一种提升菌体生长和产生物酶潜力的基因表达盒
技术领域
本发明属于工业生物
技术领域
，尤其是指一种提升菌体生长和产生物酶潜力的基因表达盒。背景技术
启动子是控制外源蛋白表达的最重要的元件之一，可以调节靶基因的表达时间和水平。就初始转录条件而言，现有的天然启动子一般可分为三类：组成型启动子、诱导型启动子和生长时期特异性启动子。强组成型启动子多用于实现高水平表达，而诱导型启动子和生长时期特异性启动子实现了对表达时间和表达水平的控制，是生产具有宿主毒性蛋白的较好选择。相比于依赖诱导剂的诱导性启动子，时期特异性启动子依赖于细胞密度启动基因表达。启动子PaprE特异性在对数末期表达；PsrfA特异性在对数末期和稳定期表达。这两种启动子在菌体达到最大生物量之前几乎不启动或极弱的启动基因的表达，有利于菌体的生长和积累；达到对数末期或稳定期，能够快速诱导基因表达，有利于目的产物的生产。
角蛋白酶具有专一的降解天然角蛋白的功能，是一种有着强生物活性的蛋白酶。目前文献报道的产角蛋白酶微生物主要来源于细菌、真菌或放线菌，这些微生物大多从羽毛，鸟类羽毛或毛发废弃物堆积处分离获得。角蛋白酶相比于其他蛋白酶可以更温和、高效地处理含有角蛋白的原料，同时其可以改善处理后的角蛋白的营养价值。目前，角蛋白酶广泛应用于医药、化工、饲料、纺织、制革等工业中，在生物制剂的制备、废弃生物资源的利用等方面具有重要的应用价值，因此关于角蛋白酶的研究备受关注。随着对角蛋白酶研究的深入，研究者们发现角蛋白酶的表达具有一定的宿主毒性，其过量表达和积累可能会降解宿主内多种功能性蛋白从而破坏其正常生长与代谢过程，影响产酶菌体数量进而降低目的产物的产量。然而针对该问题，国内外文献中尚未报道有效的解决方法。因此，角蛋白酶的高效表达成为其工业化大规模生产的瓶颈问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种提升菌体生长和产生物酶潜力的基因表达盒。本发明基于启动子工程改造策略调控宿主菌的生长与产酶过程，分别选用时期特异性启动子、拷贝数优化以及核心区序列改造构建出一种提升菌体生长和角蛋白酶产酶潜力的基因表达盒，有效提高了产酶菌体量及角蛋白酶的产量和活性。
一种启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述启动子为菌体密度依赖型自诱导启动子。
一种基因表达盒，所述基因表达盒包括所述的启动子，以及以所述启动子启动表达的角蛋白酶基因。
在本发明的一个实施例中，所述角蛋白酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，或与SEQ ID NO.2具有95％以上同源性的核苷酸序列。
一种基因表达盒的载体质粒。
在本发明的一个实施例中，所述载体为适于芽孢杆菌表达的载体。
一种表达角蛋白酶的重组菌，所述重组菌以所述的启动子启动表达角蛋白酶基因。
在本发明的一个实施例中，所述重组菌的宿主为枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、脆弱杆菌、克劳氏芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌。
一种重组菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，扩增启动子序列，并将两个拷贝数的启动子序列进行串联、将-35区的ATGATA突变为TTGACA、将-10区的TAAAAT突变为TATAAT，得到核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的启动子；
(2)将步骤(1)所得启动子片段回收后构建到携带如SEQ ID NO.2 所示的角蛋白酶基因的质粒中得到重组质粒；
(3)将步骤(2)所得重组质粒转化到宿主菌中，得到所述重组菌。
一种重组菌生产角蛋白酶的方法，将所述重组菌以3～10％接种量接种到发酵罐中，以发酵温度30～40℃、转速100～500rpm、通气量为1～3vvm、 pH为6.5～7.5的条件下发酵生产，得到角蛋白酶。
一种启动子在提高具有宿主毒性的蛋白酶高效表达和生产中的应用。
在本发明的一个实施例中，所述的具有宿主毒性的蛋白酶为角蛋白酶。
所述的角蛋白酶或重组菌在畜牧业、制革业或纺织业中的应用。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明提供了一种提升菌体生长和产生物酶潜力的基因表达盒，有效调控了宿主细胞的生长与产酶，使菌体密度提高了50％，酶活力最高可达到 3500U·mL-1，是对照菌的2.9倍。培养基组分优化改善宿主菌生长并提高产酶量，使角蛋白酶的活力进一步提升到6878U·mL-1。本发明为角蛋白酶的高效表达及产酶研究提供了一种有效策略。角蛋白酶的高效表达对宿主具有一定毒性，影响宿主的生长及产酶能力。本发明通过使用菌体密度依赖型启动子有效调控了产酶工程菌的生长与产酶过程，减少产酶对宿主的影响，从而提高菌体量及产酶量。本发明为工业上生产角蛋白酶等具有一定宿主毒性的蛋白及酶类提供了有效的解决方法。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是本发明菌体密度依赖型启动子替换结果；
图2是本发明启动子拷贝数优化探究结果；
图3是实施例3中启动子核心区域序列改造结果；
