一种提高水稻抗白叶枯病的方法
技术领域
本发明涉及基因工程
技术领域
，更具体的，涉及一种提高水稻抗白叶枯病的方法。背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是我国的主要粮食作物。水稻在生长过程中 受到大约70种病原体的影响，特别是病毒、细菌、真菌和线虫，这些病害不仅能剥夺营养物质，还能扰乱水稻的生长发育过程，并通过产生毒素、细胞壁降解酶和毒蛋白对宿主造成组织损伤，严重降低产量。如何减少这些病害造成的损失一直是水稻研究的重点。通过遗传改良水稻中的抗病基因提高抗病性可以减少农药的使用并且是对环境友好的最佳做法。通过基因功能挖掘，开发新的抗病品种来保护水稻免受病原体的伤害，对阐明水稻抗病的分子机理进而提高水稻的抗病性和产量有非常重要的意义。
水稻白叶枯病是由稻黄单胞菌引起的细菌性枯萎病，是世界上对水稻危害最大的一种 细菌性病害。黄单胞菌主要依靠通过各种类型的分泌蛋白系统，分泌的各种效应物来攻击 植物，以抑制宿主免疫并从植物中获得营养。与之对应，植物有一个精确的免疫系统，能 够检测入侵的微生物并引发防御反应。
植物先天免疫是由模式识别受体(PRR)触发免疫(PTI)和效应子触发免疫(ETI)组成的 双层免疫系统(1)。模式识别受体触发的免疫是植物先天免疫的第一条防线，增强了植物的 基础防御能力，使其能够抵抗大多数入侵的病原体，而效应子触发的免疫反应更常与过敏 反应(一种程序性细胞死亡)有关，植物抗性(R)基因则编码与特定病原体效应物相互作用的 蛋白质，并赋予植物对病原体的显性抗性。先天免疫反应和效应子触发的免疫均由复杂的 信号通路网络介导，这些信号通路激活防御反应基因的表达，如致病相关基因(PR)、活性 氧(ROS)、葡聚糖酶、几丁质酶、次生代谢物、气孔关闭以及胼胝体和木质素的沉积。
模式植物拟南芥中研究得最清楚的模式识别受体触发的免疫途径是由受体激酶FLS2 启动的。当与细菌鞭毛蛋白flg22结合时，FLS2迅速与另一种受体样激酶BAK1结合，激活下游的免疫反应。目前类受体蛋白激酶在拟南芥中参与先天免疫的研究较多，而水稻中类受体蛋白激酶参与的抗病免疫反应的报道较少，其中的分子机制也不清楚，水稻中响应抗病的因素仍需进一步探究。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种提高水稻抗白叶枯病的方 法。
本发明的第一个目的是提供一种提高水稻抗白叶枯病的方法。
本发明的第二个目的是提供一个用于构建具有抗白叶枯病水稻的靶点序列。
本发明的第三个目的是提供所述的靶点序列在构建抗白叶枯病水稻，或构建OsRLK1 基因缺失水稻中的应用。
本发明的第四个目的是提供OsRLK1基因和/或OsRLK1蛋白的抑制剂提高水稻的白叶枯病抗性中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明要求保护一种提高水稻抗白叶枯病的方法，敲除水稻OsRLK1基因，或使得OsRLK1基因失活，使得OsRLK1蛋白失活。
水稻OsRLK1基因即Os06G22810，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；其编码的 蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
优选地，利用CRISPR技术敲除RLK1基因。
更优选地，利用核苷酸序列如SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：4所示的靶点序列敲除RLK1基因。
最优选地，利用核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的靶点序列敲除RLK1基因。
更优选地，将所述靶点序列连入由U6a启动子启动的Cas9载体中，获得打靶载体；通过农杆菌介导的遗传转化体系将所述打靶载体导入野生型水稻植株中，筛选和/或鉴定获得阳性转基因植株。
更优选地，利用核苷酸序列如SEQ ID NO：5～6所示的引物进行筛选和/或鉴定。
更优选地，Cas9载体的抗性进行筛选和/或鉴定。
本发明还要保护一个用于构建具有抗白叶枯病水稻的靶点序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：4所示。
更优选地，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
以及，所述的靶点序列在构建抗白叶枯病水稻，或构建OsRLK1基因缺失水稻中的应 用。
本发明还要保护OsRLK1基因和/或OsRLK1蛋白的抑制剂提高水稻的白叶枯病抗性中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明揭示了一种调控水稻抗病的新的分子机制，并提供一种水稻抗白叶枯病的新方 法，利用基因组靶向编辑水稻中的一个类受体激酶基因OsRLK1，可激活水稻的免疫信号， 实现水稻抗病。
附图说明
图1为OsRLK1基因的编辑情况：图1A为OsRLK1基因模型，OsRLK1基因包括一 个内含子和两个外显子，从第二个外显子中选择两个靶点T1和T2，作为靶向编辑位点； 图1B为8个稳定遗传的突变株系的基因编辑情况。
图2为本发明所用CRISPR/Cas9载体图谱。
图3为OsRLK1突变体Osrlk1活性氧爆发：图3A为Osrlk1活性氧爆发表型，有叶片变黄和细胞死亡的现象，标尺代表10cm；图3B为台盼蓝染色，Osrlk1比野生型ZH11细 胞死亡程度增强；图3C为DAB染色，Osrlk1比野生型ZH11过氧化氢积累量高；图3D 为NBT染色，Osrlk1比野生型ZH11超氧阴离子积累量高。
