具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例中使用的引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成；qRT-PCR试剂采用Premix Ex Taq^TM，购自宝生物工程(大连)有限公司(货号为Code No.RR420A)。

实施例1、非同源ODN序列(SEQ ID NO.6)以及获得方式。

(1)ssODN donor的获得：

ssODN donor的序列为：

5′-P-G*T*TTAATTGAGTTGTCATATGTTAATAACGGT*A*T-3′

其中“P”表示5′磷酸化，“*”表示2个核苷酸之间的硫甙修饰。序列合成和修饰均由苏州金唯智生物公司完成。合成的干粉加入无菌的去离子水，稀释成50μM的浓度用于后续转染。

(2)dsODN donor的获得：

首先合成2条反向互补配对的ssODN，序列如下：

oligo 1：5′-P-G*T*TTAATTGAGTTGTCATATGTTAATAACGGT*A*T-3′

oligo 2：5′-P-A*T*ACCGTTATTAACATATGACAACTCAATTAA*A*C-3′

同样的，其中“P”表示5′磷酸化，“*”表示2个核苷酸之间的硫甙修饰连接。2条互补的ssODN序列合成和修饰均由苏州金唯智生物公司完成。合成的干粉加入无菌的去离子水，稀释成125μM的浓度用于后续的退火步骤。

2条单链ssODN退火形成双链dsODN donor

首先，配置10x的Oligoduplex Annealing Buffer(STE)作为退火所需要的缓冲液：

然后，在200μL无菌反应管中加入如下反应体系：

最后，配置好的退火反应体系在PCR仪中完成，反应程序为：95℃，5min→每30s降1℃(共70个循环)→4℃hold。

实施例2、靶向HPV18 E7的CRISPR/Cas9质粒表达载体的构建

(1)从NCBI网站中查询获HPV18 E7癌基因的全长序列信息，针对HPV18的E7设计sgRNA，并初步筛选出效果较好的以下sgRNA：

E7-sgRNA1

CGAGCAATTAAGCGACTCAGgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc(SEQ ID NO.1)。

E7-sgRNA2

TCGTGACATAGAAGGTCAACgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc(SEQ ID NO.2)。

E7-sgRNA3

AGAGCCCCAAAATGAAATTCgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc(SEQ ID NO.3)。

E7-sgRNA4

CATTGTGTGACGTTGTGGTTgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc(SEQ ID NO.4)。

E7-sgRNA5

ACGTTGTGGTTCGGCTCGTCgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc(SEQ ID NO.5)。

其中，大写字母为crRNA序列，即与靶DNA结合的序列，小写字母部分为scaffold，即sgRNA发挥作用的二级结构区域。经进一步实验验证，E7-sgRNA3、E7-sgRNA4和E7-sgRNA5的效果不佳，确定用于靶向HPV18 E7的CRISPR/Cas9系统的sgRNA为E7-sgRNA1(SEQ IDNO.1)或E7-sgRNA2(SEQ ID NO.2)。

(2)CRISPR/Cas9-E7的表达载体构建方法参考引文中的构建方法完成构建(Cong,L.et al.Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.Science 339,819-823,doi:10.1126/science.1231143(2013).)：

将E7-sgRNA1或E7-sgRNA2和Cas9序列克隆到表达载体PX330上，构建针对HPV18E7的真核表达载体CRISPR/Cas9-E7质粒，构建完成后，通过常规测序比对确定构建载体序列正确无突变，挑选出完全正确的克隆进行扩增并提取质粒。

实施例3、CRISPR/Cas9-E7质粒及非同源dsODN共转后dsODN能整合至DSB处的验证

CRISPR/Cas9-E7质粒转染到细胞后表达出来的靶向HPV18 E7的CRISPR/Cas9-E7系统，可以迅速识别HPV18 E7序列，发挥切割作用。切割后细胞主要通过不受细胞周期限制的NHEJ途径快速修复，从而引入小片段的插入或缺失(indel)，导致移码突变，最终使得E7功能丧失，HPV18 E7癌蛋白的表达受到抑制。共转dsODN后，一方面dsODN能够整合至断点处，另一方面能够激发细胞NHEJ途径，引入更多indel，从而提高靶基因的敲除效率。

