稻纵卷叶螟钙粘蛋白Cry毒素结合区编码基因及其编码蛋白与应用
技术领域
本发明属于生物基因工程领域，特别是稻纵卷叶螟钙粘蛋白cadherin毒素结合区编码基因与应用。
背景技术
稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis是中国和其他亚洲国家在水稻上的主要害虫(Khan et al.，1988；Riley et al.，1995；Yang et al.，2018a)。稻纵卷叶螟幼虫通过折叠水稻叶片使其叶片脱叶来取食，造成水稻产量严重损失(Padmavathi et al.，2013；Senthil-Nathan，2019)。目前，对稻纵卷叶螟的防治主要使用化学杀虫剂，由于环境影响、害虫抗药性等问题，不建议对害虫使用化学农药(Li et al.，2016；Xiao and Wu，2019)。生物农药由微生物或天然产物制备而来，且对环境无害，是化学农药有效的替代品(Chandleret al.，2011)。来源于苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)的Bt毒素蛋白是目前最常用的生物农药，在孢子形成阶段会产生杀虫晶体蛋白(Cry毒素)，这些晶体蛋白对特定昆虫具有高活性，对脊椎动物或环境无害(Bravo et al.，2011； Mendelsohn et al.，2003；Sanahuja et al.，2011)。因此，Cry毒素应用比较广泛的方式包括转基因作物和喷洒制剂以防控害虫。
Cry毒素的作用方式已被广泛研究，但机制仍存在争论(Soberon et al.， 2009；Vachon et al.，2012)。现有2种作用模式解释Cry毒素的作用机制，即“穿孔模型”(Bravoet al.，2004)和“信号传导模型”(Zhang et al.，2006)。两种模型都认为，目标昆虫摄取Bt毒素，其后在碱性中肠环境中将其溶解，再由昆虫的消化蛋白酶激活。然后，活化的毒素(active toxins)会结合位于中肠细胞刷状缘膜囊泡((brush border membranevesieles，BBMV)上不同蛋白受体 (Knowles and Ellar，1987；Jurat-Fuentes andCrickmore，2017)。在穿孔模型中，活化的毒素可通过与特定钙粘蛋白(cadherin)结合而发生寡聚。接下来，毒素寡聚物与另一种受体蛋白如氨肽酶N(aminopeptidase N，APN)或碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)结合，并插入中肠上皮细胞膜中形成空洞导致昆虫死亡(Pardo-Lopez et al.，2013；Adang et al.，2014)。最近，ABC转运蛋白已成为Cry毒素的关键功能受体，并被认为促进Cry毒素寡聚化和寡聚体穿孔(Heckel，2012；Ocelotl etal.，2017)。相比之下，信号传导模型中Cry毒素与中肠cadherin结合后，Mg2+依赖的cAMP信号通路被激活，从而导致细胞凋亡，并造成昆虫死亡(Zhang et al.，2005；Zhang et al.，2006)。这两种模型都表明，Cry毒素与cadherin的结合会触发复杂的多步骤反应过程。此外，在几种鳞翅目害虫中证实了cadherin突变与其对Cry毒素产生抗性相关(Fabrick etal.，2007；Gomez et al.，2001)。在烟芽夜蛾YHD2抗性品系中，钙粘蛋白基因表达的缺失蛋白已经与Cry1Ac毒素不存在结合区(Gahan，2001)。因此，钙粘蛋白在研究Bt杀虫活性和抗性机制的分子基础上是至关重要的受体(Gahan et al.，2001；Fabrick and Tabashnik，2007；Zhang et al.，2012)。
通过生物信息学对cadherin的结构进行预测，发现其二级结构包括氨基末端信号肽(amino-terminal signal peptide，SIG)，细胞外结构区(包含9-14 个钙粘蛋白重复序列，cadherin repeats，CR)，近膜端细胞外结构区 (membrane-proximal extracellulardomain，MPED)，跨膜结构区 (transmembrane domain，TMD)和细胞质结构区(cytoplasmicdomain，CYT)。在鳞翅目昆虫的Cadherin中，Cry毒素结合区(toxin-binding region，TBR)主要位于靠近细胞膜的6个CR结构区(例如CR6-11/CR7-12)和MPED(Fabrick and Wu，2015)。发明人前期确定了小菜蛾cadherin片段(T1202-I1447， PxCad-TBR)及其来自棉铃虫的同源片段(T1217-L1461，HaCad-TBR)与Cry1Ac 毒素结合(Gao et al.，2019)。异源表达的含有TBR的钙粘蛋白片段以高亲和力结合Cry毒素，促进寡聚化并增强某些鳞翅目昆虫的Cry毒性(Chen et al.， 2007；Fabrick et al.，2009；Pacheco et al.，2009b；Park etal.，2009； Park et al.，2019)。
钙粘蛋白是理解Cry毒素杀虫作用和抗性机制中一个重要的受体，对研究 Cry毒素与昆虫cadherin作用机制及设计特异性的杀虫蛋白具有重要意义。目前关于稻纵卷叶螟的cadherin基因，特别是毒素结合区的相关基因尚未见报道。
