D-甘露糖异构酶固定化酶及其制备方法和应用
技术领域
本申请涉及生化工程
技术领域
，具体涉及一种D-甘露糖异构酶(简称MIase)固定化酶及其制备方法和应用。背景技术
D-甘露糖是D-果糖的醛糖异构体，同时也是D-葡萄糖的C-2位差向异构体。其甜度约为蔗糖的57％～72％，每克产生的热量约为葡糖糖的一半。在自然界中，D-甘露糖常以甘露聚糖或其他聚合物的形式存在于植物组织中。
在人体内，D-甘露糖分布在体液与组织当中，且不易代谢，它参与人体的免疫调节和糖蛋白的合成。因为D-甘露糖具有多种生理效应，如促进伤口的愈合、抑制癌细胞的存活和肿瘤的增长、防止尿道系统细菌感染、促进免疫系统调节、抗炎作用等，所以对人体的健康具有重要的作用。
目前，关于D-甘露糖的应用报道颇为广泛。在食品工业上，D-甘露糖常被作为甜味添加剂用于保健品以及饮料中；医药上，D-甘露糖可作为原料合成价值更高的免疫刺激剂和抗肿瘤相关药物；养殖业上，D-甘露糖可用于饲料中防止肉用仔鸡被沙门氏菌感染以提高产蛋量；化学合成上，D-甘露糖可用作原料合成各种衍生物，如三氟甘露糖以及L-核糖等。其广泛的应用使得D-甘露糖具有良好的经济价值和市场前景。
D-甘露糖的制备方法主要有提取法、化学合成法和酶转化法。提取法通常以富含D-甘露糖的聚糖如棕榈籽、寡糖、甘露聚糖等为原料，经水解、分离提纯获得D-甘露糖；化学合成法通过D-葡萄糖在六价钼酸盐的化学催化剂作用下，经差向异构化形成D-甘露糖，或由D-阿拉伯糖增长碳链等方法来获得D-甘露糖，也可由D-甘露醇(海带制碘工业的副产品)在亚铁离子存在下，用过氧化氢氧化合成；酶转化法通过微生物来源的异构酶，将葡萄糖或果糖转化为D-甘露糖，也有报道，通过构建多酶级联的反应体系，可以将甲醛、甘油、麦芽糊精、蔗糖等转化为D-甘露糖。酶转化法具有反应条件温和、原料来源广泛、工艺步骤简单等优点，极具开发价值和应用潜力。
目前文献报道，主要有四种微生物酶可以转化产生D-甘露糖，包括D-来苏糖异构酶(LIase,EC 5.3.1.15)、D-甘露糖异构酶(MIase,EC5.3.1.7)、纤维二糖2-异构酶(CEase,EC 5.1.3.11)和D-甘露糖2-异构酶(MEase,EC 5.1.3.-)。
酶转化法又分为自由酶(包括整体细胞、粗酶或提纯酶)转化法和固定化酶转化法。自由酶转化法采用批次转化方式，酶只能利用一次，酶的利用率极低；固定化酶转化法，通常采用连续转化方式，也可采用底物定期更新的循环转化方式，可有效提高酶的利用率、大幅降低酶的使用成本。
目前文献报道的用于制备D-甘露糖的固定化酶的制备，主要以脱乙酰壳多糖、阴离子树脂作为固定化载体，或利用硅藻土载体进行整体细胞固定化。US6897047公开了一种以脱乙酰壳多糖为载体的固定化MIase制备方法，在载体处理过程中需要消耗乙酸和大量的NaOH，果糖底物浓度20％、流速0.067-0.01BV/h条件下，55℃时酶活半衰期约10个月、连续转化25天内转化率稳定在23.1～24.0％；60℃时酶活半衰期约2～3个月、连续转化25天内转化率稳定在19.4～22.5％。ParkCS等[Biotechnol Lett(2010)32:1305–1309.]采用陶氏弱碱性阴离子树脂DuoliteA568制备的LIase固定化酶，果糖底物浓度300g/L、35℃时每转化1小时更换一次果糖底物并清洗LIase固定化酶、循环转化23次，转化液中D-甘露糖浓度稳定在75g/L、转化率稳定在25％。US5240717公开了一种以硅藻土(No.R-620)为载体的整体细胞固定化酶制备D-甘露糖的方法，果糖底物浓度30％、流速0.1BV/h条件下，45℃时连续转化，转化液中D-甘露糖浓度达到68mg/ml、转化率为22.67％，7天后转化液中D-甘露糖浓度为65mg/ml、转化率为21.67％。上述方法，均存在连续转化或循环转化时的底物浓度较低(20～30％)、流速较低(0.067～0.1BV/h)、转化率较低(19.4～24.0％)等问题。
