腐食酪螨过敏原Tyr p 12编码基因、重组蛋白及其应用
技术领域
本发明属于生物
技术领域
，尤其涉及一种腐食酪螨过敏原Tyrp 12编码基因、重组蛋白及其应用。背景技术
尘螨是引起过敏性疾病最重要的过敏原来源生物之一，其广泛分布在室内床垫、沙发、枕头、地毯、凉席等处，常见种类有粉尘螨、屋尘螨、热带无爪螨、腐食酪螨等。作为一种生物体，尘螨提取物中含有多种过敏原成分，按照发现顺序先后被命名为第1组分、第2组分……，现已发现近40组分。按照国际过敏原命名规则，过敏原的命名是以其来源物质，属名的头三个字母(如Dermatophagoides，头三个字母为Der)，空格，种名第一个字母(如pteronyssinus的首字母)，空格，最后用阿拉伯数字表示该过敏原发现的顺序或其临床意义，如屋尘螨过敏原第1组分就命名为Derp 1。
单种尘螨的提取物为多种过敏原组分的混合物，但患者病因可能只与其中的某种或某些组分有关。而且，尘螨提取物质量欠佳，如主要组分含量不足、含有的组分种类及含量不稳定、含有非过敏原性物质、某种或某些组分的免疫原性偏低。因此，尘螨提取物用于临床诊疗引发了许多严重的、甚至危及生命的副作用，以致需要针对其副作用再进行繁琐的后续治疗。因此，需要检验试剂明确引起过敏性疾病的单组分过敏原。
根据WHO/IUIS过敏原命名委员会(http://www.allergen.org/)，已经报道的粉尘螨过敏原组分有Der f 1-8、Der f 10-11、Der f 13-18、Der f20-39，屋尘螨过敏原组分有Derp 1-11、Derp 13-15、Derp 18、Derp 20-21、Derp 23-26、Derp 28-33、Derp 36、Derp37-38，腐食酪螨过敏原组分有Tyrp 1-3、7-8、10、13、20、28、34-36，热带无爪螨过敏原组分有Blo t 1-8、Blo t 10-13、Blo t 19、Blo t 21。随着高通量测序技术的迅猛发展，多个螨种的线粒体核基因组和全基因组测序完成，为发现新过敏原组分提供了手段。尽管粉尘螨和屋尘螨全基因学数据已经公示，但是没有发现第12组分编码基因。目前，国际过敏原命名委员会官网(www.allergen.org)中只公布了热带无爪螨过敏原第12组分编码基因。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种腐食酪螨过敏原Tyrp 12编码基因。
本发明的再一目的在于提供一种编码腐食酪螨过敏原Tyrp 12重组蛋白的人工合成基因。
本发明的再一目的在于提供上述人工合成基因在制备腐食酪螨过敏原Tyr p 12重组蛋白中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种腐食酪螨过敏原Tyrp 12重组蛋白。
本发明是这样实现的，一种腐食酪螨过敏原Tyrp 12编码基因，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
本发明进一步公开了一种编码腐食酪螨过敏原Tyrp 12重组蛋白的人工合成基因，该基因包含权利要求1所述的腐食酪螨过敏原Tyrp 12编码基因。
优选地，该人工合成基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。
本发明进一步公开了上述人工合成基因在制备腐食酪螨过敏原Tyrp 12重组蛋白中的应用。
优选地，将所述人工合成基因的核苷酸序列克隆至原核表达载体。
本发明进一步公开了一种腐食酪螨过敏原Tyrp 12重组蛋白，其氨基酸序列如SEQID No：3所示。
本发明进一步公开了上述重组蛋白在制备精准医学检验过敏性疾病患者检验试剂中的应用。
本发明克服现有技术的不足，提供一种腐食酪螨过敏原Tyrp 12编码基因、重组蛋白及其应用。腐食酪螨(Tyrophagusputrescentiae)是一种仓储螨类，也常见于室内尘埃中，是一种重要的吸入性过敏原，会引起过敏性哮喘和/或鼻炎。美国国家生物信息中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)已经公布了腐食酪螨全基因组测序(BioProjects:PRJNA598686，Whole Genome Shotgun:INSDC:JAAALH000000000.1)，本发明在对该基因组进行功能基因注释时发现一段基因与热带无爪螨第12组分Blo t 12具有同源性，根据此序列，本发明用RT-PCR从腐食酪螨Total RNA中扩增出这段编码，测序验证确定为Tyr p 12的编码基因，将该基因依次经过密码子优化、人工合成基因片段、克隆至pET28a(+)载体中、转化大肠杆菌、IPTG诱导表达、镍亲和柱层析纯化后，最终获得重组蛋白，将该重组蛋白应用于临床检测腐食酪螨阳性血清，其阳性率为27.27％(3/11)。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明首次获得Tyrp12的编码基因，并以此制备获得的重组蛋白用于制备精准医学检验过敏性疾病患者检验试剂中的应用。
