本申请公开了一种D-甘露糖异构酶(简称MIase)固定化酶,包括酶载体和MIase。本申请还提供一种MIase固定化酶的制备方法和应用,本申请所述MIase固定化酶采用大孔树脂作为载体,MIase与大孔树脂通过共价键或离子吸附的方式结合在一起,所述MIase固定化酶具有良好稳定性和酶催化活性,在流速0.4BV/h、底物浓度750g/L条件下,45℃时连续转化90天,转化液中D-甘露糖浓度稳定在200g/L以上、转化率稳定在27%以上。此外,所述MIase固定化酶的制备工艺简单、工艺过程中不添加任何有毒性的有机溶剂,属于环境友好型的绿色制造工艺。