充分振荡混匀，轻度离心将液体收集到管底。(也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀)；

h.将EP管置于磁力架上2分钟。待澄清后，吸取上清液，即为文库；

(9)将构建好的文库，用Qubit定量并稀释到合适浓度，参照life公司的操作说明书在OT仪上进行模板富集，然后于Ion OneTouch^TM ES仪器上回收富集带模板的ISPs；

(10)参照life公司的操作说明书于PGM仪器上进行上机测序；

(11)对测序结果利用生物信息分析软件进行分析和注释。

实施例4

一种检测黑色素瘤靶向用药相关基因突变的试剂盒的测序深度性能验证

利用本发明实施例2的试剂盒，对8例样本(黑色素瘤石蜡包埋组织样本)进行检测，检测方法按照实施例3的方法进行。检测结果显示，在8例不同样本中，本发明中的试剂盒测序深度良好，分别为16876×、21218×、11823×、11544×、14501×、20437×、11034×、18640×，如图2所示，均大于试剂盒所设定的最低测序深度5000×。

实施例5

一种检测黑色素瘤靶向用药相关基因突变的试剂盒的重现性验证

利用本发明实施例2的试剂盒对同一份样本(黑色素瘤石蜡包埋组织样本)，3个不同实验员分别进行检测，检测方法按照实施例3的方法进行。检测结果显示，其测序深度分别为34140×、36583×、34379×，如图3所示。BRAF V600E位点均可被检测出来，且检测出来的突变频率较为一致，分别为20.1％、19.5％、21.3％。由此可见，本试剂盒具有较好的检测重现性。

实施例6

一种检测黑色素瘤靶向用药相关基因突变的引物及试剂盒的重复性验证

利用本发明实施例2的试剂盒对同一份黑色素瘤样本(黑色素瘤石蜡包埋组织样本)，由同一实验员进行3次检测，所用方案按照实施例3的方法。3次检测结果显示，其测序深度分别为37818×、39371×、37281×(图4)，所测得的NRAS突变频率为22.3％、24.8％、23.6％。由此看出，对于同一样本，本发明所述试剂盒具有良好的检测重复性。

实施例7

一种检测黑色素瘤靶向用药相关基因突变的引物及试剂盒的灵敏性验证

利用本发明实施例2的试剂盒对同肿瘤SNV FFPE标准品(菁良科技)DNA进行检测，将标准品DNA分别稀释至10ng/uL，5ng/uL，3ng/uL作为起始DNA浓度进行建库，分别取3uL，即文库DNA投入量为30ng、15ng、9ng，分别标记为标准品1、标准品2、标准品3。所用方案按照实施例3的方法。检测结果显示，4个不同浓度的标准品结果均一致，标准品1的结果为NRAS(p.Q61K，6.5％)、BRAF(V600E，25.2％)；标准品2的结果为NRAS(p.Q61K，6.1％)、BRAF(V600E，23.5％)；标准品3的结果为NRAS(p.Q61K，5％)、BRAF(V600E，20.7％)。由此看出，本发明可检测出低至9ng DNA样品中含量低至5％的基因突变。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 西安医臻生物医药科技有限公司

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