具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明立足于VASN与肿瘤细胞的发生、发展进程密切相关的研究基础上，拟制备VASN单克隆抗体，为进一步研究VASN可能成为肝癌生物治疗的有效靶标打下基础，推进VASN作为肿瘤标志物筛选疾病、治疗和判断预后等研究的进程，围绕如何将基础研究的疾病标志物转化为未来临床可利用的产品，开展一系列的研究探索。

实施例1

表达载体pET30a(+)-LRR的构建

1.1PCR获取LRR

使用TaKaRa公司RNA提取试剂盒提取7702人肝细胞Total RNA，以反转录得到的cDNA为模板扩增得到目的片段，PCR反应体系：上游、下游引物各0.4μL，模板2.0μL，PCR PfuSuperMix 10μL，ddH₂O 7.2μL；95℃预变性1min，95℃变性30s、61℃退火60s、72℃延伸60s、38个循环，72℃延伸5min，PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。由图1可见，在约1032bp处有一清晰的亮带，与预期大小吻合。

其中，上游引物LRR-F(B)(SEQ ID No.3)：AAAGGATCCTGCCCATCCGGCTGCCAGTGCA，下游引物RSF-LRR-R(H)(SEQ ID No.4)：GGGAAGCTTTTAGGTGGGCACTGTGGCTGTGG。

目的片段，即VASN蛋白LRR结构域蛋白的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示：

TGCCCATCCGGCTGCCAGTGCAGCCAGCCACAGACAGTCTTCTGCACTGCCCGCCAGGGGACCACGGTGCCCCGAGACGTGCCACCCGACACGGTGGGGCTGTACGTCTTTGAGAACGGCATCACCATGCTCGACGCAGGCAGCTTTGCCGGCCTGCCGGGCCTGCAGCTCCTGGACCTGTCACAGAACCAGATCGCCAGCCTGCCCAGCGGGGTCTTCCAGCCACTCGCCAACCTCAGCAACCTGGACCTGACAGCCAACAGGCTGCATGAAATCACCAATGAGACCTTCCGTGGCCTGCGGCGCCTCGAGCGCCTCTACCTGGGCAAGAACCGCATCCGCCACATCCAGCCTGGTGCCTTCGACACGCTCGACCGCCTCCTGGAGCTCAAGCTGCAGGACAACGAGCTGCGGGCACTGCCCCCGCTGCGCCTGCCCCGCCTGCTGCTGCTGGACCTCAGCCACAACAGCCTCCTGGCCCTGGAGCCCGGCATCCTGGACACTGCCAACGTGGAGGCGCTGCGGCTGGCTGGTCTGGGGCTGCAGCAGCTGGACGAGGGGCTCTTCAGCCGCTTGCGCAACCTCCACGACCTGGATGTGTCCGACAACCAGCTGGAGCGAGTGCCACCTGTGATCCGAGGCCTCCGGGGCCTGACGCGCCTGCGGCTGGCCGGCAACACCCGCATTGCCCAGCTGCGGCCCGAGGACCTGGCCGGCCTGGCTGCCCTGCAGGAGCTGGATGTGAGCAACCTAAGCCTGCAGGCCCTGCCTGGCGACCTCTCGGGCCTCTTCCCCCGCCTGCGGCTGCTGGCAGCTGCCCGCAACCCCTTCAACTGCGTGTGCCCCCTGAGCTGGTTTGGCCCCTGGGTGCGCGAGAGCCACGTCACACTGGCCAGCCCTGAGGAGACGCGCTGCCACTTCCCGCCCAAGAACGCTGGCCGGCTGCTCCTGGAGCTTGACTACGCCGACTTTGGCTGCCCAGCCACCACCACCACAGCCACAGTGCCCACC。

1.2pET30a(+)-LRR表达载体的构建

(1)酶切：上述PCR产物经纯化试剂盒纯化后，采用BamH I、Hind III酶进行pET30a(+)与纯化PCR产物的双酶切，37℃反应4h，应用OMEGA公司的DNA纯化试剂盒进行纯化。

(2)连接：目的片段6μL，质粒2μL，T4Buffer 1μL，T4连接酶1μL，室温连接4h。

(3)转化：将连接产物转化到50μL DH5α感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激45S，冰浴2min，加入800μL的LB培养液，37℃、200rpm振荡预培养1h，最终涂布于含卡纳霉素抗性的LB培养板，37℃培养过夜。

