一种猪呼吸道病三重荧光pcr检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及病菌检测
技术领域
，具体为一种猪呼吸道病三重荧光PCR检测试剂盒及其检测方法。背景技术
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，MHP)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida，Pm)和胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，App)是猪常见的3种呼吸道病原菌，分别引起猪传染性胸膜肺炎、猪肺疫等，导致猪呼吸道的急慢性炎症，引起高死亡率、低增重率以及治疗成本增加等。呼吸系统疾病是现代养猪生产中面临的最严重的问题之一，且这3种病原菌混合感染十分普遍，引起的临床症状也很难区分，不仅提高了猪群呼吸道疾病的发病率和严重程度，也增加了疾病的复杂性和诊断难度。因此，建立一种能同时快速检测这3种病原菌的诊断方法十分必要。
目前，以实时荧光定量PCR技术为基础的核酸诊断方法是国内应用最为广泛的方法之一，该方法的原理主要基于标记不同颜色Taq-Man荧光探针。现有的猪病相关的核酸检测试剂盒大多采用单重或双重荧光探针方法实现靶基因的快速诊断。本发明采用三重荧光定量PCR技术，在同一反应体系中加入3条不同颜色标记的荧光探针，可以实现在一管反应中同时检测3个靶基因的目的，其通量高，检测速度快，同时本发明可以实现反应液与酶液预混，使用时只需打开八联管盖，将提取好的核酸样本加入对应反应管即可上级检测，大量节省了临床操作流程，也极大的降低了交叉污染的概率，是目前临床所需的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪呼吸道病三重荧光PCR检测试剂盒及其检测方法，试剂盒包括引物组，引物组的核苷酸序列如下所示：
猪肺炎支原体引物：
MHPF2：5'-GATATTAAATCTGGATTTTTC-3'，
MHPR2：5'-ATTGTATTTACCAAAGTCATA-3'；
猪多杀性巴氏杆菌引物：
SAPF2：5'-TCTCTTCATTATTAGTTGCAT-3'，
SAPR1：5'-ACTATTTGATTGAACCGGTT-3'；
猪胸膜肺炎放线杆菌引物：
APPF3：5'-GGTATTGAACCTCTTGGTAA-3'，
APPR2：5'-GTCGATAATACTTTCCAAAC-3'；
试剂盒还包括探针，探针核苷酸序列如下所示：
猪肺炎支原体探针：
MHPP1：5'-ACAAGAGATCCAGTCATACCAAGGCA-3'；
猪多杀性巴氏杆菌探针：
SAPP1：5'-TTCCTACACGGTCAGCACGATTTC-3'；
猪胸膜肺炎放线杆菌探针：
APPP1：5'-ACTAAGTTAGACCAAAAGCCGCC-3'。
优选的，所述探针中还标记有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团选自FAM、HEX、VIC、TEXAS RED、ROX、CY3和CY5中的一种；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2和BHQ3中的一种；不同探针标记的荧光基团各不相同。
本发明还提供了一种猪呼吸道病三重荧光PCR检测试剂盒的检测方法，包含以下步骤：
1)提取样本DNA；
2)以提取的DNA作为模板，使用引物组MHPF2、MHPR2、SAPF2、SAPR1、APPF3、APPR2，以及使用探针MHPP1、SAPP1和APPP1进行三重荧光定量PCR扩增反应获得扩增产物；
3)对扩增曲线进行曲线分析，确定样品中是否含有猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌。
优选的，步骤2)中的荧光定量PCR扩增反应体系为：
2.5mM/μL dNTPmix为2μL，5×PCR buffer为5μL，50pmol/μL引物MHPF2为0.1μL，50pmol/μL引物MHPR2为0.1μL，50pmol/μL引物SAPF2为0.1μL，50pmol/μL引物SAPR1为0.1μL，50pmol/μL引物APPF3为0.2μL，50pmol/μL引物APPR2为0.2μL，50pmol/μL探针MHPP1为0.05μL，50pmol/μL探针SAPP1为0.08μL，50pmol/μL探针APPP1为0.15μL，酶液为1μL，ddH2O补至20μL，DNA模板/阳性对照/阴性对照为5μL。
优选的，步骤2)的三重荧光定量PCR反应程序为：42℃-50℃逆转录10-30min，1个循环；93～95℃预变性2～10min，1个循环；93～95℃变性5～30s，55～60℃退火、延伸、信号采集30～60s；循环40～45次。
优选的，PCR buffer包含250mM的tris-base，0.25％的TritonX-100，25mM的MgCl2，2.5％甘油。