附图说明
图1是腐食酪螨Total RNA电泳图；其中，泳道M为DL 2,000DNA Marker，泳道1为腐食酪螨Total RNA；
图2是Tyr p 12PCR产物琼脂糖凝胶；其中，泳道M为DL 2,000DNA Marker，泳道1为Tyrp 12基因PCR产物(+)，泳道2为Tyrp 12基因PCR产物(-)；
图3是pET28a质粒酶切产物琼脂糖凝胶电泳结果，其中，泳道M为λ-HindⅢdigest，泳道1为pET28a质粒，泳道2为pET28a-Nde I/EcoR I；
图4是SDS-PAGE鉴定pET-28a(+)-Tyrp 12全长基因表达结果；其中，泳道M为Protein MW marker(Broad，泳道1为pET28a载体全蛋白，泳道2为pET28a载体上清，泳道3为pET28a载体沉淀，泳道4为Tyrp 12全蛋白，泳道5为Tyrp 12上清，泳道6为Tyrp 12沉淀；
图5是TyrP12 SDS-PAGE结果；其中，泳道M为Protein MW marker(Broad)，泳道1为pET28a载体全蛋白，泳道2为pET28a载体上清，泳道3为pET28a载体沉淀，泳道4为Tyrp 12全蛋白，泳道5为Tyrp 12上清，泳道6为Tyrp 12沉淀；
图6是Tyrp 12Westernblotting图；其中，泳道M1为Precision Plus ProteinStandards，泳道1为pET28a载体全蛋白，泳道2为pET28a载体上清，泳道3为pET28a载体沉淀，泳道4为Tyrp 12全蛋白，泳道5为Tyrp 12上清，泳道6为Tyrp 12沉淀，泳道M2为Perfectprotein marker；
图7是Tyr P 12上清过Ni柱电泳图；其中，M从小到大：10、15、20、35、45、60、75、100、140、180KDa；
图8是Tyrp 12蛋白纯化SDS-PAGE；其中，电泳软件分析(灰度分析)纯度＞90％；
图9是IgE-Western Blotting检测重组过敏原rTyrp 12的阳性率；其中，泳道M为预染蛋白分子量标记物，泳道1～11为Tyrp粗提浸液过敏阳性患者血清，其中，泳道1～3为IgE-Western Blotting检测rTyrp 12阳性患者血清，泳道12～15为健康对照。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一、基因克隆、表达、质粒构建、测序验证
1、Total RNA提取
使用RNAiso Plus(Code No.9108)对腐食酪螨材料进行Total RNA提取，取1μl进行1％琼脂糖凝胶电泳，见图1，表明提取的Total RNA可以满足后续实验要求。
2、目的基因获取
2.1、引物设计和合成
根据已获得的Tyr p 12片段序列设计引物。
上游引物F1：5'-CGCGCGGCAGCCATATGAATCTACCAGTTTTTCTCTTGTCCGTC-3'，
下游引物R1：5'-GACGGAGCTCGAATTCTTATTCGGTAATCTTGGCATTAAATTTGAG-3'。
2.2、反转录
使用TaKaRa PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Code No.RR014A)合成cDNA，同时设立负对照。反应体系Total RNA1(μg、Random 6mers(20μM)1μL、Oligo dT Primer(2.5μM)1μL、dNTP Mixture(10mM each)1μL、RNase Free dH2O up to 10μL，反应条件65℃5min、冰上静置2min。然后加入5x PrimeScript RT Buffer 4μL、RNase Inhibitor(40U/μL)0.5μL、PrimeScript RTase(for 2Step)0.5μL、RNase Free dH2O5μL，置PCR仪，反应条件：30℃10min、45℃30min、70℃15min。
2.3、PCR扩增
