一种靶向casc5基因的sgRNA及其应用
技术领域
本发明属于基因编辑
技术领域
，尤其涉及一种靶向casc5基因的sgRNA及其应用。背景技术
小头症(microcephaly)是一种神经发育障碍(neurodevelopmental disorder)疾病，通常表现为患者的头部较小，常规判断标准是一个人的头围相对于与其年龄与性别相同的正常人头围的平均值小三个标准差以上。
小头症是比较罕见的新生儿缺陷，除了头部较小外，小头症婴儿常会伴随一系列其他疾病，包括癫痫、发育迟缓(如语言、坐、立及行走等)、智力障碍(如学习和活动能力较弱)、行动和平衡能力差、进食困难(如吞咽困难)、听力受损和视力受损等，还有研究显示小头症新生儿存在脑部皮质和皮质下组织萎缩和弥漫性脑组织钙化的症状。上述疾病的严重程度取决于头部畸形的情况，可轻可重且可持续终身，在某些情况下甚至可能危及生命。
多数小头症是由常染色体基因突变引起，目前已经发现了多个致病基因，包括mcph1、wdr62、cdk5rap2及casc5等。这些基因可以调控神经细胞的细胞周期，尽管不是有丝分裂所必须的，但是功能缺失后神经细胞增殖速度显著变慢。日本学者冈泽均曾利用基因治疗方法将Apc4基因转入小头症小鼠胚胎中，观察到了神经细胞的部分恢复，但是离临床应用还很远(H Ito,H Shiwaku et al,In utero gene therapy rescues microcephalycaused by Pqbp1-hypofunction in neural stem progenitor cells,MolecularPsychiatry(2015)20,459-471.)。
目前，针对小头症发生机理的研究极少，致病机理相关的研究如神经细胞的细胞周期如何被减缓、分子之间发生了哪些相互作用进而造成了神经细胞和颅骨畸形，几乎一无所知。因此，如何提供一种小头症动物模型，可以应用于小头症相关的研究中，已成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种靶向casc5基因的sgRNA及其应用，所述靶向casc5基因的sgRNA特异性好，脱靶率低，配合Cas9 mRNA，可以实现casc5基因的特异性敲除，突变效率高，基因型可稳定存在，应用价值高。
为达此目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种靶向casc5基因的sgRNA，所述靶向casc5基因的sgRNA包括SEQ ID No.1所示的核酸序列。
SEQ ID No.1：GGACCTCTTACATCACTATC。
本发明中，所述sgRNA靶向casc5基因的第7号外显子，使编辑后的casc5基因发生移码突变，蛋白失去相应的生物学功能，从而实现casc5基因的敲除，相应的基因型可稳定存在。
第二方面，本发明提供了一种casc5基因编辑系统，所述casc5基因编辑系统包括第一方面所述的靶向casc5基因的sgRNA。
优选地，所述casc5基因编辑系统还包括Cas9。
优选地，所述Cas9包括Cas9核酸酶和/或Cas9 mRNA，优选为Cas9 mRNA。
本发明中，所述casc5基因编辑系统仅对casc5基因进行编辑，脱靶率较低，可以避免非特异性的基因编辑；选用Cas9 mRNA与sgRNA配合使用，对受精卵的毒害作用较小，增加了F0个体的存活率，减少了工作量。
第三方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞含有第一方面所述的靶向casc5基因的sgRNA。
优选地，所述重组细胞含有第二方面所述的casc5基因编辑系统。
优选地，所述重组细胞为经过第二方面所述的casc5基因编辑系统编辑后，基因组中敲除了casc5基因的受精卵。
本发明中，通过对受精卵的casc5基因进行编辑，得到的重组细胞可以通过细胞分裂的方式将突变的基因型传递给子代细胞，实现了基因突变的稳定性及可遗传性，降低了筛选的工作量，应用价值更为广泛。
第四方面，本发明提供了一种第三方面所述的重组细胞的构建方法，所述构建方法包括：
将第二方面所述的casc5基因编辑系统导入受精卵的细胞质内，得到所述重组细胞。
本发明中，将所述的casc5基因编辑系统直接导入受精卵的细胞质内，提高了基因编辑的效率；选取受精卵用于构建重组细胞，可以降低嵌合体出现的概率，保证有义突变可以传递给子代，降低后期筛选的工作量。