具体操作方法是：

(1)细胞培养

HPV18阳性宫颈癌细胞系HeLa用含有10％血清的DMEM完全培养基在37℃、5％CO₂培养箱里培养。待细胞融合度达到90％时用0.25％的胰酶消化后，用DMEM完全培养基终止消化，接种到6孔板中，继续培养24小时。

(2)CRISPR/Cas9-E7质粒和非同源dsODN共同转染

24小时后，确认细胞贴壁良好，细胞融合度达到80％，即可进行转染。每孔转染2μgCRISPR/Cas9-E7质粒和2μL非同源dsODN，使用Roche公司的X-tremeGENE HP DNATransfection Reagent转染试剂按照说明书要求进行转染，与未处理的细胞组、转染等量CRISPR/Cas9-E7质粒的细胞组、转染等量CRISPR/Cas9-E7质粒和非同源ssODN的细胞组对照。转染后的细胞继续在37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(3)基因组DNA提取

转染48小时后，常规0.25％的胰酶消化，用DMEM完全培养基终止消化，收集细胞到离心管中，300g离心5分钟,弃除培养基，PBS洗涤一次，再次300g离心5分钟，弃除PBS，获得细胞渣，使用细胞基因组提取试剂盒(全式金生物技术有限公司，货号：EE101-01)提取细胞基因组DNA，测量DNA浓度。

(4)引物的设计

根据HPV18 E7基因序列及非同源dsODN设计引物，引物一端在dsODN上，另一端位于靶基因上。本实施例中对应的引物序列为：

ODN-F:TTGAGTTGTCATATGTTAATAACGGT(SEQ ID NO.7)。

HPV18-E7-R:GTTGCTTACTGCTGGGATGC(SEQ ID NO.8)。

(5)PCR反应

以上述提取的基因组DNA为模版，用上述引物进行PCR反应。本实验使用的高保真DNA聚合酶为北京全式金生物科技有限公司的PCR SuperMix(货号：AS111-02)。

PCR反应体系：

PCR反应条件：

PCR反应完成后，取少量PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果初步判定PCR产物的浓度以及条带大小是否正确等。

(6)目标条带Sanger测序

图3、图4试验结果显示琼脂糖凝胶电泳有目标条带，条带测序结果比对正确，说明共转CRISPR/Cas9-E7质粒和非同源dsODN的HeLa细胞组已将dsODN整合至DSB处。未处理的细胞组、转染等量CRISPR/Cas9-E7质粒的细胞组、转染等量CRISPR/Cas9-E7质粒和ssODN的细胞组均无目标条带显示。

实施例4、qRT-PCR明确共转CRISPR/Cas9-E7质粒和dsODN对HPV 18 E7 mRNA转录水平的影响

(1)样品RNA的抽提

①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离：每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60％。

③RNA沉淀：将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗：移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75％乙醇(75％乙醇用DEPCH₂O配制)，清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥：小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀：溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

(2)按下列组份配制PCR反应液(反应液配制均在冰上进行)

应用Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System进行Real TimePCR反应，反应程序采用两步法PCR扩增标准程序：

Stage 1：预变性

Reps：1

95℃30秒

Stage 2：PCR反应

Reps：40

95℃5秒

60℃30～34秒

图5显示，共转CRISPR/Cas9-E7质粒和dsODN的HeLa细胞组HPV18 E7 mRNA转录水平明显降低，说明其靶向敲除HPV18 E7基因的效果优于转染等量CRISPR/Cas9-E7质粒的细胞组、转染等量CRISPR/Cas9-E7质粒和共转非同源ssODN的细胞组。