2.3.1、使用TaKaRa Tks Gflex DNAPolymerase(Code No.R060A)进行PCR扩增。PCR反应体系:上述的反转录反应液1μL、2×Gflex PCR Buffer(Mg2+，dNTPplus)25μL、TksGflex DNAPolymerase(1.25units/μL)1μL、INF Primer(20μM)1μL、INR Primer(20μM)1μL、dH2O 21μL，共50μL，反应条件：94℃1min1个循环，然后在98℃10sec、60℃15sec、68℃30sec条件下30个循环。
2.3.2、PCR产物各取5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳检测结果表明：扩增出与预计长度大小一致的目的片段，结果见图2。
2.4、PCR产物纯化
使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(CodeNo.9762)切胶回收纯化上述第1泳道长度约0.5kbp的目的扩增产物条带。
2.5、测序分析
使用引物F、R对PCR纯化产物进行测序：
上游引物F2：5'-ATGAATCTACCAGTTTTTCTCTTGTCCGTC-3'，
下游引物R2：5'-TTATTCGGTAATCTTGGCATTAAATTTGAG-3'；
测序结果如SEQ ID No：1所示，该测序结果与Tyrp 12基因CDS区重叠区域序列一致，继续进行后续克隆实验。
3、载体DNA制备
3.1、载体酶切
使用Nde I/EcoR I对pET28a质粒进行双酶切反应，反应体系pET28a质粒1μg、10×QuickCut Buffer 5μL、Nde I(10U/μL)1μL、EcoRI(10U/μL)1μL，反应条件37℃、2h。酶切产物取10μL进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。
3.2载体纯化
使用TaKaRa MiniBESTAgarose Gel DNAExtractionKitVer.4.0(Code No.9762)切胶回收纯化上述第2泳道长度约5.3kbp的酶切产物，命名为Vector DNA。
4、In-Fusion、转化、阳性克隆筛选及质粒测序
4.1、使用HD Cloning Kit(Clontech Code No.639650)，将PCR产物与Vector DNA进行In-Fusion反应，反应体系:Vector DNA(约50ng/μL)2μL、PCR产物(约50ng/μL)1μL、5x In-Fusion HD Enzyme Premix 2μL、dH2O Up to 10μL，反应条件：50℃15min。
4.2、取上述In-Fusion反应液2μL热转化至E.coli Competent Cells JM109(CodeNo.9052)中，涂布平板，37℃过夜培养。挑选阳性菌落植菌，提取质粒，使用引物X“5'-GCTAGT TAT TGC TCA GCG G-3'”对上述质粒进行测序，测序结果均与PCR产物测序结果比对一致。
5、Tyrp 12蛋白表达
5.1、种培养
取Tyrp 12甘油菌保20μL加入2mLLB/Kan(50ng/μL)+Cm(34ng/μL)液体培养基中，37℃O/N培养。
5.2、主培养及诱导
在Glass tube中添加5mL LB/Kan(50ng/μL)培养基，分别添加种培养菌液100μL。37℃培养至OD600nm值约为0.6，添加150mM IPTG 33μL(final 1mM IPTG)进行诱导，37℃培养4小时。诱导前吸光度0.60，集菌前吸光度0.2。
5.3、蛋白质抽提
集菌后2.0OD相当的菌体加入320μLPBS悬浊后进行超声波破碎，对菌体破碎液进行离心分离(12，000x rpm、5min)。
5.4、抽提液电泳
取各抽提液(全蛋白、上清、沉淀)8μL(0.05OD相当)，加入2μL 5×SDS LoadingBuffer，99℃加热10分钟，进行SDS-PAGE电泳。电泳条件；(c.c.)25mA/枚、约70分，使用gel；10％、12.5％、15％polyacrylamide gel电泳结束后，CBB-R250染色，使用脱色液脱色，SDS-PAGE/CBB染色结果如图4所示。
5.5、实验结果
根据SDS-PAGE结果，没有表达，后续将进行密码子优化、人工合成基因，再次表达。
二、人工合成基因表达
1、DNA片段的制作
根据DNA序列，合成单链小片段DNA，再通过PCR方法，把单链小片段DNA拼接成一条完整的双链DNA片段。将Tyrp 12全长基因去信号肽、密码子优化后，人工合成基因，408bp，序列如SEQ ID No：2所示，该基因编码的蛋白序列如SEQ ID No：3所示。