优选地，所述导入包括显微注射。
第五方面，本发明提供了一种小头症动物模型的构建方法，所述小头症动物模型的构建方法包括：
将第二方面所述的casc5基因编辑系统导入受精卵的细胞质内，得到重组细胞；
重组细胞发育成F0代个体，与野生型交配，得到F1代杂合子；
将所述F1代杂合子自交，获得的F2代纯合子即为所述的小头症动物模型。
本发明中，所述小头症动物模型的构建方法操作简单，成功率高；筛选得到纯合子后，仅需对纯合子进行持续的自交，即可使突变的基因型稳定遗传，无需再次筛选，十分方便，也为相关的研究创造了便利的条件。
优选地，所述casc5基因编辑系统的制备方法包括：
对Cas9基因进行体外转录，得到所述Cas9 mRNA；
将所述Cas9 mRNA与第一方面所述的靶向casc5基因的sgRNA混合，得到所述casc5基因编辑系统。
优选地，所述受精卵包括斑马鱼的受精卵。
优选地，所述F0代个体、F1代杂合子和F2代纯合子利用PCR扩增和测序进行鉴定。
优选地，所述PCR扩增的引物包括SEQ ID No.2～3所示的核酸序列。
SEQ ID No.2：CAAGACGACAATTCTGGCGATAT；
SEQ ID No.3：CAGTTCTTCCTGTTCGGTTTGAG。
作为优选技术方案，本发明所述小头症动物模型的构建方法，包括以下步骤：
(1)体外转录Cas9基因的mRNA，与靶向casc5基因的sgRNA混合，得到所述casc5基因编辑系统；
(2)收集斑马鱼的受精卵，将所述casc5基因编辑系统显微注射入所述斑马鱼的受精卵的细胞质内，得到重组细胞；
(3)培养所述重组细胞，生长为斑马鱼个体后，提取尾鳍组织的DNA，使用SEQ IDNo.2～3进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序鉴定，挑选casc5基因缺失的斑马鱼个体作为F0代斑马鱼；
(4)将所述F0代斑马鱼与野生型斑马鱼杂交，得到F1代杂合子斑马鱼；
(5)将所述F1代杂合子斑马鱼自交，使用SEQ ID No.2～3进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序鉴定，筛选出F2代casc5基因敲除的纯合子斑马鱼，即所述的小头症动物模型。
第六方面，本发明提供了第一方面所述的靶向casc5基因的sgRNA、第二方面所述的casc5基因编辑系统、第三方面所述的重组细胞、第四方面所述的重组细胞的构建方法或第五方面所述的小头症动物模型的构建方法中的任意一种或至少两种的组合在小头症药物筛选中的应用。
本发明中，所述靶向casc5基因的sgRNA和casc5基因编辑系统特异性好，脱靶率低；所述重组细胞和重组细胞的构建方法提高了基因编辑的效率，降低了筛选的工作量；所述小头症动物模型的构建方法技术成熟，操作简单，突变后的基因型可稳定存在，重复性较强，适合应用于相关的机制研究及药物筛选中，应用价值极其广泛。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明所述靶向casc5基因的sgRNA和casc5基因编辑系统具有良好的特异性和极低的脱靶率，基因编辑效率高；直接将casc5基因编辑系统导入受精卵的细胞质内，构建的重组细胞可以通过细胞分裂的方式将突变的基因型传递给子代细胞，实现了基因突变的稳定性及可遗传性，降低了筛选的工作量；
(2)本发明通过敲除casc5基因，建立了一种小头症动物模型，技术成熟，操作简单，成功率高，具有良好的重复性；构建得到的casc5基因敲除的纯合子斑马鱼产生了一个-3bp、+11bp的移码突变，与野生型斑马鱼胚胎相比，在48hpf(hour post fertilization)内表现出明显的发育迟缓、头部较小的表型，并且在4dpf(day post fertilization)后死亡，与人类因casc5基因突变导致的小头症的表型基本符合，原位杂交结果显示突变纯合子斑马鱼胚胎中检测不到casc5基因的表达，为小头症致病机理的研究及相关药物的筛选提供了有力的工具和新的思路。
附图说明
图1为本发明实施例4中野生型斑马鱼、F1代杂合子斑马鱼和F2代突变纯合子斑马鱼的测序结果；
图2A为本发明实施例5中野生型斑马鱼24hpf胚胎的图片；
图2B为本发明实施例5中casc5纯合突变体斑马鱼24hpf胚胎的图片；