(4)验证：挑取单菌落进行PCR验证，筛选阳性克隆送去测序公司进行测序鉴定，测序正确的重组质粒命名为pET30a(+)-LRR。

实施例2

人重组VASN蛋白LRR结构域蛋白的原核表达

2.1将pET30a(+)-LRR重组质粒转化至表达宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组工程菌株，即BL21-pET30a(+)-LRR。

2.2诱导表达：挑取重组工程菌株BL21-pET30a(+)-LRR接种于10mL LB液体培养基中(含25μg/mL卡纳霉素)，37℃，200rpm过夜。次日取1mL BL21-pET30a(+)-LRR菌液至新的10mL LB液体培养基中(含25μg/mL卡纳霉素)，37℃，200rpm条件下振荡培养约3h，加入终浓度为1mM的IPTG诱导，同时进行质粒pET30a(+)阴性对照，28℃，200rpm诱导4h。菌体于4℃，12000g离心1min，收集下层菌体。用适量PBS缓冲液重悬菌体，进行12％常规SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝方法鉴定，结果如图2显示。

实施例3

人重组VASN蛋白LRR结构域蛋白的纯化及鉴定

3.1包涵体处理：诱导表达150mL菌体，具体方法如实施例2所述，用适量预冷的PBS缓冲液重悬菌体，冰浴超声破碎(380W，60min，5s开，2s关)后于4℃，12000rpm离心10min，收集沉淀包涵体。用适量洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.9，500mM NaCl，10mM咪唑，1M尿素)清洗包涵体，4℃，12000rpm离心10min，反复操作几遍，直至清洗干净包涵体。加平衡缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.9，500mM NaCl，10mM咪唑，6M尿素)溶解包涵体，冰浴1小时后4℃，10000g离心20min，收集上清液。

3.2过层析柱：将上清蛋白溶液负载到Ni琼脂糖凝胶层析柱中，置于4℃摇床里吸附2小时。使用15倍柱体积的平衡缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.9，500mM NaCl，10mM咪唑，6M尿素)冲洗柱子，然后使用6倍柱体积含150mM咪唑洗脱液(150mM咪唑洗脱液(20mM Tris-HCl，pH 7.9，500mM NaCl，150mM咪唑，6M尿素)洗脱目的蛋白，收集洗脱液。12％SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝方法鉴定，结果如图3显示。

3.3LRR结构域蛋白鉴定：将纯化好的LRR结构域蛋白按100ng、50ng、20ng分别进行12％的SDS-PAGE电泳，通过湿转法将蛋白转移PVDF膜上，5％脱脂奶粉室温封闭2h后，一抗使用抗His标签抗体(1:2000)4℃孵育过夜，TBST洗涤三次后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(1:10000)，室温孵育1h，TBST洗涤三次后使用ECL进行显色。结果如图4显示。

其中，VASN蛋白LRR结构域蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示：

CPSGCQCSQPQTVFCTARQGTTVPRDVPPDTVGLYVFENGITMLDAGSFAGLPGLQLLDLSQNQIASLPSGVFQPLANLSNLDLTANRLHEITNETFRGLRRLERLYLGKNRIRHIQPGAFDTLDRLLELKLQDNELRALPPLRLPRLLLLDLSHNSLLALEPGILDTANVEALRLAGLGLQQLDEGLFSRLRNLHDLDVSDNQLERVPPVIRGLRGLTRLRLAGNTRIAQLRPEDLAGLAALQELDVSNLSLQALPGDLSGLFPRLRLLAAARNPFNCVCPLSWFGPWVRESHVTLASPEETRCHFPPKNAGRLLLELDYADFGCP。

实施例4

VASN单克隆抗体的制备

4.1免疫BALB/c小鼠：将购买的雌性BALB/c小鼠(4周龄)，先在实验动物中心饲养一周，使其生长稳定，适应新环境后，将纯化后1μg/μL浓度的VASN-LRR重组蛋白作为免疫原，免疫6只BALB/c雌性小鼠，另取一只注射等体积剂量的PBS溶液作为阴性对照。第一次免疫：按150μL/只的剂量，与相同体积的福氏完全佐剂混匀充分后，在腹部皮下分2～3点进行注射，间隔14天。第二次免疫：按80μL/只的剂量，与相同体积的福氏不完全佐剂混匀充分后，在腹部皮下分2～3点进行注射，间隔14天。第三、四次免疫：免疫小鼠的途径和剂量与第二次免疫一致，间隔14天。第四次免疫7天后取注射PBS溶液的阴性对照小鼠和被VASN-LRR重组蛋白免疫的阳性小鼠的尾静脉血，12000×g离心5min，保留上层血清，置于4℃冰箱。