发明内容
针对上述现有技术的缺点及不足之处，本申请提供了一种MIase固定化酶及其制备方法和应用，MIase固定化酶采用大孔树脂作为载体，MIase与大孔树脂通过共价键或离子吸附的方式结合在一起，所述MIase固定化酶具有良好的稳定性和酶催化活性，在流速0.4BV/h、底物浓度750g/L条件下，45℃时连续转化90天，转化液中D-甘露糖浓度稳定在200g/L以上、转化率稳定在27％以上，与现有技术相比，酶转化效率大幅提升。此外，所述MIase固定化酶的制备工艺简单、工艺过程中不添加任何有毒性的有机溶剂，属于环境友好型的绿色制造工艺。
本申请提供如下技术方案。
1、一种MIase固定化酶，其特征在于，包括酶载体和MIase。
2、根据项1所述的MIase固定化酶，其特征在于，所述MIase与酶载体的酶活质量比(U/g)为(800-2500)：1，优选为(1000-2000):1。
3、根据项1所述的MIase固定化酶，其特征在于，所述酶载体为大孔树脂；所述酶载体与MIase通过共价键或离子吸附的方式结合在一起。
4、根据项1所述的MIase固定化酶，其特征在于，所述酶载体为中性或弱碱性大孔树脂，优选为中性大孔树脂。
5、根据项1所述的MIase固定化酶，其特征在于，所述酶载体为聚丙烯酸类大孔树脂或聚苯乙烯类大孔树脂，优选为聚丙烯酸类大孔树脂。
6、根据项1所述的MIase固定化酶，其特征在于，所述酶载体为带有疏水性骨架或亲水性骨架的聚丙烯酸类大孔树脂或聚苯乙烯类大孔树脂，优选为带有亲水性骨架的聚丙烯酸类大孔树脂。
7、根据项1所述的MIase固定化酶，其特征在于，所述酶载体选自带有环氧基团或胺基基团的聚丙烯酸类大孔树脂或聚苯乙烯类大孔树脂；优选为带有环氧基团的聚丙烯酸类大孔树脂。
8、根据项1所述的MIase固定化酶，其特征在于，所述MIase固定化酶的酶活为250U/g～650U/g，优选为500U/g～650U/g。
9、一种MIase固定化酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将MIase酶液与酶载体混合，摇床振荡，形成混合液，弃去所述混合液的上层液体，洗涤所述混合液的下层固体，从而得到MIase固定化酶。
10、根据项9所述的制备方法，其特征在于，所述摇床振荡的时间为10～36h，优选为12～20h。
11、根据项9所述的制备方法，其特征在于，所述MIase与酶载体混合后，摇床振荡反应的温度为15～35℃，优选为20～25℃。
12、根据项9所述的制备方法，其特征在于，所述MIase固定化酶为项1-8任一项所述的MIase固定化酶。
13、一种D-甘露糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将果糖水溶液通过装有MIase固定化酶的反应器中进行连续转化，得到含有D-甘露糖的溶液；
所述MIase固定化酶为项1-8任一项所述的MIase固定化酶。
14、根据项13所述的制备方法，其特征在于，所述含有D-甘露糖的溶液，经连续色谱分离、浓缩脱色提纯，获得纯度为99％以上的D-甘露糖。
本申请提供的MIase固定化酶，采用大孔树脂作为载体，MIase与大孔树脂通过共价键或离子吸附的方式结合在一起形成具有良好的稳定性和酶催化活性的MIase固定化酶，而且大孔树脂属于人工合成的材料，该载体的物理性能和化学性能稳定，抗腐蚀性强，树脂材料本身强度较大，不易出现变形或损坏，使得所述MIase固定化酶可以连续循环使用，有效提高了酶的利用率，预期可以大幅降低生产成本。
附图说明
附图用于更好地理解本申请，不构成对本申请的不当限定。其中：
图1为不同底物浓度条件下，MIase转化时果糖转化率变化示意图；
图2为750g/L底物浓度条件下，酶载体CZ01制备的MIase固定化酶连续转化时果糖转化率变化示意图。
具体实施方式