图4是本发明实施例4中碳源种类对菌体生长和产酶的影响；
图5是本发明实施例4中葡萄糖浓度对菌体生长和产酶的影响；
图6是本发明实施例5中添加无机盐对菌体生长和产酶的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
角蛋白酶活性测定方法：
以1％(w/v)可溶性角蛋白为底物进行角蛋白酶活性测定，具体方法如下：
在0.5mL经pH 9.0的Tris-HCl适当稀释的酶液中加入0.5mL底物，在 50℃水浴中孵育20min后加入1mL的4％TCA溶液终止反应，然后将样品于12000rpm离心5min，取1mL离心后上清液并加入5mL的0.4M Na2CO3和1mL的福林酚试剂，混合均匀后于40℃水浴中加热20min显色，冷却到室温后于660nm下测定吸光度。对照组先将酶液与TCA溶液进行混合， 50℃水浴中孵育20min后再加入底物，其余操作与实验组一致。所有实验测定3个平行反应数据，最终结果以平均值±标准偏差的形式表示，采用 Excel中STDEV公式进行标准偏差的计算。
酶活定义：在上述反应体系中，酶液水解底物使得660nm下吸光度值每增加0.01为一个酶活力单位，U·mL-1。
实施例1：菌体密度依赖型启动子替换组成型启动子
采用同源重组的方式进行启动子替换，引物设计如表1中所示。以宿主细胞B.subtilis WB600基因组为模板，分别扩增含有同源臂的启动子序列；以pMA5质粒为模板，扩增去除原启动子PHpa II的全质粒序列；利用同源重组酶将启动子片段融合到质粒中原启动子的位置。将重组质粒转化至宿主细胞B.subtilis WB600构建在两种不同菌体密度依赖型启动子的调控下进行角蛋白酶表达的重组菌株。
分别检测野生型宿主菌以及启动子改造的产酶工程菌的生长曲线，结果表明(图1)，在生长对数期，含有菌体密度依赖型启动子的产酶菌株生长明显比组成型启动子产酶菌株迅速，OD600值从8提升到10以上。不同启动子，其酶活性水平也相差较大，前36h组成型表达菌酶活迅速积累，48h 达到最大值约1200U·mL-1；而在启动子PsrfA和PaprE指导下24h内表达量较低，其后快速产酶至60h达最高酶活，其中PaprE改造菌效果优于PsrfA，最高酶活力可达约2300U·mL-1。
表1菌体密度依赖型启动子质粒构建引物
实施例2：利用串联aprE启动子提高角蛋白酶产量
为了进一步提高转录强度，对PaprE启动子的拷贝数进行优化。采用同源重组的方式分别构建含有一至四个PaprE启动子的重组菌。并以单位体积角蛋白酶活性为衡量标准进行启动子拷贝数的筛选。结果如图2所示，相较于单个PaprE，串联后的多拷贝启动子所介导的角蛋白酶活性均有提升。其中，三串联体和四串联体在发酵的前36h表现出高于二串联体的活性，而在发酵培养60h后，各重组菌的发酵液上清中酶活性达到峰值，含有二串联体启动子的重组菌角蛋白酶活性最高，可达到3080U·mL-1，较单拷贝启动子提高了34％。
实施例3：启动子核心区域序列改造提高启动子活性
本研究选用aprE二串联启动子PaprE-PaprE为研究对象，分别将两个aprE 启动子的-35区的ATGATA突变为TTGACA、将-10区的TAAAAT突变为 TATAAT。结果如图3所示，改造前后，菌株前期的生长情况相似，但在达到最大菌浓后，突变菌株的菌浓下降更快。从酶活水平来看，在发酵的前 24h内，均仅有少量泄露表达，在对数后期(24-36h)启动子快速启动角蛋白酶的转录和表达，且优化后的酶活高于未优化的对照株，最高酶活可到达 3500U·mL-1。SDS-PAGE分析结果表明优化后目的蛋白的表达量提高。
实施例4：补充碳源提高菌体前期积累
以TB培养基为基础培养基，分别补充1％的蔗糖、可溶性淀粉、甘油、葡萄糖、果糖、乳糖和甘露醇作为额外碳源。结果如图4所示，在所选碳源中，葡萄糖对菌体生长的促进作用最好，培养12h的菌体浓度已接近8，培养60h后最大菌浓可达到13.6，其酶活力在培养72h后达到峰值3880 U·mL-1。在确定葡萄糖为最佳补充碳源后，研究不同浓度葡萄糖对菌体生长和产酶的影响，结果如图5所示，添加2％葡萄糖使产酶菌株在培养72h后达到最大菌浓15.6，酶活力可达4200U·mL-1，尽管添加3％的葡萄糖使菌株在培养96h后仍呈现上升趋势，但其菌浓在12左右，且增速已趋于平缓，且3％葡萄糖的添加严重抑制了菌体产酶，酶活力不足1000U·mL-1。
实施例5：补充无机盐促进菌体的生长和产酶
分别在培养基中添加0.1g·L-1的氯化钙、硫酸钾、硫酸锌、硫酸镁、硫酸铝、硫酸锰，结果如图6所示，酶活力均有所提升，其中加入少量硫酸钾后酶活提升最多，最高酶活力可达6659U·mL-1。由此可以推测在培养基中加入少量K+可以起到提高酶活的作用。进一步对其进行浓度优化，结果表明培养基中硫酸钾浓度为0.5g·L-1时，酶活达到最高值6878U·mL-1。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种提升菌体生长和产生物酶潜力的基因表达盒
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<170> PatentIn version 3.3
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