实施例5、扩增子测序进一步评估共转CRISPR/Cas9-E7质粒和非同源dsODN对靶基因的编辑效率

以实施例3中提取的基因组DNA为模版，根据靶点设计引物并进行PCR反应。本实验使用试剂为KAPABiosystems公司的KAPAHiFi HotStart ReadyMix(货号KK2602)。

(1)引物的设计

根据靶点设计引物，引物两端分别位于靶点两侧。本实施例中对应的引物序列为：

E7-NGS-F：

ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGCATGGACCTAAGGCAACA(SEQ ID NO.9)。

E7-NGS-R:gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctgctcaattctggcttcacact(SEQID NO.10)。

(2)第一轮PCR

反应体系：

反应条件：98℃for 3min；25cycles of(98℃for 20s,65℃for 15s,72℃for15s),72℃for 1min,4℃for∞

(3)第二轮PCR

反应体系：

反应条件：98℃for 3min；11cycles of(98℃for 20s,65℃for 15s,72℃for15s),72℃for 1min,4℃for∞

(4)第二轮PCR扩增产物切胶回收，定量，进行测序及数据分析。

图6实验结果显示，共转CRISPR/Cas9-E7质粒和非同源dsODN的HeLa细胞组Indel％明显高于转染等量CRISPR/Cas9-E7质粒的细胞组、转染等量CRISPR/Cas9-E7质粒和非同源ssODN的细胞组，其中一部分是由于ODN的整合插入。

当sgRNA为E7-sgRNA1时，共转CRISPR/Cas9-E7质粒和非同源dsODN的HeLa细胞组Indel％可达40％，相比转染等量CRISPR/Cas9-E7质粒的细胞组、转染等量CRISPR/Cas9-E7质粒和非同源ssODN的细胞组分别提高了25％左右，其中代表断点处有ODN插入占总插入缺失(Indel)的66％左右；当sgRNA为E7-sgRNA2时，共转CRISPR/Cas9-E7质粒和非同源dsODN的HeLa细胞组Indel％可达65％左右，相比转染等量CRISPR/Cas9-E7质粒的细胞组、转染等量CRISPR/Cas9-E7质粒和非同源ssODN的细胞组分别提高了20％左右，其中“ODN％”代表断点处有ODN插入占总插入缺失(Indel)的17％左右。CRISPR/Cas9-E7质粒共转非同源dsODN可显著增强靶向敲除人乳头瘤病毒E7基因的效率。

实施例6、共转染的dsODN作为标记物监测的脱靶情况

1)GUIDE-Seq建库流程示意图见图7。

2)准备Y型接头：

Y型接头是通过将Miseq通用寡核苷酸(MiSeq Common Adapter)分别与每个样品条形码接头引物(A##adapter)进行退火而制成的：其中，Miseq通用寡核苷酸接头序列为P-GATCGGAAGAGC*C*A(“P”表示磷酸化，“*”表示硫甙修饰)，样品条形码接头引物序列为：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAGATCGCNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T

其中，“NNWNNWNN”为分子index标签，“*”表示硫甙修饰。

准备Y型接头的退火反应体系为：

3)准备DNA样品：

电转3天后收细胞，按照前述抽提DNA的方法抽提DNA，DNA采用Qubit测定浓度，A260/280需在1.8-2.0之间为合格，浓度大于20ng/μL、总量大于1μg为合格。

使用1xTE缓冲液(即10mm Tris-HCL，无EDTA)稀释到最终体积为120μL。

根据Covaris S2仪器的标准操作方案，将每个样品的DNA打断至平均长度为500bp。

4)打断的DNA样本纯化：

将纯化磁珠提前拿至室温，震荡混匀室温孵育30min后再使用。

将打断后的样品转入1.5mL专用纯化EP管中，加入120μL磁珠。

轻轻吸打混匀6次，室温静置孵育10min，将PCR管置于磁力架上3min使溶液澄清。

移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向PCR管内加入200μL新鲜配制的80％乙醇溶液，静置30s。