4.2血清效价间接法ELISA测定：取浓度为2μg/mL的VASN-LRR重组蛋白，按100μL/孔包被到酶标板上，在4℃孵育过夜。次日按300μL/孔的PBST洗涤液加入，重复洗涤3次。将1％BSA封闭液按100μL/孔加入，在37℃条件下孵育30min。将阳性血清和阴性血清样本均按照3倍倍比稀释，从1:1000稀释到1:729000，同时取0.1％BSA溶液作为空白孔，按100μL/孔加入，在37℃条件下孵育60min。按100μL/孔加入1:10000的山羊抗鼠HRP-IgG二抗，在37℃条件下孵育30min。以上每个孵育时间结束后，均用PBST洗涤3次。在避光条件下，底物显色液按100μL/孔加入，在37℃条件下孵育15min后，按50μL/孔加入2M硫酸终止反应，检测OD₄₅₀值。以P/N值≥2.1对应的血清稀释度作为免疫小鼠的血清效价，选取血清效价大于1:10000的免疫小鼠进行下一步的细胞融合，其中P为阳性血清OD₄₅₀值，N为阴性血清OD₄₅₀值。

4.3SP2/0骨髓瘤细胞的培养：将从上海生科院细胞保藏中心购买的SP2/0骨髓瘤细胞进行传代和冻存，直至传到5～6代，SP2/0骨髓瘤细胞增殖稳定，状态良好，方可进行细胞融合操作。培养9个培养瓶的SP2/0骨髓瘤细胞，细胞融合前一天换液。在细胞融合前，用PBS轻轻清洗一遍已弃掉培养基上清的培养瓶，加入适量培养基，用巴士吸管轻轻吹打细胞，使细胞脱落，将细胞分多管收集在15mL离心管中，离心3min(1000rpm)，最后全部收集SP2/0骨髓瘤细胞在10mL含30％血清的RPMI1640培养基的15mL离心管中继续培养1h。

4.4脾细胞制备：取上述血清效价大于1:10000的小鼠进行细胞融合，在细胞融合前，对小鼠进行腹腔注射加强免疫，注射100～200μL，3天后，摘取小鼠眼球放血收集血液，室温静置一段时间后，12000g离心5min，保留上层血清作为阳性对照血清，-80℃保存备用。按脊椎脱臼法处死免疫小鼠后，浸泡在75％酒精中6～10min。在已紫外消毒半小时的超净台中，将小鼠固定于平板上，腹部朝上，用外科剪剪开皮肤，同时用镊子拉抻表皮，使腹膜暴露。用酒精棉球对腹膜进行擦洗消毒，然后用新的一把外科剪剪开腹膜，暴露腹腔脏器，找到位于腹部左侧的脾脏，用镊子使脾脏从其他脏器中剥离。将其放入含2mL无血清RPMI1640培养基培养皿中，剔除周围脂肪和结缔组织，将脾脏放在筛子朝上面，用10mL注射器的活塞用力挤压脾脏透过筛子，使其分散成单个脾细胞，用10mL无血清RPMI1640培养基润洗收集到15mL离心管中。

4.5细胞融合：将收集好的脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞分别用7mL无血清RPMI1640培养基洗涤，1050rpm离心4min，弃上清，重复洗三次。融合前将1/5血清RPMI1640-HAT培养基和50％PEG溶液于37℃水浴预热。向SP2/0骨髓瘤细胞加入1mL无血清RPMI1640培养基，充分混匀后转移到装脾细胞的离心管中与之混合(骨髓瘤细胞：脾细胞＝1:2～10的比例)，1050rpm离心4min，弃上清，继续加入1mL无血清RPMI1640培养液重复洗两次。轻轻敲打离心管管底使细胞松散，将离心管管底放于37℃水浴中，前30s沿管壁缓慢加入50％PEG溶液，后30s边滴加边轻轻混匀，滴加完1mL50％PEG溶液后37℃水浴1min，然后沿管壁缓慢加2mL无血清培养基，上下颠倒混匀，继续加入4mL无血清培养基，将离心管放在37℃水浴10min。1050rpm离心4min，弃上清，加入3mL预热的1/5血清RPMI1640-HAT培养基混匀，而后转移到50mL的1/5血清RPMI1640-HAT培养基中轻轻混匀，最后均分铺板到10块最外缘的孔已滴加PBS的96孔板中，置于37℃细胞培养箱中培养。24小时后用巴士吸管滴加一滴(约50μL)20％HAT培养基，8～11天后待杂交瘤细胞长至约孔底的1/5时，用20％HT培养基全换液进行培养，然后按照间接法ELISA筛选阳性孔。