图4为OsRLK1突变体Osrlk1具有提高水稻抗白叶枯病的功能：图4A为接种白叶枯菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae guangdong 4病斑长度测量数据是30个生物学重复的平均 值和标准误，星号代表2个磷水平间差异(Student’s T-test)，*表示差异显著(ρ<0.05)， **表示差异极显著(ρ<0.01)，标尺代表1cm；图4B为接种白叶枯菌Xanthomonasoryzae pv.oryzae guangdong 5病斑长度测量数据是30个生物学重复的平均值和标准误，星号代表 2个样品间差异(Student’s T-test)，*表示差异显著(ρ<0.05)，**表示差异极显著(ρ<0.01)， 标尺代表1cm。
图5为RLK1突变体Osrlk1导致了抗性基因的激活，激活了水稻的抗病信号响应，qRT-PCR检测突变体Osrlk1和野生型ZH11七周苗抗性相关基因(N＝3),以OsActin基因 作为内参，星号代表2个样品间差异(Student’s T-test)，*表示差异显著(ρ<0.05)，** 表示差异极显著(ρ<0.01)，实验有三次重复，都有相似的结果。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用 于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说 明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂 和材料。
实施例1 OsRLK1基因编辑及载体转化野生型水稻Z H11
一、实验方法
根据日本晴参考序列设计基因编辑靶点序列1：GAGGCTGCAAGCCGCAACCA(SEQ IDNO：3)，和靶点序列2：AGAGCACGACGCTCGGCACG(SEQ ID NO：4)；其位 置如图1A所示。首先在NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov)中找到OsRLK1的基因组序列， 然后在OsRLK1基因组序列中挑选到上述两个靶点，分别将两个靶点DNA序列一同连入 由U6a启动子启动的Cas9载体(图2)中，获得双靶点打靶载体。
然后，通过农杆菌EHA105介导的遗传转化将上述打靶载体导入野生型水稻ZH11植株中，通过潮霉素筛选转基因植株，利用引物OsRLK1-F和OsRLK1-R(表1)对转基 因植株进测序鉴定。结果得到独立转化个体。
表1用于鉴定的引物
基因
引物序列(5’→3’)
OsRLK1-F
CGAATGGTGGTCGGTCTCC(SEQ ID NO：5)
OsRLK1-R
ACACCTCCCTGGAAATCCT(SEQ ID NO：6)
2、实验结果
共获得8个稳定遗传的突变株系；如图1B所示，8个基因编辑的株系都会导致氨基酸的移码或者编码提前终止，都有相同的表型。选取具有代表性的株系L1和L3作为本发 明的研究株系。
实施例2 ROS和细胞死亡检测
一、实验方法
(1)DAB染色：从八周苗龄的突变体Osrlk1(L1和L3)和野生型ZH11植株中分 别取倒二叶，迅速插入浓度为1mg/mL的DAB(pH＝3.8)溶液中，抽真空30分钟，后于 室温暗处静置5小时，染色完成后于95％乙醇中脱去浮色，每个基因型使用6片叶片用于 测量。
(2)NBT染色：从八周苗龄的突变体Osrlk1(L1和L3)和野生型ZH11植株中分 别取倒二叶，迅速插入浓度为0.1％NBT溶液中，抽真空30分钟，后于室温暗处静置3小 时，染色完成后于95％乙醇中脱去浮色，每个基因型使用6片叶片用于测量。
(3)台盼蓝染色：从八周苗龄的突变体Osrlk1(L1和L3)和野生型ZH11植株中分 别取倒二叶，迅速插入台盼蓝(10克苯酚，10毫升甘油，10毫升乳酸，10毫升ddH2O,0.02 克Trypan Blue)溶液中，加热煮沸两分钟，后于室温处理过夜，第二天用脱色液(250克 水合氯醛溶于100mLddH2O中)脱去浮色。
2、实验结果
如图3，突变体Osrlk1比野生型ZH11细胞死亡程度高；突变体Osrlk1比野生型ZH11过氧化氢积累量高；突变体Osrlk1比野生型ZH11超氧阴离子积累量高。说明突变体有跟 抗病有关的ROS爆发和细胞死亡的现象。
实施例3白叶枯接菌实验
一、实验方法
接种采用剪叶法，采用两种菌株Xanthomonas oryzae pv.oryzae guangdong 4(图3A) 和Xanthomonas oryzae pv.oryzae guangdong 5(图3B)，菌体于28℃培养箱内培养2天成 亮黄色后，用PBS溶液稀释，采用比浊法将浓度稀释至约9×109个细菌/mL。(菌株来源 于广东省农业科学院植物保护研究所)，于水稻孕穗期向突变体Osrlk1(L1和L3)和野生型ZH11植株进行接种。接种时用剪刀蘸取菌液，剪去叶片约2cm长部分，在接种21 天后测量病斑长度。
2、实验结果
如图4所示，接种Xanthomonas oryzae pv.oryzae guangdong 4(图4A)的突变体Osrlk1 病斑长度明显较短，接种Xanthomonas oryzae pv.oryzae guangdong 5(图4B)的突变体 Osrlk1病斑长度也相较于野生型短，说明突变体Osrlk1具有明确的抗白叶枯病的作用，同 时证实OsRLK1基因参与抗病调控网络。
实施例4实时定量PCR(qRT-PCR)分析
一、实验方法
从八周苗龄的突变体Osrlk1和野生型ZH11植株叶片中分别提取RNA，进行逆转录和qRT-PCR检测，以OsActin基因作为内参，2-△△CT函数计算基因表达的相对水平，被用 于检测的基因有OsWRKY45，OsWRKY50，OsPR5，OsPBZ1，OsNAC4，引物见表2。
表2qRT-PCR引物
2、实验结果
