具体实施方式

本发明提供了一种用于特异性检测弓形虫的crRNA，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1(5′UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCACCCUCCAGGAAAAGCAGCCA3′)所示。所述crRNA仅能与弓形虫核苷酸序列发生特异性结合，而其他种类寄生虫的核苷酸序列不能结合，具有较高的特异性。

本发明提供了一种基于等温扩增-CRISPR/Cas12a技术检测弓形虫的试剂盒，包括以下组分：所述crRNA、Cas12a蛋白和荧光报告基团标记的ssDNA。

在本发明中，在crRNA识别靶标序列(弓形虫核酸序列)后，Cas12a被激活，激活后的Cas12a除了靶向切割靶标序列外，还具有“附带”切割能力，能够切割任意单链DNA序列，体系中添加FQ-ssDNA，以FQ-ssDNA为报告试剂，来指示检测样品中是否含有靶标序列。若不含靶标序列，在490nm激光照射下溶液不会发出荧光；若存在靶标序列，则会发出荧光。

在本发明中，所述荧光报告基团标记的ssDNA包括5’端带有荧光基团，3’端带有淬灭基团。本发明对荧光报告基团的种类没有限制，采用本领域熟知的荧光报告基团即可。本发明对所述Cas12a蛋白的试剂浓度的来源均没有限制，提供本领域所熟知的蛋白浓度的蛋白来源即可。在本发明实施例中，所述荧光报告基团标记的ssDNA为6FAM-CCGGAAAAAAAAAAAACCGG-BHQ1(SEQ ID NO:2)。

本发明提供了所述crRNA或所述试剂盒在检测环境中弓形虫中的应用。本发明所述应用适用于各种环境样本，为举例说明所述检测方法，本发明实施例以环境土壤为了加以说明，但这并不能理解为对本发明保护范围的限制。所述弓形虫优选包括弓形虫卵囊和弓形虫包囊以及速殖子。

本发明提供了基于所述试剂盒检测环境中弓形虫的方法，包括以下步骤：

1)提取环境样品中总DNA；

2)以步骤1)提取的总DNA为模板进行等温扩增，得到扩增产物；

3)将crRNA和Cas12a蛋白混合，孵育，得到核酸蛋白复合物；

4)将所述核酸蛋白复合物与所述扩增产物和荧光报告基团标记的ssDNA溶液混合，孵育，得到反应产物；

5)将所述反应产物测定荧光强度，根据荧光强度的有无判断环境样本中是否含有弓形虫：当检测到荧光强度信号时，表明环境样本中含有弓形虫，反之则不含。

本发明提取环境样品中总DNA。

在本发明中，所述环境样品优选包括预处理。所述预处理的过程是去除杂质和浓缩土壤。本发明对所述预处理的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的去除杂质和浓缩土壤的方法即可。鉴于所述试剂盒的检测灵敏度的要求，所述环境样本中弓形虫的浓度优选不低于100copies/μL。

在本发明中，提取环境样品中总DNA的方法优选采用粪便DNA提取试剂盒进行。

提取后，本发明以提取的总DNA为模板进行等温扩增，得到扩增产物。

在本发明中，所述等温扩增优选包括重组酶介导扩增(RAA)、环介导等温扩增(LAMP)、依赖核酸序列扩增(NASBA)或重组酶聚合酶扩增(RPA)。本发明以重组酶介导扩增(RAA)为了说明扩增土壤中总DNA的方法，但这并不能理解对本发明保护范围的限制。所述重组酶介导扩增用引物包括上游引物和下游引物。所述上游引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO:3(5′-GAGCCACAGAAGGGACAGAAGTCG-3′)所示序列，所述下游引物包括核苷酸序列如SEQID NO:4(5′-CCTCCAGGAAAAGCAGCCAAGCCG-3′)所示序列。所述等温扩增的条件优选为39℃条件下进行。所述等温扩增的时间优选为25min。

本发明将crRNA和Cas12a蛋白混合，孵育，得到核酸蛋白复合物。

在本发明中，crRNA和Cas12a蛋白的摩尔比优选为1:0.6～1，更优选为1:1。所述孵育的温度优选为37℃，所述孵育的时间优选为15～35min，更优选20～30min。

