用于检测福氏志贺菌2a和Xv血清型的LAMP引物及检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术，具体地说，涉及一种用于检测福氏志贺菌2a和Xv血清型的LAMP引物及检测方法。
背景技术
据统计，在我国福氏志贺菌主要流行的血清型是2a和Xv血清型。根据1991-2000年的统计数据显示，我国主要流行的志贺菌是福氏志贺菌，占比为86％。其中优势血清型为2a，占比达到了80％。Xv血清型最早在2000年出现在河南，随即在2002～2006年取代2a血清型成为优势血清型。在2007年，甘肃省和安徽省分离的志贺菌中，Xv血清型也是优势血清型，分别占分离67％和54％。在一个基于全国哨点医院的2003年至2013年监测数据显示，在分离的2912株志贺菌中，福氏志贺菌为1610株，其中2a(n＝500,31.1％)和Xv(n＝433,26.9％)血清型是福氏志贺菌的优势血清型。数据显示，在我国传染病疫情监测网络的10个省份20个国家级监测点的监测数据显示，2015年共分离福氏志贺菌148株，其中2a血清型68株和Xv血清型19株；2016年分离福氏志贺菌103株，其中2a血清型21株；2017年分离福氏志贺菌88株，其中2a血清型59株；2018年分离福氏志贺菌66株，其中2a血清型52株。
传统的鉴定福氏志贺菌血清型主要采用商业化的诊断抗血清与菌株进行玻片凝集反应，根据免疫凝集结果进行判定。Xv血清型需要群特异性抗血清7；8和单克隆抗体MASFⅣ-1结合判断。但商业化单克隆抗体MASFⅣ-1价格昂贵，基层疾控部门不易获得，限制了其应用；而且血清凝集反应结果受到细菌培养条件和生长状态的影响，结果判定主观因素影响大。
福氏志贺菌血清型的多样性是由型特异性抗原决定簇(如I-V和IC)和群特异性抗原决定簇(如3，4；6；和7，8)决定的。根据福氏志贺菌Xv血清型O抗修饰及其产生机制，分别针对型和群特异性抗原决定簇设计特异性引物，设计多重PCR体系可以用来检测血清型。然而，多重PCR方法对于反应试剂要求较高，PCR反应至少需要2小时左右，结果判读需要进行凝胶电泳，结果判读复杂。
除了多重PCR方法外，根据福氏志贺菌血清型型特异性抗原决定簇和群特异性抗原决定簇基因设计了荧光定量PCR方法。目前的荧光定量PCR体系需要多个反应同时进行才能进行血清型的检测，并且需要荧光定量PCR仪，不利于基层推广使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测福氏志贺菌2a和Xv血清型的LAMP引物及检测方法。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种用于检测福氏志贺菌2a和Xv血清型的LAMP引物，包括用于检测福氏志贺菌wzx基因的LAMP引物、用于检测福氏志贺菌gtrII基因的LAMP引物、用于检测福氏志贺菌gtrX基因的LAMP引物以及用于检测福氏志贺菌opt基因的LAMP引物。
用于检测福氏志贺菌wzx基因的LAMP引物包括(SEQ ID NO:1-4)：
外侧正向引物F3：5’-GTGCAGAATAAAATGCAACTT-3’；
外侧反向引物B3：5’-CTGGTTTAATATTTGCAAGAGTT-3’；
内侧正向引物FIP：5’-GGCGGTTGGATGACAGTAAGTAATATGCCCCCATAATATTTGACA-3’；
内侧反向引物BIP：5’-ACAAAAATGAACCCCCGAAATTTTTTCGATTTTAGTCTCTGCCTAT-3’；
用于检测福氏志贺菌gtrII基因的LAMP引物包括(SEQ ID NO:6-9)：
外侧正向引物F3：5’-CGAAATGAGAAAAATATTCGTGA-3’；
外侧反向引物B3：5’-AGGAATCAGTAACCACTTGT-3’；
内侧正向引物FIP：5’-TGATAGCTTTGGTTAATAGCAGGTAAGTTCATGTTTATCTCTATCCCTCA-3’；
内侧反向引物BIP：5’-TGCAAGCGATATTAAATGGCTTGTTTTAAACCAGTGGGAGGATT-3’；
用于检测福氏志贺菌gtrX基因的LAMP引物包括(SEQ ID NO:12-15)：
外侧正向引物F3：5’-ATTGGCAAATGAAAGTGTTTG-3’；
外侧反向引物B3：5’-TGTCAGGAAGAGGGGTTA-3’；
内侧正向引物FIP：5’-GTTGGCAGTTGAGGAACAGAATCTTATTGTCGCATTTTCTATGG-3’；