4.6筛选阳性克隆株：收集各孔的细胞上清，用上述的间接法ELISA进行阳性克隆株的筛选。根据P/N大于2.1判定此孔含有阳性株，然后将阳性株转至24孔扩大培养，继续用间接法ELISA复筛一次，则可以准确判断出阳性克隆株，避免筛出假阳性株。

4.7阳性克隆株亚克隆：采用有限稀释法，选择阳性较强的阳性克隆株进行亚克隆。亚克隆时轻轻吹匀待克隆细胞，通过细胞计数仪进行细胞计数，然后将阳性克隆细胞稀释为40个/mL。按照梯度稀释法，在4个连续的孔中预先加入100μL培养基，然后取100μL阳性克隆细胞加入第一个孔，充分混匀后取100μL混合液加入第二个孔，依次梯度稀释好后，补齐每个孔的培养基为200μL，而每个孔的细胞数为2个、1个、0.5个和0.5个。约8～10天的时间，克隆细胞长到孔底1/5时进行间接法ELISA检测。之后两次的亚克隆都是选取上一次生长状态良好、阳性较强的阳性克隆株进行亚克隆，当3次亚克隆后镜下观察只有一个细胞团，且间接法ELISA检测各孔的细胞上清液100％为阳性，可确定此细胞为单克隆杂交瘤细胞。然后将单克隆杂交瘤细胞进行扩培和多次冻存，同时用于单克隆抗体的大量制备。

4.8单克隆抗体的大量制备和纯化：选取雌性BALB/C小鼠(5周龄)，腹腔注射500μL石蜡油，7天后，收集单克隆杂交瘤细胞0.5～1×10⁷个，溶于500μLPBS进行腹腔注射，用手按摩小鼠腹部，使细胞分散。然后定期观察小鼠腹部情况和活动状态，待小鼠行动迟缓、腹部胀大后用1mL注射器收集腹水，4℃离心10000×g，6min，弃上层油脂，保留腹水于-80℃冰箱，按照rProtein G试剂盒的方法将腹水纯化，然后采取间接法ELISA检测纯化后抗体的效价。

实施例5

VASN单克隆抗体可用性评价

5.1单克隆抗体亚型鉴定：取纯化后的单克隆杂交瘤细胞株的抗体按照试剂盒的实验方法进行亚类鉴定。结果表明获得的单克隆抗体同IgG2b亚型特异性结合，表明该单克隆抗体属IgG2b亚型。结果如图5显示。

5.2单克隆抗体效价鉴定：取纯化后的单克隆杂交瘤细胞株的抗体进行间接法ELISA效价测定均能达到1:2187000，表明该抗体具有较高的效价。结果如图6显示。

5.3单克隆抗体特异性鉴定：提取正常肝细胞、肝癌细胞株总蛋白进行SDS-PAGE电泳，通过湿转法将蛋白转移PVDF膜上，5％脱脂奶粉室温封闭2h后，一抗使用分泌VASN单克隆抗体的杂交瘤细胞上清液4℃孵育过夜，TBST洗涤三次后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(1:10000)，室温孵育1h，TBST洗涤三次后使用ECL进行显色。结果如图7显示。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 广西医科大学