优选的，酶液包含抗体修饰热启动酶DNA聚合酶和酶保存液。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：能够实现快速准确的对样本中猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的快速筛查。其操作简单、准确性高、特异性好，重复性好，有利于在临床实践中推广应用。
附图说明
图1是猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的三重荧光定量PCR试剂盒阳性标准品10倍稀释梯度系列样品的扩增曲线图；
图2是猪肺炎支原体的FAM通道定量标准曲线图；
图3是猪多杀性巴氏杆菌的HEX通道定量标准曲线图；
图4是猪胸膜肺炎放线杆菌的CY5通道定量标准曲线图；
图5是本发明方法对阳性对照样品的扩增结果图；
图6是本发明方法对阴性对照样本的扩增结果图；
图7是本发明方法对10个样本的扩增检测结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1一种猪肺炎支原体、猪巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的三重荧光定量PCR引物和探针。
本发明根据猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的核酸序列，分别设计了大量用于检测猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的引物和探针；本发明经过大量筛选实验，筛选出一组灵敏度高和特异性好的引物和探针组，序列如下：
猪肺炎支原体引物：
MHPF2：5'-GATATTAAATCTGGATTTTTC-3'，
MHPR2：5'-ATTGTATTTACCAAAGTCATA-3'；
猪多杀性巴氏杆菌引物：
SAPF2：5'-TCTCTTCATTATTAGTTGCAT-3'，
SAPR1：5'-ACTATTTGATTGAACCGGTT-3'；
猪胸膜肺炎放线杆菌引物：
APPF3：5'-GGTATTGAACCTCTTGGTAA-3'，
APPR2：5'-GTCGATAATACTTTCCAAAC-3'。
猪肺炎支原体探针：
MHPP1：5'-ACAAGAGATCCAGTCATACCAAGGCA-3'；
猪多杀性巴氏杆菌探针：
SAPP1：5'-TTCCTACACGGTCAGCACGATTTC-3'；
猪胸膜肺炎放线杆菌探针：
APPP1：5'-ACTAAGTTAGACCAAAAGCCGCC-3'；
作为优选实施例，所述PCR检测时，对不同的所述基因探针采用荧光标记物进行多色组合探针编码标记，使所述的猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌基因探针上标记的荧光信号不相同。本发明选用了FAM、HEX和CY5荧光基团标记，但是本发明要求的权利不仅限于这3种固定荧光标记。
实施例2阳性标准品制备、三重荧光定量PCR检测方法
1)标准样品的制备
为了绘制三重荧光定量PCR的标准曲线，我们分别提取猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的DNA作为PCR模板，分别用引物将相应的靶序列进行扩增，将扩增产物连入载体中，分别获得含猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的靶序列的质粒，即猪肺炎支原体阳性标准品、猪多杀性巴氏杆菌阳性标准品、猪胸膜肺炎放线杆菌阳性标准品。
猪肺炎支原体扩增靶基因序列：
GATATTAAATCTGGATTTTTCCCTGGAGACAAGAGATCCAGTCATACCAAGGCAGAAATTAGTAATCTTTTAAATAAAAAAGAAAATATTTATGACTTTGGTAAATACAAT
猪多杀性巴氏杆菌扩增靶基因序列：
TCTCTTCATTATTAGTTGCATGTAGCGGCGGTGGCGGTAGCGCTGGAAATCGTGCTGACCGTGTAGAGGAAAAAGCACAACCGGTTCAATCAAATAGT
猪胸膜肺炎放线杆菌靶基因序列：
GGTATTGAACCTCTTGGTAAGCAAGAAGATTTTGATTTTGTCGGCGGCTTTTGGTCTAACTTAGTGAATCGTGGTTTGGAAAGTATTATCGAC
2)三重荧光定量PCR检测阳性标准样品的灵敏度
将上述猪肺炎支原体阳性标准品、猪多杀性巴氏杆菌阳性标准品、猪胸膜肺炎放线杆菌阳性标准品分别进行10倍梯度稀释，作为标准品来检测定量范围，并确定其灵敏度。
在最优扩增条件下对稀释好的质粒标准品分别进行扩增。
其中，荧光定量PCR扩增反应体系为：
2.5mM/μL dNTPmix
2μL
5×PCR buffer
5μL
50pmol/μL引物MHPF2