2、连接反应
2.1、在Microtube管中配制反应液
Insert DNA 1μL(约80ng)、Vector DNA(pET28a(+)-Nde I/EcoR I)1μL(约50ng)、dH2O6μL、5×In-Fusion HD Enzyme Premix*2μL。
注:*HD Cloning Kit的组份(Clontech Code No.639650)。
2.2、50℃保温15分钟
取2.5μL In-Fusion产物转化至E.coli Competent Cell JM109(TaKaRa CodeNo.9052)。
3、阳性克隆检测及质粒DNA的提取
对平板上的菌落用引物“5'-GCT AGT TAT TGC TCA GCG G-3'”进行PCR，检测所含质粒中插入片段的长度大小，对菌落进行质粒DNA提取。
4、DNA序列测定
5、实验结果：质粒中的插入片段完全正确。
6、WesternBlotting
6.1、转化
质粒取1μL转入Competent cell BL21(DE3)中，使用Kan/抗生素Kan(50ng/μL)平板，50μL转化液涂布，37℃O/N培养。空载体pET28a+进行相同操作。
6.2、培养及诱导
挑取含pET-28a(+)-Tyrp 12活性部分单菌落至2mL LB/Kan(50ng/μL)培养基中，37℃O/N种培养。空载体进行相同操作。在Glass tube中添加5mL LB/Kan(50ng/μL)培养基，分别添加种培养菌液100μL。37℃培养OD600nm值约为0.6，添加150mM IPTG 33μL(final1mM IPTG)进行诱导，37℃培养4小时。
6.3、蛋白质抽提
集菌后2.0OD相当的菌体加入320μLPBS悬浊后进行超声波破碎，对菌体破碎液进行离心分离(12，000x rpm、5min)。
6.4、抽提液电泳
取各抽提液(全蛋白、上清、沉淀)8μL(0.05OD相当)，加入2μL 5×SDS LoadingBuffer，99℃加热10分钟，进行SDS-PAGE电泳。电泳条件；(c.c.)25mA/枚、约70分使用gel；15％polyacrylamide gel电泳结束后CBB-R250染色，使用脱色液脱色。SDS-PAGE/CBB染色结果如图5所示。
6.5、Western Blotting
将PVDF膜、滤纸分别剪切成与凝胶相同大小，使用转膜缓冲液处理后，按滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸的顺序依次放在转膜仪电极板之间，开始转膜，设置转膜仪参数：电流50mA转印时间80min。将PVDF膜置于含1.5％BSA的10mL Blocking buffer中，4℃平放过夜封闭。使用稀释后的Penta-His Antibody溶液9mL，进行一次抗体反应1小时。TBST缓冲液(20mL)洗涤2次；洗涤TBS缓冲液冲洗3次。使用稀释后的HRP-Rabbit Anti-Mouse IgG抗体溶液9mL，进行二次抗体反应1小时。TBST缓冲液(20mL)洗涤2次；洗涤TBS缓冲液冲洗3次。2mL TrueBlue Peroxidase Substrate显色1min。显色后PVDF膜如图6所示。
6.6、实验结果
通过WesternBlotting判断，目的蛋白有表达，但基本为不可溶性蛋白。
三、Tyrp12重组蛋白纯化
1、缓冲液配制
平衡缓冲液：20mM Tris，300mM NaCl，pH8.0，预洗缓冲液：20mM Tris，300mMNaCl，pH8.0，洗脱缓冲液1：20mM Tris，300mM NaCl，20mM Imi，pH8.0，洗脱缓冲液2：20mMTris，300mM NaCl，80mM Imi，pH8.0洗脱缓冲液3：20mM Tris，300mM NaCl，500mM Imi，pH8.0，透析缓冲液：20mM Tris，pH8.0。
2、菌体破碎
破菌缓冲液：20mM Tris，300mM NaCl，pH8.0。破菌条件：400w，超4s停6s，4℃冰浴，破菌10min。破碎后，将破碎菌液离心，条件：12000rpm，4℃，15min，上清待纯化。
3、柱层析纯化
使用GE Ni Sepharose 6Fast Flow(Code No.10257810)层析填料，体积3.0mL。使用10倍柱体积的去离子水30mL和10倍柱体积的平衡缓冲液30m平衡填料，流速0.5mL/min。平衡后上样，流速0.5mL/min。蛋白吸附后，使用10倍柱体积的预洗缓冲液30mL清洗填料，流速0.5mL/min。按照洗脱缓冲液1、2、3的顺序，依次分步洗脱Ni填料，收集各部分洗脱液，洗脱过程中，用考马斯亮蓝法跟踪蛋白洗脱情况，待颜色变至阴性对照停止收集。