如图5所示，抗病相关基因OsWRKY45，OsWRKY50，OsPR5，OsPBZ1，OsNAC4在 突变体Osrlk1中都有显著上调，说明OsRLK1基因的突变会导致抗性基因的激活，激活水 稻的抗病信号响应。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范 围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它 不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神 和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围 之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种提高水稻抗白叶枯病的方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2580
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 1
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ctgtccggga ggaagaggag gctgcaagcc gcaaccatgg tggctttgtg tttcttgtca 120
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cagcagtaca gcggtttatc tacacaacca ttggaaacag tgtaccgtgt taacatgggt 720
ggaccaaagg tcactgcaga caatgatacc ctctccagga cctgggtcac tgacaaaaag 780
tatttagtga acccatctgt gactagagag gttaatgggg ggaaggtcaa ttatatgaaa 840
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<210> 2
<211> 859
<212> PRT
<213> Oryza sativa
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Met Pro Ala Ala Arg Arg Ser Gly Gly Arg Leu Thr Glu Glu Val Asn
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Met Met Val Ala Leu Ser Gly Arg Lys Arg Arg Leu Gln Ala Ala Thr
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Met Val Ala Leu Cys Phe Leu Ser Ser Ile Cys Val Ser Thr Ala Gln
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Phe Lys Pro Ala Asp Asn Tyr Leu Val Asp Cys Gly Ser Ser Lys Ser
50 55 60
Thr Thr Leu Gly Thr Arg Thr Phe Ala Ala Asp Gly Ala Ala Pro Val
65 70 75 80
Lys Val Asp Thr Ser Leu Glu Ile Leu Ala Gly Thr Ser Ala Asn Gly
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Val Ala Ser Phe Asp Asn Ser Ala Leu Tyr Gln Thr Ala Arg Ile Phe
100 105 110
Thr Ser Pro Ser Ser Tyr Thr Phe Pro Ile Gln Lys Gln Gly Arg His
115 120 125
Phe Val Arg Leu Tyr Phe Phe Ala Phe Ala Tyr Gln Ser Tyr Asp Leu
130 135 140
Ser Thr Ala Lys Phe Thr Val Ser Thr Gln Glu Met Leu Leu Leu Ser
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Asp Phe Gln Gln Pro Asp Lys Thr Ala Pro Leu Phe Lys Glu Tyr Ser
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Leu Asn Ile Thr Gln Asp Lys Leu Ile Ile Ser Phe Lys Pro Ser Asn
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Gly Ile Ala Phe Ile Asn Ala Ile Glu Val Val Ser Val Pro Asp Asp
195 200 205
Leu Ile Gly Asp Ser Ala Pro Met Val Asn Pro Met Gln Gln Tyr Ser
210 215 220
Gly Leu Ser Thr Gln Pro Leu Glu Thr Val Tyr Arg Val Asn Met Gly
225 230 235 240
Gly Pro Lys Val Thr Ala Asp Asn Asp Thr Leu Ser Arg Thr Trp Val
245 250 255
Thr Asp Lys Lys Tyr Leu Val Asn Pro Ser Val Thr Arg Glu Val Asn
260 265 270
Gly Gly Lys Val Asn Tyr Met Lys Gly Gly Gly Ser Thr Pro Leu Ile