移除上清，再次向PCR管内加入200μL80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清。

室温静置5min，使残留乙醇彻底挥发。

加入20μL的1x TE缓冲液，轻轻吸打重悬磁珠后移开磁力架，室温静置2min。

将PCR管置于磁力架上2min使溶液澄清。

用移液器小心吸取15μL上清液(磁珠洗脱后，吸取上清液时不要吸取磁珠)，转移到新的PCR管中，标记好样本，用于下一步反应。

5)末端修复

在200μL PCR管中，添加以下(每个反应)，反应体系为：

6)加A尾和连接

在上一步完成的反应管中，添加以下(每个反应)，反应体系为：

7)加A尾后的产物纯化

将PEG/NaClSolution预先拿出来恢复到室温。

每个样品中加入0.9x(也即是22.95μL)的PEG/NaClSolution后，充分混匀，转移到1.5mL低吸附管中，室温孵育15min后按照常规纯化步骤进行纯化。

每个磁珠样品中加入12μL1xTE缓冲液进行洗脱后，转移到标注好的PCR小管。

8)第一轮PCR及纯化

在200μL的反应管中，添加以下(每个反应)，反应体系为：

所对应的引物使用如下：

P5-1的引物序列为：aatgatacggcgaccaccgagatcta(SEQ ID NO.11)，由苏州金维智公司合成。

GSP1 Primer：由GSP1(+)和GSP1(-)混合而成，GSP1(+)引物的序列为：ggatctcgacgctctccctgtttaattgagttgtcatatgttaataac(SEQ ID NO.12)；GSP1(-)引物的序列为：ggatctcgacgctctccctataccgttattaacatatgaca(SEQ ID NO.13)。

第一轮PCR的磁珠纯化：

将PEG/NaClSolution预先拿出来恢复到室温。

每个样品中加入1.2x(也即是36μL)的PEG/NaClSolution后，充分混匀，转移到1.5mL低吸附管中，室温静置孵育15min后按照常规纯化步骤进行纯化。

每个磁珠样品中加入15μL的1xTE缓冲液进行洗脱。

第二轮PCR及纯化

所对应的引物使用如下：

P5-2的引物序列为：aatgatacggcgaccaccgagatctacac(SEQ ID NO.14)，由苏州金维智公司合成。

GSP2 Primer的序列：由GSP2(+)和GSP2(-)混合而成，GSP2(+)引物的序列为：cctctctatgggcagtcggtgatacatatgacaactcaattaaac(SEQ ID NO.15)；GSP2(-)引物的序列为：cctctctatgggcagtcggtgatttgagttgtcatatgttaataacggta(SEQ ID NO.16)。

P7-#引物的序列为：caagcagaagacggcatacgagat(nnnnnnnn)

gtgactggagtcctctctatgggcagtcggtga，其中“nnnnnnnn”为8bp的barcode序列，用于区分样品。

在200μL的反应管中，添加以下(每个反应)，反应体系为：

第二轮PCR的磁珠纯化步骤：

将PEG/NaClSolution预先拿出来恢复到室温。

每个样品中加入0.7x(也即是21μL)的PEG/NaClSolution后，充分混匀，转移到1.5mL低吸附管中，室温静置孵育15min后按照常规纯化步骤进行纯化。

每个磁珠样品中加入30μL的1xTE缓冲液进行洗脱。

第二轮PCR纯化后的样品，先使用qubit定量，根据A260/280查看文库DNA的纯度，1.8～2.0之间为合格。用于后续的高通量测序上机。

10)上机测序：

qPCR文库定量：将每个子文库稀释到4nM然后等体积混合成pool。

文库平衡：用25％文库比例的phix进行文库平衡：先将phix稀释至4nM(原浓度为10nM)，然后以体积比phix文库(4nM)：pool文库＝1：3进行混合得到25％phix的pooling文库。具体地，就是phix取0.8μL原液(即8nM)加入1.2μL水，phix总的就2μL。phix文库(4nM)：pooling文库＝2μL：6μL，总共8μL体积。