4、SDS-PAGE电泳
取样品20μL，加入5μL 5×SDS Loading Buffer，100℃加热10min，进行SDS-PAGE。
电泳条件：电压120V，时间80min。使用15％分离胶。电泳结束后，R250染液染色，再使用脱色液脱色，电泳图见图7。
5、透析
使用20mM Tris，pH8.0进行Buffer透析，反复进行3次。透析Buffe r:20mM Tris，pH8.0，置换率：1:1000，透析膜：membra-cel md443.5×500clrμLotNo.300811349)，电泳胶：15％SDS PAGE/考马斯亮蓝染色液染色，取透析后样品进行SDS-PAGE电泳，结果如图8所示。
6、实验结果:使用Nanodrop-1000进行定量分析：体积3.0mL蛋白浓度为0.88mg/mL，蛋白总量为2.64mg，蛋白纯度＞90％。
四、IgE-Western Blotting检测rTyr p 12阳性率
1、血清
Ig-westernblotting血清来源于本发明前期的流行病学调查(Unpublished)，共11份腐食酪螨阳性血清和4份阴性血清，其基础资料见表1。
表1血清流行病学调查表
表1中，编号1～11为腐食酪螨螨粗提浸液阳性血清，编号12～15为腐食酪螨粗提浸液阴性血清。
2、IgE-WB检测重组蛋白rTyrp 12阳性率
取重组蛋白8μL(0.05OD相当)，加入2μL 5×SDS Loading Buffer，95℃加热10min，进行SDS-PAGE电泳。电泳条件：25mA/枚，70min。使用12.5％polyacrylamide gel，电泳结束后，CBB-250染色，使用脱色液脱色。将PVDF膜、滤纸分别剪切成与凝胶相同大小，使用转膜缓冲液处理后，按滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸的顺序依次放在转膜仪电极板之间，2张膜同时开始转膜，设置转膜仪参数如下：电流54mA、转印时间80min。将PVDF膜置于含1.5％BSA的12mL Blocking buffer中，37℃平放1h封闭。使用1：10稀释后的血清溶液10mL，进行一次抗体反应1h。TBST缓冲液(25mL)洗涤1次；洗涤TBS缓冲液冲洗2次。使用1:2500稀释后的GoatAnti-human IgE(HRP)抗体溶液9mL进行二次抗体反应1h。TBST缓冲液(25mL)洗涤1次；洗涤TBS缓冲液冲洗2次。1mL TrueBlue Peroxidase substrate显色1min。根据IgE-WB结果，Tyrp 12阳性率为27.27％，见图9。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 无锡市儿童医院
<120> 腐食酪螨过敏原Tyr p 12编码基因、重组蛋白及其应用
<141> 2021-05-08
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 642
<212> DNA
<213> Tyrophagus putrescentiae
<400> 1
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atgaatctac cagtttttct cttgtccgtc tttttgctgg tccttctgac tggcccaact 120
gtgaatggta aactggtcac tctttgtgat tctccacatg ggacctttca gtcagttagc 180
atcttaaact gcaaaaacac ggatcgattt tgcgtgttta agaagaacac caatgtttcc 240
attgaagtaa actttgtgcc caattacgca gcaacgtctg tccaaacgaa aatcattggc 300
gatgtagccg gcgtgccgat tccctttccc gtcaacccaa aggaggcatg cggcaactac 360
ggtctcaact gtccactgac caccggtgac aagacccaat ttaaaatgga acttcccatc 420
aaggctgcct atcctgccat tgccgttggc gtgactatca aacttgtcga tgagagtagt 480
