一种复杂疾病相关snp位点引物组合物及应用

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一种复杂疾病相关snp位点引物组合物及应用

文档序号：3382 发布日期：2021-09-17 浏览：25次英文

一种复杂疾病相关SNP位点引物组合物及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学

技术领域

，具体涉及一种复杂疾病相关SNP位点引物组合物及应用。

背景技术

复杂疾病(Complex Disease)是一类病因复杂，起病隐匿，病程较长且病情迁延不愈的疾病总称。近年来，伴随着快速城镇化和人口老龄化的进程，慢性复杂疾病的发病率和死亡率均呈持续上升趋势。流行病学调查显示，慢性复杂疾病的发生与不良生活方式和行为密切相关。慢性复杂疾病监测能及时发现机体健康问题，并针对相关问题提出整改措施。慢性复杂疾病的早筛早测对于降低慢性复杂疾病的危害意义重大，预防慢性复杂疾病的发生，应从预防和控制其危险因素开始，而遗传背景则是影响慢性复杂疾病危险因素之一。

复杂疾病，是由多个基因之间的复杂调控以及环境作用的因素引起，具有明显的遗传异质性和表型复杂化的特征，常见的如肿瘤性疾病、心血管疾病、自身免疫病、神经系统疾病等。复杂疾病与一般的单基因疾病不同，不完全符合孟德尔遗传定律，其疾病的发生往往涉及多种生物学过程，如多个基因、蛋白或相关分子之间相互作用的网络动态失调，从而产生特定的表型和各种疾病的症状。复杂疾病的早期诊断十分困难，预后效果也比较差，复发率、死亡率都很高，因此对于复杂疾病的研究具有重要现实意义。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是由单个核苷酸的变异(包括转换、颠换、缺失和插入四种形式)所引起的DNA序列的多态性，一般情况下只会发生转换和颠换这两种形式，二者之比约为1：2。SNP在人类基因组中广泛存在，大约每五百到一千个碱基中就会出现一个，占全部已知基因多态性的90％以上，可以说是人类最常见的可遗传变异。单核苷酸多态性最常出现在CG序列中，C等位基因型转换为T等位基因型的情况最为常见，这可能与胞嘧啶容易通过甲基化形成胸腺嘧啶有关。单核苷酸多态性作为被发掘的第三代DNA遗传标志物，相比前两代标志物而言，具有数量多、密度大、分布广、稳定性强、易于检测等优点，有利于单核苷酸多态性在医学方面的应用和推广。

专利CN108334749B公开了一种基于染色质调控环路检测复杂疾病上位性的方法和系统，其利用染色质远程交互作用等数据建立了基于基因相互作用的染色质调控环路，并依据染色质调控环路计算调控环路内能影响复杂疾病表型的SNP相互作用，可快速、准确地探索与复杂疾病相关的SNP相互作用，为后续的药物涉及等提供潜在靶标。专利CN105354444B则公开了一种基于易感SNP筛查复杂疾病易感SNP组合的方法，该方法可迅速从大量数据中找到特定疾病的易感SNP组合，可应用于任何复杂疾病易感SNP组合的筛查和疾病遗传风险的预测，为疾病风险评价提供了一种新的方法。但以上现有技术中仅提供了针对某一种复杂疾病的评估方法或系统，并未给出针对多种复杂疾病的检测方法或系统。

因此，亟需构建一种能够同时针对多种复杂疾病的相关SNP位点引物组合物及应用，提高慢性复杂疾病的预防或治疗效果。

发明内容

针对上述不足，本发明提供了一种复杂疾病相关SNP位点引物组合物及其应用。本发明通过NGS的方法，设计开发了一组与复杂疾病相关的多个SNP位点及其扩增引物，通过生物信息学分析方法，检测个体体内与复杂疾病相关的基因结构变化，预测个体患病风险，提高复杂疾病的预防和/或治疗效果。本申请所述的评估系统及检测方法成本低，操作简便，灵敏度好，且准确率高，重复性好，具有极大的临床应用价值。