文库变性：从上一步的8μL中取5μL，与5μL 0.2M的NaOH混合变性5min(此时文库浓度为2nM)。

文库稀释：上一步的文库上机前需稀释成1.2pM终浓度，以得到更好的上机数据质量。稀释方法为：取10μL上步骤得到的变性文库与990μL的HT1缓冲液进行震荡混合(此时文库浓度为20pM)。然后取90μL上混合液与1410μL的HT1缓冲液进行震荡混合得到终浓度为1.2pM的上机文库。

提前将-20℃存放的上机试剂(方板)化冻1-2h，化冻后需拍打除掉底部小气泡。并且。提前将flowcell从4℃取出平衡至室温，使其干燥干净。

上机引物稀释：上机引物稀释成0.3μM的浓度。

选择选择Nextseq Mid试剂盒，Paired End双端测序程序，按测序仪指示步骤进行上机测序。

11)数据分析：

序列读取的处理和整合：将测序所得序列中，前6个碱基相同的序列，以及具有同样8个碱基的分子index标签的序列归一整合在一起，将其认定为来自同一个pcr处理前的样本。利用BWA-MEM软件程序，将整合后的序列比对到人类基因组参考序列(GrCh38)。

分析判定脱靶位点：将比对质量≥50的reads所起始的匹配位置保留并显示，采用10bp的滑动比对窗口将比对区域进行分组。分析出包含有整合的dsodn序列的reads，然后采用基于bin-consensus变异调用算法的分子index和SAMtools的计算机分析工具，在这些有dsODN序列的位置调用为SNPs和indels，然后将其比对参考基因组的非靶标序列，从而判断dsODN序列在细胞基因组上整合的具体参考坐标，从而判定为在靶或脱靶位点。

共电转的dsODN donor监测CRISPR-Cas9系统在HPV18 E7靶点的在靶与脱靶情况。图8显示当采用single E7-sgRNA1靶向切割HPV18 E7基因时，在靶位点可以检测到36505条reads，并且可以检测到1个脱靶位点。当采用single E7-sgRNA2靶向切割HPV18 E7基因时，在靶位点可以检测到75596条reads，并且可以检测到2个脱靶位点。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 珠海舒桐医疗科技有限公司

<120> 非同源双链寡聚核苷酸片段在基因敲除系统中的应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 1

cgagcaatta agcgactcag gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgc 96

<210> 2

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 2

tcgtgacata gaaggtcaac gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgc 96

<210> 3

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 3

agagccccaa aatgaaattc gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgc 96

<210> 4

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 4

cattgtgtga cgttgtggtt gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgc 96

<210> 5

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 5

acgttgtggt tcggctcgtc gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgc 96

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 6

gtttaattga gttgtcatat gttaataacg gtat 34

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 7

ttgagttgtc atatgttaat aacggt 26

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 8

gttgcttact gctgggatgc 20

<210> 9

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 9

acactctttc cctacacgac gctcttccga tcttgcatgg acctaaggca aca 53

<210> 10

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 10

gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgctcaa ttctggcttc acact 55

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 11

aatgatacgg cgaccaccga gatcta 26

<210> 12

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 12

ggatctcgac gctctccctg tttaattgag ttgtcatatg ttaataac 48

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 13

ggatctcgac gctctcccta taccgttatt aacatatgac a 41

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 14

aatgatacgg cgaccaccga gatctacac 29

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 15

cctctctatg ggcagtcggt gatacatatg acaactcaat taaac 45

<210> 16

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 16

cctctctatg ggcagtcggt gatttgagtt gtcatatgtt aataacggta 50