gctaacctcg tctgtctcaa atttaatgcc aagattaccg aataagaatt cgagctccgt 540
cgacaagctt gcggccgcac tcgagcacca ccaccaccac cactgagatc cggctgctaa 600
caaagcccga aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct ga 642
<210> 2
<211> 408
<212> DNA
<213> Tyrophagus putrescentiae
<400> 2
catatgaaac tggttaccct gtgcgactct ccgcacggta ccttccagtc tgtttctatc 60
ctgaactgca aaaacaccga ccgtttctgc gttttcaaaa aaaacaccaa cgtttctatc 120
gaagttaact tcgttccgaa ctacgctgct acctctgttc agaccaaaat catcggtgac 180
gttgctggtg ttccgatccc gttcccggtt aacccgaaag aagcttgcgg taactacggt 240
ctgaactgcc cgctgaccac cggtgacaaa acccagttca aaatggaact gccgatcaaa 300
gctgcttacc cggctatcgc tgttggtgtt accatcaaac tggttgacga atcttctgct 360
aacctggttt gcctgaaatt caacgctaaa atcaccgaat aagaattc 408
<210> 3
<211> 152
<212> PRT
<213> Tyrophagus putrescentiae
<400> 3
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Lys Leu Val Thr Leu Cys Asp Ser Pro His Gly
20 25 30
Thr Phe Gln Ser Val Ser Ile Leu Asn Cys Lys Asn Thr Asp Arg Phe
35 40 45
Cys Val Phe Lys Lys Asn Thr Asn Val Ser Ile Glu Val Asn Phe Val
50 55 60
Pro Asn Tyr Ala Ala Thr Ser Val Gln Thr Lys Ile Ile Gly Asp Val
65 70 75 80
Ala Gly Val Pro Ile Pro Phe Pro Val Asn Pro Lys Glu Ala Cys Gly
85 90 95
Asn Tyr Gly Leu Asn Cys Pro Leu Thr Thr Gly Asp Lys Thr Gln Phe
100 105 110
Lys Met Glu Leu Pro Ile Lys Ala Ala Tyr Pro Ala Ile Ala Val Gly
115 120 125
Val Thr Ile Lys Leu Val Asp Glu Ser Ser Ala Asn Leu Val Cys Leu
130 135 140
Lys Phe Asn Ala Lys Ile Thr Glu
145 150
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
cgcgcggcag ccatatgaat ctaccagttt ttctcttgtc cgtc 44
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gacggagctc gaattcttat tcggtaatct tggcattaaa tttgag 46
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
atgaatctac cagtttttct cttgtccgtc 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
ttattcggta atcttggcat taaatttgag 30
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gctagttatt gctcagcgg 19
