具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明做详细具体的进一步说明。

实施例1、杜鹃花RsCHS基因启动子克隆

(一)红比利时杜鹃DNA的抽提

实验所用红比利时杜鹃的花瓣采自宁波北仑亿润花卉有限公司。采样植株要求健康、花朵繁茂、花色艳丽，实验花瓣要求瓣面干净匀称、色彩均匀、无虫斑。活体植株的花瓣先用洗瓶清洗表面浮尘，采集花瓣并迅速液氮冷冻。冷冻花瓣样品在实验室中采用CTAB法提取杜鹃基因组DNA备用。

(二)Tail-PCR引物设计与验证

参照Genome Walking Kit(CodeNo.6108)试剂盒的说明书，设计3条R端引物SP1、SP2、SP3(表1)，与试剂盒中的4条随机引物分别配对，进行3轮巢式PCR扩增。另外，设计两条OFR验证引物CHS-F、CHS-R(表1)。

表1：Tail-PCR中3条R端引物SP1、SP2、SP3的序列

(三)Tail-PCR实验过程

以红比利时杜鹃基因组DNA为模板，使用Vazyme公司的phantamaxfidelity DNApolymerase试剂盒，参照说明书PCR程序，以设计好的SP1、SP2、SP3等三条引物为下游引物，以试剂盒内的4条随机引物(AP1、AP2、AP3和AP4)为上游引物，分别进行三轮PCR扩增。三轮扩增实验过程如下：

第一轮PCR扩增(20个循环)：模板为红比利时基因组DNA，4条随机引物AP1、AP2、AP3、AP4与SP1引物分别配对进行4组第一轮PCR扩增，扩增程序为如下：

②1st PCR反应条件如下：

第二轮PCR扩增(20个循环)：分别取第一轮扩增的4组产物2μl为本轮模板，使用上述4条随机引物与SP2引物再次分别配对进行4组第二轮PCR扩增，扩增程序如下：

②2nd PCR反应条件如下：

第三轮CPR扩增(25个循环)：分别取第二轮扩增的4组产物2μl为本轮模板，使用上述4条随机引物与SP3引物再次分别配对进行4组第三轮PCR扩增(25个循环)。

②3rd PCR反应条件如下：

以上三轮PCR扩增结果表明，第三轮扩增产物中AP1-SP3扩增结果有明显条带，割胶回收此位置约2000bp的电泳条带。回收产物末端加A尾后，连接pMD19-T载体，构建T克隆，转化大肠杆菌后并经引物对CHS-F和SP3验证后，挑取阳性克隆送样测序，测序引物为通用引物M13(-47)，测序结果拼接后得到CHS基因的启动子序列，结果SEQ ID NO.1所示。

实施例2、红比利时杜鹃花RhCHS基因启动子的顺式作用元件分析

借助PlantCARE对获得的1477个启动子序列做顺式作用元件分析，顺式元件名称、数量和位置如表2、图1所示。

表2：红比利时杜鹃RhCHS基因启动子顺式作用元件类型、位置与数量表

实例3、重组载体的构建

PstI和NcoI双酶切pCambia1301载体，切除GUS基因前的35S Promoter，回收载体骨架后和CHSP片段进行重组反应。反应产物转化大肠杆菌DH5α，涂布Kana抗性平板，37℃过夜培养后挑取8个抗性菌落，用上述扩增引物进行PCR鉴定阳性菌落后，挑取15号克隆进行测序。双向测序引物为M13-R:CAGGAAACAGCTATGAC、Gus-R:GAAAAGGGTCCTAACCAAGA。

结果显示，重组载体中所获得的启动子序列与Tail-PCR实验所获得的启动子序列完全一致，证明重组载体构建成功。测序结果及分析结果见图2。

实施例4、重组载体转化拟南芥验证活性

(一)农杆菌注射接种本氏烟草(Nicotiana benthamiana)

采用冻融法将重组质粒转化农杆菌株GV3101感受态(同时转化pCambia1301空载体和去除GUS基因的1301载体分别作为阳性和阴性对照)，涂布在加有抗生素(含kana50mg/L、Rif 25mg/L、Gen 25mg/L)的LB培养基平板，挑取抗性单克隆进行PCR验证后，接入5ml YEP液体培养基(含上述同样抗生素)中，在28℃、160rmp转速的培养箱中过夜培养。培养物离心收集后用5ml的重悬液(含10mM MgCl₂、10mM MES、150μM As)重悬并室温静止3h。静置后的农杆菌注射5叶期的本氏烟草(约生长1个月)的叶片(下表皮)，每株可以注射2-3个叶片(处于植株的相同位置，生长状态、大小相近)，每个处理注射3片，设为3个重复。注射后的植株在25℃黑暗过夜后，转移到16h光照，8h黑暗条件下生长。