为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供了一种复杂疾病相关SNP位点引物组合物，所述SNP位点组合包括：rs10229583、rs1048886、rs10811661、rs10814916、rs10886471、rs10906115、rs1111875、rs1116357、rs11257655、rs117601636、rs11787792、rs12000501、rs12010175、rs12549902、rs13266634、rs1359790、rs1421085、rs1436955、rs1470579、rs147538848、rs1535500、rs163171、rs163182、rs16861329、rs16955379、rs17584499、rs17797882、rs1802295、rs1845900、rs187060802、rs1965305、rs2028299、rs2063640、rs2074196、rs2206734、rs2237892、rs2237895、rs2237896、rs2237897、rs2283228、rs2299620、rs2383208、rs2688419、rs2833610、rs28642252、rs2933170、rs2946504、rs312457、rs34773007、rs34872471、rs35209784、rs35612982、rs35668226、rs377457、rs3786897、rs391300、rs3923113、rs4258054、rs4376068、rs4430796、rs459193、rs4712523、rs4712524、rs4812829、rs4884660、rs4930045、rs515071、rs56252704、rs5945326、rs6017317、rs6467136、rs6583826、rs67156297、rs6769511、rs6780569、rs67839313、rs703980、rs7041847、rs7087591、rs7107784、rs7119、rs7172432、rs7178572、rs73069940、rs73230612、rs7403531、rs7507912、rs75418188、rs7612463、rs7656416、rs7756992、rs7766070、rs78627331、rs7901695、rs7903146、rs791595、rs79976124、rs806215、rs831571、rs9295475、rs9368222、rs9460546、rs9470794、rs9552911、rs9828933、rs11218343、rs3781834、rs429358、rs10995251、rs12634229、rs13015714、rs16999165、rs17457593、rs176095、rs224126、rs3126085、rs4722404、rs6010620、rs6780220、rs7075349、rs7613051、rs7701890、rs878860、rs9540294、rs9870933、rs9883177、rs10489202、rs1051061、rs10883765、rs10883795、rs11038167、rs11038172、rs1635、rs16887244、rs2142731、rs835784、rs10821944、rs11900673、rs12379034、rs12617656、rs13192471、rs1854853、rs2075876、rs2233434、rs2841277、rs2867461、rs3093024、rs3125734、rs3781913、rs657075、rs10865331、rs13210693、rs17095830、rs30187、rs4552569、rs7537605、rs10036748、rs10845606、rs10847697、rs1128334、rs1167796、rs1234315、rs12494314、rs12822507、rs131654、rs13385731、rs1385374、rs1418190、rs1913517、rs2205960、rs2230926、rs2248932、rs2431697、rs2618479、rs2732547、rs2934498、rs34330、rs4622329、rs463426、rs4639966、rs4728142、rs4852324、rs4916219、rs4917014、rs4948496、rs548234、rs6590330、rs6705628、rs6804441、rs7097397、rs7197475、rs7329174、rs7812879、rs7574865、rs2281389、rs3019885、rs987870、rs10484560、rs10508372、rs10947262、rs1701704、rs1837253、rs204993、rs204995、rs2069408、rs2858308、rs3117098、rs3129890、rs3129943、rs3130299、rs3805236、rs3806156、rs404860、rs412657、rs443198、rs570963、rs6457617、rs7686660、rs7775228、rs9275698、rs9500927。

具体地，所述的引物组合物如下表1所示。

表1引物组合物

具体地，所述的复杂疾病包括但不限于2型糖尿病、桥本氏甲状腺炎、阿尔兹海默症、过敏性皮炎、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、哮喘或精神分裂症。

另一方面，本发明提供了上述SNP位点引物组合物在制备检测和/或评估复杂疾病产品中的应用。

又一方面，本发明提供了一种用于检测和/或评估复杂疾病的产品，所述产品包括上述SNP位点引物组合物。

具体地，所述的产品为独立试剂或试剂盒。

又一方面，本发明提供了上述SNP位点引物组合物或产品在检测复杂疾病相关SNP位点中的应用。

又一方面，本发明提供了一种复杂疾病相关SNP位点的检测方法，所述方法为非疾病诊断和治疗方法，所述方法包括利用上述引物组合物或产品对待测样品基因组中的SNP位点进行检测。

具体地，所述的方法包括以下步骤：

(1)基因组DNA提取；

(2)第1轮多重PCR反应；

(3)第1轮磁珠纯化；

(4)第2轮多重PCR反应；

(5)第2轮磁珠纯化；

(6)文库定量；

(7)文库质量检测；

(8)将文库上机测序，得到fastaq序列文件，经过质量评估、比对、SNP calling步骤得到待测样本捕获区域的SNP的基因型信息；

(9)将得到的每一个SNP的基因型赋予其在人群研究中的疾病的OR值；

(10)将个体某一疾病所涉及的SNP的所有OR值进行相乘，即该个体针对该疾病的绝对遗传风险；

(11)将绝对遗传风险在千人基因组/中国人基因组队列中排名，即该个体针对该疾病的相对遗传风险，排名在5％以内为低风险，在95％以上为高风险，5-95％之间为正常范围。

进一步具体地，步骤(8)中所述质量评估软件为FASTQC软件，所述比对软件为BWA软件，所述SNP calling软件为GATK软件。

与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：

1、本发明提供了一种复杂疾病相关的SNP位点及其引物组合物，能够同时对2型糖尿病、桥本氏甲状腺炎、阿尔兹海默症、过敏性皮炎、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、哮喘、精神分裂症等复杂疾病进行检测及患病风险评估，从而指导人们从饮食、运动、生活习惯等方面进行提前预防和提示未来进行医院常规体检的长期关注点，进一步提高慢性复杂疾病的防治效果。