以下对本申请的示范性实施例做出说明，其中包括本申请实施例的各种细节以助于理解，应当将它们认为仅仅是示范性的。因此，本领域普通技术人员应当认识到，可以对这里描述的实施例做出各种改变和修改，而不会背离本申请的范围和精神。同样，为了清楚和简明，以下的描述中省略了对公知功能和结构的描述。
本申请提供一种MIase固定化酶，包括酶载体和MIase。
在本申请中，所述MIase与酶载体的酶活质量比(U/g)为(800-2500)：1，优选为(1000-2000):1；
所述MIase与酶载体的酶活质量比(U/g)可以为800：1、850：1、900：1、950：1、1000：1、1100：1、1200：1、1300：1、1400：1、1500：1、1600：1、1700：1、1800：1、1900：1、2000：1、2100：1、2200：1、2300：1、2400：1或2500：1。
在本申请中，所述酶载体为中性或弱碱性大孔树脂，优选为中性大孔树脂。
在本申请中，所述酶载体为聚丙烯酸类大孔树脂或聚苯乙烯类大孔树脂，优选为聚丙烯酸类大孔树脂。
在本申请中，所述酶载体可以为带有疏水性骨架或亲水性骨架的聚丙烯酸类大孔树脂；所述酶载体还可以为带有疏水性骨架或亲水性骨架的聚苯乙烯类大孔树脂，优选为带有亲水性骨架的聚丙烯酸类大孔树脂。
所述酶载体可以具有以下基团中的一种或多种：羧酸基、羟基、磺酸基、磷酸基、氨基、铵基、烃基、酯基、聚氧丙烯基、长链全氟烷基、聚硅氧烷基。
在本申请中，所述酶载体可以为带有环氧基团或胺基基团的聚丙烯酸类大孔树脂或聚苯乙烯类大孔树脂；优选为带有环氧基团的聚丙烯酸类大孔树脂。例如杭州创科生物科技有限公司的MC-150EP、ECR-1604等。
环氧基大孔树脂表面的活性功能基团，可以在温和条件下与酶分子上的氨基、巯基和酚羟基等非必须基团发生多点共价键或离子吸附的方式结合反应，将酶固定在树脂载体上，形成具有良好稳定性和酶催化活性的固定化酶。
所述胺基大孔树脂在使用前用戊二醛活化可以在其表面形成醛基，与酶分子表面的胺基发生反应形成Schiff碱，生成牢固的多点共价键或离子吸附的方式合位点，从而形成稳定性良好的固定化酶。
在本申请中，所述MIase固定化酶的酶活为250～650U/g，优选为500～650U/g。
所述MIase固定化酶的酶活可以为250U/g、300U/g、350U/g、400U/g、450U/g、500U/g、550U/g、600U/g、650U/g。
本申请还提供一种MIase固定化酶的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：MIase酶液的制备：发酵培养含MIase基因的菌株，离心收集菌体细胞，用pH7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬菌体，并用高压均质机破碎细胞，然后离心得到的上清液，即为MIase酶液。
上述菌株可以是大肠杆菌、假单胞菌、农杆菌、链霉菌、嗜热放线菌、谷氨酸棒杆菌、地衣芽孢杆菌、噬热双歧杆菌、嗜糖假单胞菌、沙门氏菌、乳酸菌、酿酒酵母等种属的任何含有MIase基因的菌株。
步骤二：将MIase酶液与酶载体混合，摇床振荡使得MIase被固定到酶载体上，摇床振荡后形成混合液，静置分层，弃去所述混合液的上层液体，取1.5～2.0倍酶载体体积的去离子水缓慢搅拌漂洗位于所述混合液下层的固体,将所述固体反复漂洗多次，直至上层液体澄清为止，去掉上清液，下层的固体即为MIase固定化酶。
所述MIase酶液的酶活为80U/ml～500U/m，优选为200U/ml以上。即1ml MIase酶液中酶活为80U～500U，优选为200U以上。