内侧反向引物BIP：5’-ATGCGTTTGTTTGTTTCAATGCATACATTGCAATAAGGATGACTGAA-3’；
用于检测福氏志贺菌opt基因的LAMP引物包括(SEQ ID NO:17-20)：
外侧正向引物F3：5’-ATAGTCCTCCCTTCCGTAT-3’；
外侧反向引物B3：5’-AGAGGTTTAAGAGGACAGTT-3’；
内侧正向引物FIP：5’-ACTTGAGGAAAATGGTTACCATACATGATAGCATTAAACTCAATGGGTC-3’；
内侧反向引物BIP：5’-TCGATCTCTACTTTAGATGCTTGGCCCTCATCATATCAAATGACCG-3’；
优选地，用于检测福氏志贺菌wzx基因的LAMP引物还包括：环引物LF：5’-GGTGTATTTTGATCGATTTATAG-3’(SEQ ID NO:5)。
优选地，用于检测福氏志贺菌gtrII基因的LAMP引物还包括：环引物LF：5’-TGAGATGTACTCGTTCGA-3’和环引物LB：5’-CAGCCATAGATAATATATATAACTTC-3’(SEQ ID NO:11-12)。
优选地，用于检测福氏志贺菌gtrX基因的LAMP引物还包括：环引物LF：5’-CTGCCAGTTGAGGTTTTG-3’(SEQ ID NO:16)。
优选地，用于检测福氏志贺菌opt基因的LAMP引物还包括：环引物LB：5’-CAAGGCCAGAATTATCTT-3’(SEQ ID NO:21)。
第二方面，本发明提供含有所述LAMP引物的检测试剂或试剂盒。
第三方面，本发明提供所述LAMP引物或者含有该引物的检测试剂或试剂盒在福氏志贺菌2a和Xv血清型检测中的应用(所述应用含非疾病诊断和治疗目的)。
第四方面，本发明提供福氏志贺菌2a和Xv血清型检测方法(所述方法含非疾病诊断和治疗目的)，包括以下步骤：
1)提取待测样品中的DNA；
2)以步骤1)中提取的DNA为模板(可以使用水煮法制备DNA模板)，利用所述LAMP引物进行LAMP扩增反应；
3)扩增结果判定。
步骤2)所用25μL反应体系为：预混液12.5μL，引物混合物1.4μL，DNA模板1μL，无菌水10.1μL。
其中，所述引物混合物中，引物FIP和BIP各40pmol，引物F3和B3各10pmol，引物LF和/或LB各20pmol。
所述预混液可以使用WarmStart Colorimetric LAMP 2×Master预混液，购自NewEngland Biolabs公司(美国)。
优选地，反应条件为：61℃20分钟。
步骤3)的判定标准为：如果扩增结果显示gtrII和wzx基因阳性，gtrX和opt基因阴性，则判定为2a血清型；如果扩增结果显示gtrX、opt和wzx基因阳性，gtrII基因阴性，则判定为Xv血清型。
进一步地，可采用如下①～③中的任一种方法进行扩增结果判定：
①荧光染色法：扩增反应结束后，根据反应前后反应体系颜色的变化来判定目标基因的扩增情况；
②琼脂糖凝胶电泳法：若扩增产物在琼脂糖凝胶上呈现特征性梯状条带，表明待测样品中含有目标基因；
③焦磷酸镁浊度检测法：通过肉眼观察反应后的浑浊情况来判断是否发生了LAMP扩增反应，或利用浊度仪检测其在400nm处的吸光度，实现目标基因的检测。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)操作简单，快速高效。配置好反应体系后，加入水煮模板，61℃孵育20分钟后，肉眼即可观察结果。
(二)高灵敏度、高特异性。本方法四个基因对福氏志贺菌水煮模板的灵敏度分别为1pg/μL(wzx基因)，100fg/μL(gtrⅡ基因)，1pg/μL(gtrX基因)和100fg/μL(opt基因)。在19种福氏志贺菌不同血清型和志贺菌其它种中验证，证明方法特异性好。
(三)无需昂贵设备。仅需要水浴箱即可实现反应。本方法的反应条件为61℃，20分钟。反应条件温和可控。
附图说明
图1为本发明LAMP引物所在基因上的位置，基于wzx(A),gtrII(B),gtrX(C)和opt(D)基因设计引物。
图2为本发明较佳实施例中福氏志贺菌2a和Xv血清型LAMP反应示意图。A：通过肉眼观察到的2a和Xv血清型LAMP反应结果。B：使用浊度仪观察的2a和Xv血清型LAMP反应结果。C：琼脂糖凝聚电泳结果。其中，每四个管子\列\泳道一组，代表一组四个基因的LAMP反应体系。管1–4/列1–4(B1)/泳道1–4：福氏志贺菌2a阳性反应；管9–12/列1–4(B2)/泳道9–12：福氏志贺菌Xv血清型阳性反应。管5-8/列5–8(B1)/泳道5–8和管13–16/列5–8(B2)/泳道13–16，阴性对照(模板为水)。