图2C为本发明实施例5中野生型斑马鱼48hpf胚胎的图片；
图2D为本发明实施例5中casc5纯合突变体斑马鱼48hpf胚胎的图片；
图3A为本发明实施例6中野生型斑马鱼24hpf胚胎的整体原位杂交图片；
图3B为本发明实施例6中casc5基因敲除的纯合子斑马鱼24hpf胚胎的整体原位杂交图片。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
材料：
体外转录试剂盒购自Ambion公司；
PCR扩增试剂购自Genestar公司；
NaOH和Tris购自sigma；
斑马鱼来自国家斑马鱼资源中心品系TU；
斑马鱼的饲养条件为：在温度为28℃、盐度为0.25‰、pH为7.0的条件下进行饲养，光暗条件为14h/10h，每日喂食2次，以新鲜的丰年虫作为饲料，提供足量的饲料供斑马鱼自由取食。
多聚甲醛购自sigma；
蛋白酶K购自Thermo fisher；
封闭缓冲液购自Roche；
Anti-digoxigenin-AP抗体购自Roche；
NBT/BCIP染液购自Roche。
实施例1
本实施例提供一种靶向casc5基因的sgRNA，所述靶向casc5基因的sgRNA包括SEQID No.1所示的核酸序列。
SEQ ID No.1：GGACCTCTTACATCACTATC。
所述sgRNA靶向casc5基因的第7号外显子，引发基因移码突变，casc5蛋白失去生物学功能，达到基因敲除的效果。
实施例2
本实施例提供一种casc5基因编辑系统，所述casc5基因编辑系统包括靶向casc5基因的sgRNA和Cas9 mRNA。
通过靶向casc5基因的sgRNA和Cas9 mRNA的配合，所述casc5基因编辑系统可以对casc5基因进行特异性敲除，特异性好，脱靶率低，对细胞的毒害作用小，编辑后的个体更容易存活，效率较高。
实施例3
本实施例提供一种重组细胞，所述重组细胞为经过实施例2所述的casc5基因编辑系统编辑后，基因组中casc5基因发生突变的斑马鱼的受精卵。
所述重组细胞通过如下方法进行构建：
(1)体外转录Cas9基因的mRNA，与靶向casc5基因的sgRNA混合，得到所述casc5基因编辑系统，其中，所述sgRNA的终浓度为25ng/μL，Cas9 mRNA的终浓度为100ng/μL；
(2)收集斑马鱼的受精卵，将所述casc5基因编辑系统显微注射入所述斑马鱼的受精卵的细胞质内，得到重组细胞；
其中，需要将所述casc5基因编辑系统注射入1细胞时期的斑马鱼的受精卵的细胞质中，每颗受精卵注射3nL。
将casc5基因编辑系统直接显微注射入斑马鱼的受精卵的细胞质内，提高了基因编辑的效率；选取1细胞时期的受精卵构建重组细胞，有义突变可以通过细胞分裂进行遗传，降低了嵌合体出现的概率，编辑后的基因型可以遗传给子代，减小了筛选的工作量。
实施例4
本实施例培养实施例3构建的重组细胞，构建小头症动物模型，具体步骤如下：
(1)培养实施例3所述重组细胞，生长为斑马鱼个体后，提取尾鳍组织的DNA，使用SEQ ID No.2～3进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序鉴定，挑选casc5基因缺失的斑马鱼个体作为F0代斑马鱼；
DNA提取的步骤如下：
剪取长度为1mm的斑马鱼尾鳍，加入50μL浓度为50mM的NaOH溶液，95℃孵育15min，再加入5μL浓度为1M的Tris-HCl中和，离心取上清，即为扩增的DNA模板。
PCR扩增的体系及程序如下：
95℃，预变性5min；
94℃，变性30s；
55℃，退火30s；
72℃，延伸40s；
循环次数为35次；
72°，循环外延伸5min。
SEQ ID No.2：CAAGACGACAATTCTGGCGATAT；
SEQ ID No.3：CAGTTCTTCCTGTTCGGTTTGAG。
(2)将所述F0代斑马鱼与野生型斑马鱼杂交，得到F1代杂合子斑马鱼；
(3)将所述F1代杂合子斑马鱼自交，使用SEQ ID No.2～3进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序鉴定，筛选出F2代casc5基因敲除的纯合子斑马鱼，即所述的小头症动物模型。
经过筛选，本实施例成功构建了casc5基因敲除的纯合子斑马鱼，即所述的小头症动物模型。经测序鉴定，所述小头症动物模型的casc5基因发生了-3bp、+11bp的移码突变，缺失的序列如SEQ ID No.4所示，插入的序列如SEQ ID No.5所示。