得到核酸蛋白复合物、扩增产物后，本发明将所述核酸蛋白复合物与所述扩增产物和荧光报告基团标记的ssDNA溶液混合，孵育，得到反应产物。

在本发明中，所述核酸蛋白复合物、所述扩增产物和荧光报告基团标记的ssDNA溶液的体积比优选为1:1:1。所述荧光报告基团标记的ssDNA溶液的浓度优选为1μM。所述孵育的温度优选为37℃，所述孵育的时间优选为15～35min，更优选20～30min。

得到反应产物后，本发明将所述反应产物测定荧光强度，根据荧光强度的有无判断环境样本中是否含有弓形虫：当检测到荧光强度信号时，表明环境样本中含有弓形虫，反之则不含。

在本发明中，所述测定荧光强度优选在黑色酶标板中进行。所述测定荧光强度的波长优选为490nm。本发明对所述测定荧光强度的仪器没有特殊限制，采用本领域所熟知的荧光强度检测仪器即可。在本发明实施例中，在Thermo(VARIOSKAN LUX)多功能酶标仪上进行荧光强度检测。

下面结合实施例对本发明提供的一种基于等温扩增-CRISPR/Cas12a技术检测弓形虫的试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(1)实验原料和仪器

原料：从杭州众测公司购买的基础型RAA试剂盒、OMEGA粪便试剂盒、LbCas12a蛋白；送公司合成的引物：RAA引物(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)、ssDNA-FQ(SEQ ID NO:2)、crRNA(SEQ ID NO:1)、10×NEB缓冲液、去离子水、寄生虫DNA(弓形虫、新孢子虫、隐孢子虫、微孢子虫、芽囊原虫、艾美耳球虫、犬弓手蛔虫)。

仪器：恒温水浴锅、200μL PCR管、离心管(50mL、1.5mL)、移液器、100mL小烧杯、Thermo(VARIOSKAN LUX)多功能酶标仪、黑色96孔板。

(2)方法

1、野外环境土壤样品检测

环境样品预处理：将5g经镜检含弓形虫卵囊的土壤样品放入100mL小烧杯中，加水至100mL，搅拌混匀，用筛网过滤并将筛网转移到50mL的离心管中；静置片刻后,将离心管中液体转移到另外一个50mL离心管中，弃去离心管底部的土壤杂质；4℃条件下4000r/min离心20min，然后倒掉上清；向离心管中加适量的水，充分混匀，4℃条件下4000r/min离心20min，倒掉上清，反复操作3次，这样可以彻底清洗浓缩的土壤。接着用粪便DNA提取试剂盒对浓缩的土壤进行核酸提取。以镜检不含弓形虫卵囊的土壤作为阴性对照样品。

2、RAA反应过程：利用RAA试剂盒对弓形虫靶标DNA进行核酸扩增得到大量的RAA反应产物。利用RAA检测试剂盒(购自杭州众测生物科技有限公司)检测：总反应体系50μL：41.5μL BufferA、2μL引物(SEQ ID NO:3)、2μL引物(SEQ ID NO:4)、2.5μL BufferB和弓形虫DNA 1μL。在39℃恒温水浴锅中反应20min。

3、Cas12a酶切方法步骤：

1)反应原料的准备：试剂制备(稀释)

(1)1×NEB缓冲液的配制方法：取100μL10×NEB缓冲液加入至900μL去离子水中得到1×NEB缓冲液。

(2)1μM crRNA溶液的配制方法：将合成的crRNA在12000rpm离心30s，直接在离心后的管子中加入125μL1ⅹNEB缓冲液，得到20μM crRNA，取8μL 20μM crRNA与152μL 1ⅹNEB缓冲液混合，得到1μM crRNA。