所述MIase酶液的酶活可以为80U/ml、90U/ml、100U/ml、110U/ml、120U/ml、130U/ml、140U/ml、150U/ml、160U/ml、170U/ml、180U/ml、190U/ml、200U/ml、210U/ml、220U/ml、230U/ml、240U/ml、250U/ml、260U/ml、270U/ml、280U/ml、290U/ml、300U/ml、310U/ml、320U/ml、330U/ml、340U/ml、350U/ml、360U/ml、370U/ml、380U/ml、390U/ml、400U/ml、410U/ml、420U/ml、430U/ml、440U/ml、450U/ml、460U/ml、470U/ml、480U/ml、490U/ml、500U/ml。
在本申请中，所述摇床振荡的时间为10～36h，优选为12～20h。
所述摇床振荡的时间可以为10h、12h、15h、20h、25h、30h、35h以及36h中的一种。
在本申请中，所述MIase酶液与酶载体混合后，摇床振荡反应的温度为15～35℃，优选为20～25℃。
所述摇床振荡反应的温度可以为15℃、20℃、25℃、30℃以及35℃中的一种。
在本申请中，洗涤所述混合液的下层固体的次数为2～8次，优选为3～5次。
洗涤所述混合液的下层固体的次数可以为2次、3次、4次、5次、6次、7次以及8次中的一种。
本申请还提供一种D-甘露糖的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：将果糖水溶液通过装有MIase固定化酶的反应器中进行连续转化，得到含有D-甘露糖的溶液。
所述果糖溶液浓度可以为400g/L、500g/L、600g/L、700g/L、750g/L。
步骤二：所述含有D-甘露糖的溶液，经连续色谱分离、浓缩脱色提纯，获得纯度为99％以上的D-甘露糖。
所述连续色谱分离、浓缩脱色提纯等步骤是现有技术，在本申请中不做具体限定。
MIase酶液的酶活测定：取0.9ml浓度为400g/L的果糖溶液，加入0.1ml稀释10倍的MIase酶液，恒温水浴45度反应5分钟，于沸水中煮沸5分钟灭酶，离心取上清液稀释10倍用高效液相色谱检测(HPLC检测)。
MIase固定化酶的酶活测定：取5ml浓度为400g/L的果糖溶液，加入0.1～0.5g滤纸过滤后的MIase固定化酶，水浴摇床45℃恒温120rpm反应5min，吸取1ml上清溶液，沸水中煮沸5分钟灭酶，离心取上清液用HPLC检测并计算酶活。
酶活力单位U定义为：45℃恒温条件下单位时间内产生1μmol的D-甘露糖所需要的酶量。
HPLC检测条件如下：Agilent 1260高效液相色谱系统，Waters公司；AminexHPX-87N色谱柱，Waters公司；Agilent示差折光检测器；柱温：80℃，流速：1mL/min；以经0.22μm孔径的醋酸纤维膜过滤后并超声脱气的纯水作为流动相。
本申请提供的MIase固定化酶，采用大孔树脂作为载体，MIase与大孔树脂通过共价键或离子吸附的方式结合在一起形成具有良好的稳定性和酶催化活性的MIase固定化酶，当MIase与酶载体的酶活质量比在800-2500:1范围内时，制备的所述MIase固定化酶具有较高的酶活，连续转化90天，转化液中D-甘露糖的浓度稳定在200g/L以上、转化率稳定在27％以上。
实施例
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊要求，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1MIase酶液的制备
挑取含有MIase基因序列的重组大肠杆菌至含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养8-10h；然后将活化的菌液以3％的接种量接入装有3.5LLB培养基的5L发酵罐中，控制培养温度为37℃、搅拌转速为300rpm、通风比为1：0.5的条件，培养至OD值达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG，调整转速至100rpm诱导培养15-16h。然后以8000rpm离心收集菌体细胞、再用pH为7.5的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬菌体、用高压均质机破碎细胞，然后在4℃、10000rpm离心去除菌体碎片。得到的上清液，通过硫酸铵分级沉降法，对上清液中的MIase进行纯化，获得初步纯化的MIase酶液，取样测定MIase酶活。