SEQ ID No.4：ACT；
SEQ ID No.5：TTACATCTTAC。
野生型斑马鱼、F1代杂合子斑马鱼和F2代突变纯合子斑马鱼的测序结果如图1所示。从图中可以明显看出F2代突变纯合子斑马鱼的基因发生了突变。F1代斑马鱼的基因型为野生型/突变型的杂合子，因此在突变位点处呈多峰状。
实施例5
本实施例对实施例4筛选得到的casc5基因敲除的纯合子斑马鱼进行表型的鉴定。
将野生型斑马鱼胚胎与casc5纯合突变子斑马鱼胚胎在相同的条件下进行培养，并进行观察，结果如图2A～图2D所示。对比野生型斑马鱼在受精后24h(图2A)和受精后48h(图2C)的表型，casc5纯合突变体斑马鱼在受精后24h(图2B)和受精后48h(图2D)明显表现出发育迟缓、头部较小的表型，并且在受精后的第4天死亡，与临床上人类因casc5基因缺失导致的小头症疾病表型基本吻合，这进一步证明了本发明所述小头症动物模型的构建方法科学合理，结果真实可信。
实施例6
本实施例通过整体原位杂交对实施例4筛选得到的casc5基因敲除的纯合子斑马鱼在mRNA水平上进行casc5基因的检测，具体步骤如下：
以下所有步骤均须在脱色摇床上进行。
(1)斑马鱼胚胎的固定
收集斑马鱼胚胎于EP管中，每管30枚。用PBST润洗一次，加入1mL 4％多聚甲醛，4℃孵育过夜。用PBST漂洗固定后的胚胎，室温下漂洗3次，每次5min。分别用50％甲醇溶液(用PBST稀释)和100％甲醇溶液进行梯度脱水，每次均在室温下孵育5min。更换1次100％甲醇溶液，于-20℃静置过夜，可长期保存。
(2)探针孵育
分别用75％、50％和25％甲醇溶液(PBST稀释)对固定后的胚胎进行梯度复水，每次均在室温下孵育5min。用PBST在室温下漂洗3次，每次5min。用蛋白酶K处理1min，增加组织通透性。
用PBST润洗胚胎，用4％多聚甲醛室温固定20min，再用PBST室温漂洗3次，每次5min。
加入杂交缓冲液，在65℃孵育30min。更换新鲜杂交缓冲液，65℃预杂交3h。回收预杂交的缓冲液，更换为含500ng/mL的RNA探针的缓冲液，65℃孵育过夜。
所述探针的序列如SEQ ID No.6所示。
SEQ ID No.6：
GAACTGGATGAATCTTTGGCTGTACCCATGAAAGAAGAGTTTTTAATAGACGATGTCTTCGAGTCAGGCACAAGCCCTTCTTTTAAAAGGCCACATCCAGAGGAAGAACCTATTACACCAGAACAAACCAAGAAGACCTGTGTTTCTGACATGGGGTCTGACTGTCATGAAGCTGCCGTACAGTGGGAAGGTAATTTTACAAGGCATGCCGCTCAGAATCCCAAGGCAAAGACAATTGAAGATACAGGAGTCTCTGAATCCACTCTCAGGCACTCGCAGTTTGACTCTCATATGGACGGCATGCAGGATAATCTATTTGATTTTAATAAGAAACTTGAGGACGGAAGCATCACAGTGAACGAGTTTCTTAGCCACTTTGGCATCAAATTCGTCATCCACAGATCTAGACCAAGTGCTCTGCCTGTCAGGTGTGGCGCTGGTGAGACACGCACCATCGAAGATTTGCTGAAAGAAAAATACATAAGCCACCCCAAGCAGAGAGTATATGAGCAAGACTGTAAGAACATTACAGAAATAGTGGAGAGACTTAAAGAACAAATGTCTGCACAAGAGAAATCCCTGAGAAGCATCAATGGAGCCCTTCAACAAGAGATATGTACTCTCTCTGAAGAACAGTTAAAAAGCTTTGGATCCAAGTTGAAGGAGCGAAGGGCTTATTTTGGGAAGAAAAGCAAAGCAGTTTCTCATGAAATGAAAGGAGTGTTGTACTCTGAGCTCATAAAAACAACACAGGATGCAAAACTGAGCCTGATATCTAAAATCAAAGAGACAGATGAAATGATTGAAGACTTGGATGGCTGCATTAAAGATTTAGAAACCGATCTTGCGTCAGTTGATGCCATGATCACAGGGGATCGTCTTGATCTTCCTCAAGCAGGACCAGCCTTAAAAGCCAAGGAAGAAGATTTGCATCGACTCAATTCAGCTGTCACTTTCAAAGAGAGGGAAATTGGTGAGCTGGAGATTCAGCTGAAGACTTTGGAGAGCCAACAGGAGAAGCTGCAAGGGGAATCCAGTAGCCTTAAGAGTCATCTGGCAACTTTAAACAGTTTGAACGAGTGGCGTCTTGAAGCGACAGATGAAACAGGGGCTTTGTTTTCCTTCCTTCATAAAACTGTGCATCTGCAGGTGAACCTTCAAACACCTGCTGGGAAGGAATGGATGACTGAGGATGTGGAGAGAAATGTAGATGTAGTCTTCCAGTTGCAGCTGGATGGACAAAAGTCAGAATGTCATGCAAGCATGATTCATAATTTACTCGCAACGAAGATTGAGTCTCAAAGTCATTGGAAACAGAGGTACACAACAACCAGACATATACCAGAGCTCTTGCATACCATGAGTTTGGTGGTGGGTCGTCTCAGGCTTTTGGGTGAGGAGATTCACCGGTTGAAGAAGTGGGGAGGTTTGAGGCTTAGAATACTGAAAATCACTTGTACGGATACACGAGTTCATGTCATCTTCTCAAGTCTGAAATCCTTTGAAAAGTTTGAGCTGAGTCTGACGGTCACTCCAGACTATCCCTTTGGACCACTTCACATACAGGACTTCAAAAACCACATGGGAAACACAAGGTTGGATCAGCTCGAGGAGATCATATCGTCAGTTAAACCAGCCAAGAACTATCTGTCAAAAATCCTCAAGAAGATCCACGATGACCTCCTGTGCTAGGACCTCAGGTCTTATTGTTTACTCTGTTCTGTCTTTTAAATGTTTGTACATGTTTGTATTATCCCAAAATAAATGTGGCCGTAAACTACAAGTTTGC。
(3)抗体孵育
回收含有探针的缓冲液，分别用事先65℃预热的50％甲酰胺/2×SSCT、2×SSCT和0.2×SSCT溶液漂洗胚胎，每种溶液均在65℃下孵育2次，每次20min。PBST室温漂洗3次，每次5min，加入封闭缓冲液，室温下孵育1h。更换为含有抗体(Anti-digoxigenin-AP，1:4000)的封闭缓冲液，4℃下孵育过夜。
(4)染色
回收抗体，PBST室温漂洗6次，每次20min，再用Buffer 9.5T室温漂洗2次，每次10min。加入NBT/BCIP染液，染色20min。用PBST室温漂洗2次，每次5min在体视显微镜下观察。
野生型斑马鱼24hpf胚胎和casc5基因敲除的纯合子斑马鱼24hpf胚胎的整体原位杂交图片分别如图3A和图3B所示。由图可知，在受精24h后，野生型斑马鱼胚胎中casc5基因主要表达在头部，而casc5基因敲除的纯合子斑马鱼中则检测不到casc5基因的表达，这说明casc5基因敲除后，在mRNA水平上检测不到其表达，进一步证明了所述小头症动物模型的构建方法的正确性，具有广泛的应用价值。
综上所述，本发明通过合成靶向casc5基因的sgRNA，与Cas9 mRNA组成了casc5基因编辑系统，显微注射入1细胞时期的斑马鱼受精卵中，再经过鉴定和筛选，成功筛选到casc5基因敲除的纯合子斑马鱼，即小头症动物模型。所述casc5基因敲除的纯合子斑马鱼在受精后的48h内明显表现出头部较小、发育迟缓的症状，并在在受精后的第4天死亡，与人的casc5基因缺失的小头症疾病症状吻合；整体原位杂交的结果显示突变纯合子斑马鱼在mRNA水平上检测不到casc5基因的表达，进一步证明了所述动物模型的构建方法的正确性；所述小头症动物模型的构建方法技术成熟，工作量少，效率很高，在小头症致病机理研究及相关药物的筛选中具有广阔的应用前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 南方科技大学
<120> 一种靶向casc5基因的sgRNA及其应用
<130> 2021
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
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