2.本发明提供的SNP位点引物组合物及检测方法，可从微量外周血中获取到足够多的遗传信息，进行遗传风险评估，灵敏度好，同时高效特异的扩增引物，精准地获取SNP位点信息，杜绝非特异扩增，大大的提高了精准度，并降低实验成本，操作简便。从获取的SNP组合，经过特异的分析方法，计算预测个体未来有可能的患病风险，具有极大的临床应用价值。

3.本发明包含的SNP位点信息覆盖多种疾病，对于每一种疾病，获得了N个该疾病易感位点基因型，每一个易感位点的基因型等位基因有自己的OR值，根据测序结果得到的位点的基因型信息，获得某种疾病所覆盖的位点基因型对应的OR值，进一步计算该疾病整体的遗传风险值。对于个体某种疾病的风险评估，要将个体的绝对遗传风险放到足够大的人群中去比较，才能更准确的代表该个体的患病风险。因此，本发明利用已建立的中国自然人群以及千人基因组人群为参照，确定所检测个体的疾病遗传风险。以95％为cut-off，个体某种疾病OR值超过所在人群95％的人，则认为该个体该种疾病遗传风险偏高。

附图说明

图1为下机测序数据示例图。

图2为阿尔兹海默症遗传风险评估图。

图3为成人哮喘遗传风险评估图。

图4为精神分类症遗传风险评估图。

图5为2型糖尿病遗传风险评估图。

图6为桥本氏甲状腺炎遗传风险评估图。

图7为系统性红斑狼疮遗传风险评估图。

图8为强直性脊柱炎遗传风险评估图。

图9为类风湿性关节炎遗传风险评估图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学用语均具有本领域技术人员通常理解的含义。

在某些实施例中，所用试剂或仪器详细信息如下：

无水乙醇：北京化工分析纯；

Agencourt AMPure XP Kit：Beckman(A63881)；

Qubit dsDNA HS Assay Kit：Life Technologies(Q32851)；

Nuclease-free water：Ambion(AM9930)；

High Sensitivity DNA Kit：Agilent(p/n 5067-4626)；

Custom Panel：艾吉泰康生物科技(北京)有限公司(IGMU062)，包括Box 1(-20℃保存)：IGT-I7(5μM)、IGT-EM101 polymerase mixture、Enhancer NB(1N)和Box 2(-20℃保存)：YF buffer B(4℃保存)、IGT-I5(5μM)；

PCR仪器：Life公司ABI 9700；

DynaMag-96 Side：Life Technologies(cat.no.12331D)；

3.0Fluorometer：Thermo(Q33216)；

Agilent 2100Bioanalyzer system：Agilent(G2939AA)。

实施例1引物组合物

本申请所述引物组合物具体如下表2所示。

表2引物组合物

实施例2文库构建及检测

1.基因组DNA提取

按照商业化基因组DNA提取试剂盒操作步骤进行唾液或血液基因组DNA(gDNA)的提取，使用Qubit(Life Technologies)进行定量。

2.第1轮多重PCR反应

1.1.反应体系如下表3所示。

表3反应体系

Reagent	Volume(μL)
		ddH<sub>2</sub>O	4-x
Enhancer NB(1N)	5
		Primer(表2)	2.4
gDNA	X(30ng)
		IGT-EM101polymerase mixture	3.6

其中，Primer引物混合物中每条引物的终浓度为0.5pmol。

1.2.反应程序为：95℃3min30s；98℃20s，60℃8min，18cycle；72℃5min。

3.第1轮磁珠纯化

3.1.向15μL PCR产物加入15μL室温平衡后的AMPure XP磁珠，用移液器吸打混匀数次；

3.2.室温孵育5min后，将PCR管置于DynaMag-96 Side磁力架上3min；

3.3.彻底移除上清，将PCR管从磁力架取下，向管内加入40μLYF buffer B，用移液器吸打混匀数次；

3.4.室温孵育5min后，将PCR管置于DynaMag-96 Side磁力架上3min；

3.5.移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μL 80％乙醇溶液，静置30s；

3.6.移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μL 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清；

3.7.室温静置10min，使残留乙醇彻底挥发；

3.8.将PCR管从磁力架取下，加入22μL Nuclease-free water，移液器轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min；

3.9.将PCR管重新置于磁力架上，静置3min；

3.10.用移液器吸取9.4μL上清液，转移到新的200μL PCR管内，管内上清液为多重PCR产物。

4.第2轮多重PCR反应

4.1.反应体系如下表4所示。

表4反应体系

Reagent	Volume(μL)
		步骤3.10多重PCR反应产物混合物	9.4
IGT-I5(5μM)	1
		IGT-I7(5μM)	1
IGT-EM101polymerase mixture	3.6