275 280 285
Ala Pro Asp Ile Val Tyr Ser Thr Ala Thr Glu Leu Ala Ala Ser Asn
290 295 300
Thr Thr Asn Ala Leu Phe Asn Met Thr Trp Gln Phe Asp Val Asp Ser
305 310 315 320
Gly Phe Ser Tyr Leu Ile Arg Phe His Phe Cys Asp Ile Val Ser Lys
325 330 335
Ala Leu Asn Gln Leu Tyr Phe Asn Ala Tyr Val Gly Ser Phe Tyr Ala
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Gln His Asp Ile Asp Leu Ser Ile Gln Ser Met Asn Gln Leu Ala Thr
355 360 365
Ala Ile Tyr Leu Asp Val Val Leu Ser Ser Asn Asp Ala Ser Asn Lys
370 375 380
Leu Ser Ile Ser Ile Gly Pro Ser Thr Leu Asn Asn Ala Leu Pro Asp
385 390 395 400
Gly Ile Leu Asn Gly Leu Glu Val Met Lys Met Ser Ser Gly Ser Gly
405 410 415
Ser Ala Phe Thr Val Gly Ser Ser Gly Ser Asn Lys Asn Leu Gly Val
420 425 430
Ile Ile Gly Ser Val Leu Gly Ala Val Gly Ile Leu Ile Ile Val Leu
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Val Ile Val Leu Leu Cys Arg Lys Lys Lys Thr Leu Glu Lys Gln His
450 455 460
Ser Lys Thr Trp Met Pro Phe Ser Ile Asn Gly Leu Thr Ser Leu Ser
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Thr Gly Ser Arg Thr Ser Tyr Gly Thr Thr Leu Thr Ser Gly Leu Asn
485 490 495
Gly Ser Tyr Gly Tyr Arg Phe Ala Phe Ser Val Leu Gln Glu Ala Thr
500 505 510
Asn Asn Phe Asp Glu Asn Trp Val Ile Gly Val Gly Gly Phe Gly Lys
515 520 525
Val Tyr Lys Gly Val Leu Arg Asp Asp Thr Lys Val Ala Val Lys Arg
530 535 540
Gly Asn Pro Lys Ser Gln Gln Gly Leu Asn Glu Phe Arg Thr Glu Ile
545 550 555 560
Glu Leu Leu Ser Arg Leu Arg His Arg His Leu Val Ser Leu Ile Gly
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Tyr Cys Asp Glu Arg Asn Glu Met Ile Leu Val Tyr Glu Tyr Met Glu
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Asn Trp Lys Gln Arg Leu Glu Ile Cys Ile Gly Ala Ala Arg Gly Leu
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Asp Phe Gly Leu Ser Lys Thr Gly Pro Glu Leu Asp Gln Thr His Val
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Ser Thr Ala Val Lys Gly Ser Phe Gly Tyr Leu Asp Pro Glu Tyr Phe
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Val Leu Leu Glu Val Leu Cys Ala Arg Pro Val Ile Asp Pro Thr Leu
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Pro Arg Glu Met Val Asn Leu Ala Glu Trp Gly Met Lys Trp Gln Lys
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Arg Gly Glu Leu His Gln Ile Val Asp Gln Arg Val Ser Gly Ser Ile
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<212> DNA
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<213> Oryza sativa
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acacctccct ggaaatcct 19