具体实施方式
本发明根据福氏志贺菌主要血清型2a和Xv的型特异性抗原决定簇和群特异性抗原决定簇基因设计LAMP引物，其中2a血清型为(gtrII和wzx基因阳性，gtrX和opt基因阴性)，Xv血清型为(gtrX、opt和wzx基因阳性，gtrII基因阴性)。本方法不需要昂贵的设备和仪器，可以快速、准确、特异的检测福氏志贺菌2a和Xv血清型。
本发明采用如下技术方案：
本发明基于四个O抗原决定基因(gtrII、wzx、gtrX和opt基因)，分别设计LAMP引物，可以快速检测福氏志贺菌2a和Xv血清型。引物信息见表1。
表1 LAMP引物序列
LAMP扩增反应条件为：61℃，20分钟。本方法四个基因对福氏志贺菌水煮模板的灵敏度分别为1pg/μL(wzx基因)，100fg/μL(gtrⅡ基因)，1pg/μL(gtrX基因)和100fg/μL(opt基因)。四个基因在19种福氏志贺菌不同血清型的检测结果见表2。
表2四个基因在19种福氏志贺菌不同血清型的检测结果
在50株其它种志贺菌中检测均为阴性，50株志贺菌包括宋内志贺菌20株，痢疾志贺菌12株，鲍氏志贺菌18株。在其它肠道46株常见菌中检测结果均为阴性。包括：EAEC2株，EHEC 5株，EIEC 5株，EPEC 10株，ETEC 10株，UPEC 1株，非致病性大肠杆菌2株，单增李斯特菌5株，副溶血弧菌1株，沙门菌4株以及小肠结肠炎耶尔森菌1株。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1 DNA模板制备
使用水煮法制备DNA模板。取上一个将过夜培养的志贺菌平板上的单个克隆，放入含有100μL无菌水的eppendof管中，震荡混匀。100℃水煮10分钟，放置冰上5分钟后，13,000转离心10分钟，取上清作为模板。
实施例2 LAMP引物设计
使用Primer Explorer V5软件software(https://primerexplorer.jp/v5_manual/index.html)软件进行wzx,gtrII,gtrX和opt基因的引物设计。LAMP引物包括一对内引物(FIP和BIP)，一对外引物(F3和B3)。一对或一条环引物(LF和/或LB)可以加入反应体系以增加LAMP反应的特异性和加快反应速度。通过BLAST方法在NCBI数据库中检测引物的特异性。
表1为设计的LAMP引物信息，引物所在基因上的位置见图1。
实施例3 LAMP反应流程
使用WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master预混液(New England BiolabsInc.,USA)进行LAMP反应。LAMP反应体系包括引物混合物25μL(FIP和BIP引物各40pmol，F3和B3引物各10pmol，LF和/或LB引物各20pmol)，12.5μL预混液和1μL DNA模板。将混合好的LAMP反应管于61℃孵育20分钟。肉眼观察颜色变化，阳性反应LAMP预混液从红色变为黄色。阴性反应LAMP预混液保持红色不变。
实施例4 LAMP特异性评价
在福氏志贺菌19个血清型中进行特异性评价，结果证明本方法可以特异的检测福氏志贺菌2a和Xv血清型(表2)。
在50株其它种志贺菌中检测均为阴性，50株志贺菌包括宋内志贺菌20株，痢疾志贺菌12株，鲍氏志贺菌18株。在其它肠道46株常见菌中检测结果均为阴性。包括：EAEC 2株，EHEC 5株，EIEC 5株，EPEC 10株，ETEC 10株，UPEC 1株，非致病性大肠杆菌2株，单增李斯特菌5株，副溶血弧菌1株，沙门菌4株以及小肠结肠炎耶尔森菌1株。
福氏志贺菌2a和Xv血清型LAMP反应示意图见图2。
实施例5 LAMP灵敏度评价
使用福氏志贺菌2a血清型301和Xv血清型2002017进行敏感性检测。水煮法获取福氏志贺菌301和2002017的核酸，通过Nanodrop ND-1000仪器进行核酸定量，使用AE缓冲液(Qiagen公司)调整模板浓度至1ng/μL,100pg/μL,10pg/μL,1pg/μL,100fg/μL,10fg/μL和1fg/μL，共7个浓度。通过LAMP反应证明本方法四个基因对福氏志贺菌水煮模板的灵敏度分别为1pg/μL(wzx基因),100fg/μL(gtrⅡ基因),1pg/μL(gtrX基因)和100fg/μL(opt基因)。
实验结果编码，本方法的LAMP体系灵敏、特异性。不需要昂贵设别，操作简单，快速高效。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
<120> 用于检测福氏志贺菌2a和Xv血清型的LAMP引物及检测方法
<130> KHP211115206.9
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgcagaata aaatgcaact t 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctggtttaat atttgcaaga gtt 23
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcggttgga tgacagtaag taata 60
tgcccccata atatttgaca 46
<210> 4
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acaaaaatga acccccgaaa tttt 60
ttcgatttta gtctctgcct at 47
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggtgtatttt gatcgattta tag 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgaaatgaga aaaatattcg tga 23
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aggaatcagt aaccacttgt 20
<210> 8
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgatagcttt ggttaatagc aggtaa 60
gttcatgttt atctctatcc ctca 51
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgcaagcgat attaaatggc ttgt 60
tttaaaccag tgggaggatt 45
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgagatgtac tcgttcga 18
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cagccataga taatatatat aacttc 26
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
attggcaaat gaaagtgttt g 21
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgtcaggaag aggggtta 18
<210> 14
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gttggcagtt gaggaacaga at 60
cttattgtcg cattttctat gg 45
<210> 15
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atgcgtttgt ttgtttcaat gcata 60
cattgcaata aggatgactg aa 48
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctgccagttg aggttttg 18
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atagtcctcc cttccgtat 19
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
agaggtttaa gaggacagtt 20
<210> 19
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
acttgaggaa aatggttacc ataca 60
tgatagcatt aaactcaatg ggtc 50
<210> 20
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tcgatctcta ctttagatgc ttggc 60
cctcatcata tcaaatgacc g 47
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
caaggccaga attatctt 18