(二)GUS染色

农杆菌注射后3-5天，采集注射叶接种部位(3个重复)，加GUS染液于37℃过夜染色。染色后的叶片再用75％的乙醇脱色(去除叶绿素)，也于37℃过夜。倒掉脱色乙醇后再用75％乙醇清洗后观察并拍照，结果如图3、图4所示。

如图3、图4所示，可以明显地看出RhCHS基因启动子重组载体的颜色深于1301阳性载体深于阴性载体，这也验证了本发明的红比利时杜鹃花查尔酮合成酶在花色表达方面的作用。

如图3、图4所示，可以明显地看出RhCHS基因启动子重组载体的GUS染色要明显深入pCAMBIA1301阳性对照。结果表明，RhCHS基因启动子具有明显促进RhCHS基因表达的活性，后期可通过改变启动子的序列实施对RhCHS基因表达活性的调节，继而调整组织中花色苷的含量，在花色育种中发挥作用。

本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合生物基因工程领域的市售产品。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

序列表

<110> 浙江万里学院

<120> 红比利时杜鹃花瓣RhCHS基因启动子及花色育种应用

<130> 2020.6.2

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1477

<212> DNA

<213> 比利时杜鹃花(Rhododendron of Belgium)

<400> 1

tttaagtgca tacaaattta aatcgtccat tgctcggtta aaatccgaaa tgtcgattgg 60

caaaataagc gaccgatctg accggattgg ccgctctgca gggagcccat tcccccttca 120

tcccatttcg ccaacccgtc ttgaccacct cacctaacta acacttcccc acaactaaaa 180

ttgtttaaac ctggggcaga gcaaatgaat taaaatttgg gatggcaaaa ttagaagaaa 240

tcaacccatt atgataatag gataaagttc ttatatttac gtaaaaatag tagacatttc 300

aaggttaatc gtccataatc atctataatt agatgtgaca ctttaatttt tttttcccca 360

gttaatcatc tataatacat gttttaaggt tggtcaccta ttaacacaga gcaaatagat 420

tttaaaacaa tctatttaaa tggaactcgg tgtttctttt aagtctgaaa aactattcac 480

ggttgattct aaactaaatt tcaaaccccc gttcgttact cttcttaaat agagtaattt 540

gtatacaagt ttctttgact gcttcgtgaa cttttttttt tacttttttt tttctcttta 600

gagaattgtt tttagaattt ttttttgcac tttacgaata tttttctaat gtagttctat 660

ctaagaataa atatatttag aaggaattca caaaaattac tgaaaacgaa acaaagttga 720

gaaagatcaa taagtcaaat gtcaagtcaa agttggattt tttttttcat tattgtactt 780

tttaaatttt ggaaacctct attttttatt ttcaagcgcg taattgatgt acccagaagt 840

aaaaattttg ataaaatatt taaaaacatt gaataaatag aaaacgcgaa accatgcgta 900

acttcttcat cccaaaaaat ctcttacaaa aacataacag acataaagca atttcccttt 960

ccatgtttta taagggaagt gccggagaga aatcatcttt cgttttttcc gaaacctaat 1020

tttgataacc ctcaacgctc aaaaagcttg ttctaggacg gaatactaat gtaagcacgt 1080

gtaggagtgc gtgtttgtct gtcttcgtga gcttattcta aaataatctt tatggtattt 1140

ttttatttta aaaattatct tgcaacccat gttttcccta ttaaatgaat tattatgaag 1200

taggtataca agaatctcca tatcatgtgg aggcttttga agggggaaat gtagatacac 1260

caaaacccaa ctcacgtgct agccggcctc tccaagtagt catagcacgt gattccaaac 1320

taccatttct attggtcaca tatatatacc acccacaata ccaccaagtt ttgtcacaag 1380

ctgatcaaca attatctacc actccaagct gcttgtacta acacctacaa accacaaaaa 1440

ctccggccac cgctaaatta ttttttccgg cgaaaag 1477

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> SP1

<400> 2

caaacataag tcagtaaccg tcaccc 26

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> SP2

<400> 3

aaggctcatc cgacgacgat tc 22

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> SP3

<400> 4

acccccgtaa tcagaatata tgcacg 26