实施例2.MIase转化底物浓度的选择
分别称量40g、50g、60g、70g、75g果糖，置于三角瓶中，加入3000U纯化后的MIase酶液，加水定容至100ml，配成底物浓度分别为400g/L、500g/L、600g/L、700g/L、750g/L的酶转化反应液，在45℃水浴中、震荡反应，定时取样检测D-甘露糖浓度，结果表明(如图1所示)，酶转化反应达到平衡后，D-甘露糖平均转化率均能达到27％以上，综合考虑，可以选取750g/L果糖底物浓度，进行MIase的酶转化反应。
实施例3.MIase固定化酶制备
选择MIase与酶载体的酶活质量比(U/g)1000：1条件，分别称取6种酶载体各5g置于三角瓶中，根据MIase液的酶活检测结果，加入5000U的MIase液，混合均匀后，密封瓶口，于25℃摇床缓慢振荡20h，弃去上层液体，采用去离子水约20ml充分洗涤下层固体，弃去洗涤液，反复洗涤3～5次，即得到MIase固定化酶，取样检测MIase固定化酶的酶活。结果如表1所示，通过比较MIase固定化酶的酶活，中性亲水性环氧基聚丙烯酸类大孔树脂，优于中性疏水性环氧基聚丙烯酸类大孔树脂，优于弱碱性疏水性胺基聚苯乙烯类大孔树脂，优于弱碱性亲水性胺基聚丙烯酸类大孔树脂。
表1.不同酶载体的MIase固定化酶酶活比较
实施例4.MIase与酶载体的酶活质量比优选
根据实施例2结果，分别称量载体CZ01、CZ02、CZ03、CZ04各5g置于三角瓶中，根据MIase液的酶活检测结果，分别按照酶活载体质量比(U/g)800：1、1000：1、1500：1、2000：1、2500：1，计算并加入相应酶活单位的MIase酶液，混合均匀后，密封瓶口，进行MIase固定化酶制备，固定化条件、洗涤方法和洗涤次数与实施例3相同，取样检测MIase固定化酶的酶活。结果如表2，从表2可知，MIase与酶载体的酶活质量比在(1000～2000):1范围内时，两者的比例越高，MIase固定化酶的酶活越高，但当两者的比例由2000：1提高到2500：1时，MIase固定化酶的酶活不再显著提高，说明MIase与酶载体的酶活质量比大于2000U/g时，载体上的活性功能基团与酶分子的结合趋于饱和，固定化酶的酶活不再显著增加，当MIase与酶载体的酶活质量比小于1000U/g时，载体上的活性功能基团与MIase酶分子的结合效率低，载体利用不充分，MIase固定化酶的酶活较低，优选的MIase与酶载体的酶活质量比(U/g)为(1000～2000):1。
表2.MIase与酶载体的酶活质量比优选
实施例5.MIase固定化酶连续转化
取酶载体CZ01制备的MIase固定化酶100ml，装入带套管的玻璃反应器中，控制套管温度45℃，选取750g/L的果糖浓度，控制40ml/h的流速，进行MIase固定化酶连续转化，当反应平衡后，定时取样检测D-甘露糖浓度及转化率，直至转化率明显下降为止，计算连续转化反应时间。
结果如图1所示，酶载体CZ01制备的MIase固定化酶，连续转化90天，果糖平均转化率达到27.15％、转化液中D-甘露糖的浓度达到200g/L以上。得到的转化液，经连续色谱分离、浓缩脱色提纯等步骤，可以获得纯度在99％以上的D-甘露糖。
尽管以上结合对本申请的实施方案进行了描述，但本申请并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本申请权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本申请保护。
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