<120> 一种重组人VASN蛋白LRR结构域蛋白及其单克隆抗体

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1011

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgcccatccg gctgccagtg cagccagcca cagacagtct tctgcactgc ccgccagggg 60

accacggtgc cccgagacgt gccacccgac acggtggggc tgtacgtctt tgagaacggc 120

atcaccatgc tcgacgcagg cagctttgcc ggcctgccgg gcctgcagct cctggacctg 180

tcacagaacc agatcgccag cctgcccagc ggggtcttcc agccactcgc caacctcagc 240

aacctggacc tgacagccaa caggctgcat gaaatcacca atgagacctt ccgtggcctg 300

cggcgcctcg agcgcctcta cctgggcaag aaccgcatcc gccacatcca gcctggtgcc 360

ttcgacacgc tcgaccgcct cctggagctc aagctgcagg acaacgagct gcgggcactg 420

cccccgctgc gcctgccccg cctgctgctg ctggacctca gccacaacag cctcctggcc 480

ctggagcccg gcatcctgga cactgccaac gtggaggcgc tgcggctggc tggtctgggg 540

ctgcagcagc tggacgaggg gctcttcagc cgcttgcgca acctccacga cctggatgtg 600

tccgacaacc agctggagcg agtgccacct gtgatccgag gcctccgggg cctgacgcgc 660

ctgcggctgg ccggcaacac ccgcattgcc cagctgcggc ccgaggacct ggccggcctg 720

gctgccctgc aggagctgga tgtgagcaac ctaagcctgc aggccctgcc tggcgacctc 780

tcgggcctct tcccccgcct gcggctgctg gcagctgccc gcaacccctt caactgcgtg 840

tgccccctga gctggtttgg cccctgggtg cgcgagagcc acgtcacact ggccagccct 900

gaggagacgc gctgccactt cccgcccaag aacgctggcc ggctgctcct ggagcttgac 960

tacgccgact ttggctgccc agccaccacc accacagcca cagtgcccac c 1011

<210> 2

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Cys Pro Ser Gly Cys Gln Cys Ser Gln Pro Gln Thr Val Phe Cys Thr

1 5 10 15

Ala Arg Gln Gly Thr Thr Val Pro Arg Asp Val Pro Pro Asp Thr Val

20 25 30

Gly Leu Tyr Val Phe Glu Asn Gly Ile Thr Met Leu Asp Ala Gly Ser

35 40 45

Phe Ala Gly Leu Pro Gly Leu Gln Leu Leu Asp Leu Ser Gln Asn Gln

50 55 60

Ile Ala Ser Leu Pro Ser Gly Val Phe Gln Pro Leu Ala Asn Leu Ser

65 70 75 80

Asn Leu Asp Leu Thr Ala Asn Arg Leu His Glu Ile Thr Asn Glu Thr

85 90 95

Phe Arg Gly Leu Arg Arg Leu Glu Arg Leu Tyr Leu Gly Lys Asn Arg

100 105 110

Ile Arg His Ile Gln Pro Gly Ala Phe Asp Thr Leu Asp Arg Leu Leu

115 120 125

Glu Leu Lys Leu Gln Asp Asn Glu Leu Arg Ala Leu Pro Pro Leu Arg

130 135 140

Leu Pro Arg Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ser His Asn Ser Leu Leu Ala

145 150 155 160

Leu Glu Pro Gly Ile Leu Asp Thr Ala Asn Val Glu Ala Leu Arg Leu

165 170 175

Ala Gly Leu Gly Leu Gln Gln Leu Asp Glu Gly Leu Phe Ser Arg Leu

180 185 190

Arg Asn Leu His Asp Leu Asp Val Ser Asp Asn Gln Leu Glu Arg Val

195 200 205

Pro Pro Val Ile Arg Gly Leu Arg Gly Leu Thr Arg Leu Arg Leu Ala

210 215 220

Gly Asn Thr Arg Ile Ala Gln Leu Arg Pro Glu Asp Leu Ala Gly Leu

225 230 235 240

Ala Ala Leu Gln Glu Leu Asp Val Ser Asn Leu Ser Leu Gln Ala Leu

245 250 255

Pro Gly Asp Leu Ser Gly Leu Phe Pro Arg Leu Arg Leu Leu Ala Ala

260 265 270

Ala Arg Asn Pro Phe Asn Cys Val Cys Pro Leu Ser Trp Phe Gly Pro

275 280 285

Trp Val Arg Glu Ser His Val Thr Leu Ala Ser Pro Glu Glu Thr Arg

290 295 300

Cys His Phe Pro Pro Lys Asn Ala Gly Arg Leu Leu Leu Glu Leu Asp

305 310 315 320

Tyr Ala Asp Phe Gly Cys Pro

325

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaaggatcct gcccatccgg ctgccagtgc a 31

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gggaagcttt taggtgggca ctgtggctgt gg 32