(3)800nM Cas12a溶液的配制方法：将100μM的Cas12a蛋白在12000rpm离心30s，取10μL 100μM Cas12a与40μL 1×NEB缓冲液混合，得到20μMCas12a溶液，取8μL 20μM Cas12a与152μL 1×NEB缓冲液混合，得到1μMCas12a溶液，取128μL 1μM Cas12a与32μL 1×NEB缓冲液混合，得到800nM Cas12a溶液。

(4)1μM ssDNA-FQ溶液配制方法：取10μL 100μM ssDNA-FQ与40μL1×NEB缓冲液混合，得到20μM ssDNA-FQ溶液，取10μL 20μM ssDNA-FQ+190μL 1×NEB缓冲液混合，得到1μMssDNA-FQ溶液。

2)检测步骤：

将20μL 800nM Cas12a和20μL 1μM CrRNA混合后放入37℃水浴锅中反应20分钟。

将上述反应物与20μL方法1中所述的RAA反应产物以及20μL 1μMssDNA-FQ混合后放入37℃水浴锅中反应30分钟。

反应结束后，将反应产物加入到黑色96孔板中，然后在Thermo(VARIOSKAN LUX)多功能酶标仪上在490nm下进行荧光强度检测。

结果见图1。由图1可知，阳性土壤DNA样本能够得到一条荧光信号明显的曲线，而阴性土壤DNA样本得到一条无荧光信号的直线，说明本发明提供的方法可以准确检测土壤中弓形虫DNA是否存在。

实施例2

利用弓形虫以及其他寄生虫(新孢子虫、隐孢子虫、微孢子虫、芽囊原虫、艾美耳球虫、犬弓手蛔虫)的DNA对实施例1采用的RAA-CRISPR/Cas12a的检测方法进行特异性评估。

结果见图2。由图2结果可知，RAA-CRISPR/Cas12a的检测方法仅能对弓形虫DNA得到荧光强度信号，而对其他种类寄生虫DNA无法得到明显荧光强度信号，说明不能发生交叉反应。所述检测方法具有对弓形虫DNA特异性检测的特点。

实施例3

利用不同浓度梯度的弓形虫重组质粒对RAA-CRISPR/Cas12a的检测方法进行灵敏度检测的评估。

重组质粒的构建方法包括以下步骤：针对弓形虫特异性529bp序列设计引物PF-529(GGAGGAAGACGAAAGTTG，SEQ ID NO:5)和PR-529(ACAGTGCATCTGGATTCC，SEQ ID NO:6)。PCR扩增体系如下：12.5μL Pre mix-Tag酶，1.5μL引物PF-529，1.5μL引物PR-529，2μL弓形虫DNA,7.5μL ddH₂O。反应条件：94℃预变性5min，94℃30s，57℃30s，72℃1min，35循环，最后72℃延伸5min。

经PCR扩增后，将PCR产物与pMD19-T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆，提取质粒，成功构建阳性质粒。

将上述构建的阳性质粒进行10倍浓度稀释，得到10¹～10¹⁰拷贝/mL的梯度浓度的弓形虫重组质粒。采用实施例1记载的方法对梯度浓度的弓形虫重组质粒进行检测。

结果见图3。由图3可知，所述检测方法的检测灵敏度为100copies/μL，说明所述检测方法能够诊断极微量的弓形虫DNA。

由上述实施例结果可知，本发明的试剂盒及检测方法具有快速、灵敏、简便和准确等优点，整个检测过程可在较低温度下快速进行，其灵敏度在100copies/μL，能够诊断极微量的弓形虫DNA。该方法特异性良好，与其他寄生虫没有交叉反应。而对野外样品的检测结果可以说明利用该方法对529bp序列产生明显信号，证明RAA-CRISPR/Cas12a方法可以应用于环境中弓形虫卵囊DNA的检测。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种基于等温扩增-CRISPR/Cas12a技术检测弓形虫的试剂盒及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 43

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

uaauuucuac uaaguguaga ucacccucca ggaaaagcag cca 43

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccggaaaaaa aaaaaaccgg 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagccacaga agggacagaa gtcg 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cctccaggaa aagcagccaa gccg 24

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggaggaagac gaaagttg 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acagtgcatc tggattcc 18