0.1μL
50pmol/μL引物MHPR2
0.1μL
50pmol/μL引物SAPF2
0.1μL
50pmol/μL引物SAPR1
0.1μL
50pmol/μL引物APPF3
0.2μL
50pmol/μL引物APPR2
0.2μL
50pmol/μL探针MHPP1
0.05μL
50pmol/μL探针SAPP1
0.08μL
50pmol/μL探针APPP1
0.15μL
酶液
1μL
ddH<sub>2</sub>O
补至20μL
DNA模板/阳性对照/阴性对照
5μL
PCR扩增反应程序为：95℃预变性3min，1个循环；95℃变性15s，55℃退火、延伸、信号采集30s；循环45次。
3)灵敏度分析
检测结果如图1～5所示，图1为猪肺炎支原体阳性标准品、猪多杀性巴氏杆菌阳性标准品、猪胸膜肺炎放线杆菌阳性标准品10倍稀释梯度系列样品的扩增曲线图；图2为猪肺炎支原体的FAM通道阳性标准品的梯度曲线图，图3为猪多杀性巴氏杆菌的HEX通道阳性标准品的梯度曲线图，图4为猪胸膜肺炎放线杆菌的CY5通道阳性标准品的梯度曲线图。从图中可以看出，在101～105copies/ml范围内3个通道扩增曲线均呈现良好的线性关系，检测灵敏度可达500copies/mL。
上述结果说明，本发明含有猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的特异性引物和Taqman基因探针，在反应体系中含有猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌基因模板的情况下，可以实现PCR反应，并释放荧光信号。利用荧光定量PCR仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性、定量分析。
实施例3种猪肺炎支原体、猪巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的三重荧光定量PCR检测方法
1)样本核酸提取：待提样品10例，含有猪肺炎支原体样本2例，猪多杀性巴氏杆菌样本2例，猪胸膜肺炎放线杆菌样本1例，猪丹毒杆菌2例，猪链球菌2例和副猪嗜血杆菌1例。
2)以提取的核酸为模板进行四重荧光定量PCR扩增，反应体系为：
2.5mM/μL dNTPmix
2μL
5×PCR buffer
5μL
50pmol/μL引物MHPF2
0.1μL
50pmol/μL引物MHPR2
0.1μL
50pmol/μL引物SAPF2
0.1μL
50pmol/μL引物SAPR1
0.1μL
50pmol/μL引物APPF3
0.2μL
50pmol/μL引物APPR2
0.2μL
50pmol/μL探针MHPP1
0.05μL
50pmol/μL探针SAPP1
0.08μL
50pmol/μL探针APPP1
0.15μL
酶液
1μL
ddH<sub>2</sub>O
补至20μL
DNA模板/阳性对照/阴性对照
5μL
PCR扩增反应程序为：95℃预变性3min，1个循环；95℃变性15s，；55℃退火、延伸、信号采集30s；循环45次。
同时，设置阴性对照组和阳性对照组，其中阴性对照为不含有猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌基因组的生理盐水溶液。阳性对照组为同时含有猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌基因组的阳性标准品的溶液。
3)结果分析：通过荧光扩增曲线图Ct值的大小来判断结果的阴阳性，确定样品中是否含有猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌。当扩增曲线图Ct值≤38,并呈现明显指数增长时，结果表现为阳性；当扩增曲线图Ct值>38或无Ct值,结果表现为阴性；因此，为了在判断阴阳性时具有参照，检测样本时需要给猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的三重荧光定量PCR检测试剂盒设置阴性对照液和阳性对照液。
本发明实施例中，用于检测猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的三重荧光定量PCR仪包括但不限于：天隆系列，ABI系列、Bio-Rad系列(ICycler/MJOpticon 2)、Stratagene MX系列、Roche Lightcycler、Ccpheid smartcycler、CorbettRortor-Gene、杭州博日系列。
检测结果如图5～7所示，其中图5为阳性对照扩增结果图；图6为阴性对照组扩增结果，图7为样本扩增结果图，其中检出，2例猪肺炎支原体，2例猪多杀性巴氏杆菌，1例猪胸膜肺炎放线杆菌，其它样本全部检出阴性，检测结果符合预期，准确率达100％。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