4.2.反应程序为：95℃3min30s；98℃20s，58℃1min，72℃30s，8cycle；72℃5min。

5.第2轮磁珠纯化

5.1.向15μL PCR产物加入13.5μL室温平衡后的AMPure XP磁珠，用移液器吸打混匀数次；

5.2.室温孵育5min后，将PCR管置于DynaMag-96 Side磁力架上3min；

5.3.彻底移除上清，将PCR管从磁力架取下，向管内加入40μL YF buffer B，用移液器吸打混匀数次；

5.4.室温孵育5min后，将PCR管置于DynaMag-96 Side磁力架上3min；

5.5.移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μL 80％乙醇溶液，静置30s；

5.6.移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μL 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清；

5.7.室温静置10min，使残留乙醇彻底挥发；

5.8.将PCR管从磁力架取下，加入24μL Nuclease-free water或者1×TE buffer(pH 8.0)，移液器轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min；

5.9.将PCR管重新置于磁力架上，静置3min；

5.10.用移液器吸取20μL上清液，转移到新的PCR管内，管内上清液为制备的多重PCR文库。

6.文库定量

取2μL文库样本使用3.0Fluorometer(Qubit dsDNA HS Assay Kit)进行文库浓度测定，记录文库浓度。

7.文库质量检测

取1μL文库样本使用Agilent 2100Bioanalyzer system(High Sensitivity DNAKit)进行文库片段长度和纯度测量，正常文库的靶片段分布区间在300-400bp之间，主峰在360bp左右。

8.将文库上机测序，得到fastaq序列文件。经过质量评估、比对、SNP calling等步骤得到待测样本捕获区域的SNP的基因型信息，其中质量评估使用FASTQC软件，比对使用BWA软件，SNP calling使用GATK软件。

9.将得到的每一个SNP的基因型赋予其在人群研究中的疾病的OR值。

10.将个体某一疾病所涉及的SNP的所有OR值进行相乘，即该个体针对该疾病的绝对遗传风险。

11.将绝对遗传风险在千人基因组/中国人基因组队列中排名，即该个体针对该疾病的相对遗传风险，排名在5％以内为低风险，在95％以上为高风险，5-95％之间为正常范围。

实施例3

复杂疾病与基因和检测位点的对应关系如下表5所示。

表5

实验例1准确性检测

使用本申请所述的检测方法对上述221个位点进行检测，同时用Sanger测序进行验证，结果如下表6所示。

表6准确性检测结果

由表6可知，本申请所述引物组合物及检测方法准确性为100％。

实验例2重复性检测

选取1例外周血样本A和1例唾液样本B，每个样本重复3次进行一个批次的检测，检测结果如下表7所示。

表7重复性检测结果

备注：样本A-1为样本A第1次检测。

由表7检测结果可知，本申请所述的引物组合物及检测方法重复性为100％。

实验例3精密度检测

选取1例外周血样本A和1例唾液样本B，每个样本分别使用三个批次的引物组合物进行检测，检测结果如下表8所示。

表8精密度检测结果

由表8检测结果可知，本申请所述的引物组合物及检测方法精密度为100％。

实验例4

选取1例外周血样本A按照本申请实施例1和实施例2的方法进行检测，并进行复杂疾病遗传风险的评估，以阿尔兹海默症、成人哮喘、精神分类症、2型糖尿病、桥本氏甲状腺炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、类风湿性关节炎为例，该样本在千人基因组人群和现阶段参照自测基因组人群中的遗传风险如图2-9所示。其中，横坐标为标准化后相对风险OR值的自然对数，纵坐标为所对应OR值上的人群概率密度。阿尔兹海默症OR＝1，Rank_{千人基因组}＝20％，Rank_自测＝50％；成人哮喘OR＝1.1825，Rank_{千人基因组}＝3.7％，Rank_自测＝13.6％；精神分类症OR＝1.4222，Rank_{千人基因组}＝85.6％，Rank_自测＝94.97％；2型糖尿病OR＝0.4305，Rank_{千人基因组}＝7％，Rank_自测＝23.6％；桥本氏甲状腺炎OR＝1，Rank_{千人基因组}＝0.1％，Rank_自测＝0.2％；系统性红斑狼疮OR＝1.8085，Rank_{千人基因组}＝76.3％，Rank_自测＝51.2％；强直性脊柱炎OR＝1.26，Rank_{千人基因组}＝6％，Rank_自测＝3.7％；类风湿性关节炎OR＝1.11，Rank_{千人基因组}＝1.9％，Rank_自测＝2％。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中国科学院北京基因组研究所（国家生物信息中心）

<120> 一种复杂疾病相关SNP位点引物组合物及应用

<130> 20210127

<160> 442

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 35

<212> DNA