发明内容
针对上述问题，本申请首次从稻纵卷叶螟幼虫克隆得到一个cadherin基因 eDNA的全长序列，进而确定了它的核苷酸序列和氨基酸序列，并在此基础上定位了稻纵卷叶螟cadherin的Cry1Ac毒素结合区CmCad-CR6-MPED(G759-L1575) 编码基因，并进一步开发了其应用。
具体来说，本申请是通过如下技术方案实现的：
首先，本申请首次确定了稻纵卷叶螟钙粘蛋白Cry毒素结合区基因，其核苷酸序列如：SEQ ID NO.14所示；该基因位于稻纵卷叶螟钙粘蛋白基因全长序列 (如SEQ ID NO.10所示)的第2398-4848位；
其次，本申请定位了稻纵卷叶螟钙粘蛋白Cry毒素结合区基因的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。该段蛋白位于稻纵卷叶螟钙粘蛋白氨基酸序列(如SEQ IDNO.11所示)的第759-1575位；
第三，本申请提供了上述稻纵卷叶螟钙粘蛋白Cry毒素结合区基因在预测稻纵卷叶螟Cry毒素抗性中的应用；若待测稻纵卷叶螟的钙粘蛋白Cry毒素结合区基因核苷酸序列与SEQ ID NO.14不同，则说明该稻纵卷叶螟受体发生基因突变，导致结合能力降低，判断昆虫对Cry毒素产生了抗性。
第四，本申请提供了上述稻纵卷叶螟钙粘蛋白Cry毒素结合区基因的编码蛋白在与Cry1Ac毒素结合中的应用。
第五，本申请提供了上述稻纵卷叶螟钙粘蛋白Cry毒素结合区基因的编码蛋白在筛选针对稻纵卷叶螟的Bt蛋白中的应用；若待筛选的Bt蛋白与Cry毒素结合区基因的编码蛋白CmCad-CR6-MPED具有高度亲和力，则必然会插入入稻纵卷叶螟中肠BBMV上，使上皮细胞膜形成孔洞致死，利用该编码蛋白 CmCad-CR6-MPED可以快速筛选或改造对稻纵卷叶螟具有高毒力的Bt毒素杀虫蛋白。
本申请在首次获得稻纵卷叶螟cadherin全长序列的基础上，预测了 CR6-MPED区(G759-L1575)作为CmCad候选的Cry1Ac毒素的毒素结合区。构建了CmCad-CR6-MPED重组蛋白并克隆至pET26b(+)载体中，在大肠杆菌BL21(DE3) 中表达并纯化。确定纯化的重组蛋白CmCad-CR6-MPED大小约120kDa。进一步确定了稻纵卷叶螟cadherin的毒素结合区CmCad-CR6-MPED与CrylAc毒素的结合，为CmCad作为CrylAc毒素的功能受体提供了可能性。该结合区的定位有助于研究对Bt毒素作用机制和抗性机制，并以此为基础设计更有效和特异性的杀虫蛋白用于鳞翅目农业害虫(特别是稻纵卷叶螟)的防治。
附图说明
图1是来自鳞翅目螟蛾科(Pidralidae)中Ostrinia nubilalis， O.furnacalis，Diatraea saccharalis和Chilo inhibitoralis的cadherin 氨基酸详细序列比对。其中，保守区域用红色虚线框表示，用于设计简并引物对。用于分析的cadherin序列来自NCBI数据库，各序列登录号如下：O.nubilalis (AAY44392.1)、O.furnacalis(ABS59299.1)、D.saccharalis(AFI81418.1) 和C.pressalis(AAM78590.1)。
图2是稻纵卷叶螟cadherin的结构特征和系统发育分析。其中，A为CmCad 蛋白的保守域结构示意图。图示了信号肽(SIG)、cadherin重复序列(CR)、近膜胞外区(MPED)、跨膜区(TMD)和胞质区(CYT)。各区域结构构上方的氨基酸数字分别表示信号序列和各区边界。B为CmCad与其他34种鳞翅目cadherin的系统进化关系。各昆虫cadherin基因的全长氨基酸序列从NCBI数据库检索获得。引导值(％)显示在每个分支上。白色文字代表昆虫科。使用的钙粘蛋白序列包括 Cnaphalocrocis medinalis(QNS31153.1)，Vanessa tameamea(XP_026498507.1)，Danaus plexippus plexippus(OWR42519.1)，Bicyclus anynana(XP_023948291.1)，Pieris rapae (XP_022113402.1)，Leptidea sinapis(VVD00118.1)，Zerene cesonia (XP_038217094.1)，Papilio polytes(XP_013137775.1)，Papilioxuthus (KPI99469.1)，Papilio machaon(XP_014361099.1)，Eombyx mandarina (XP_028026250.1)，Bombyx mori(NP_001037682.1)，Manduca sexta (AAM21151.1)，Lymantriadispar(AAL26896.1)，Lymantria xylina (QFP12818.1)，Hyphantria cunea(ASV70529.1)，Arctia plan taginis (CAB3246981.1)，Plutella xylostella(ABU41413.1)，Hyposmocoma kahamanoa (XP_026330204.1)，Pectinophora gossypiella(ASX13586.1)，Ostrinia nubilalis (AAY44392.1)，Ostrinia furnacalis(ABS59299.1)，Diatraea saccharalis (AFI81418.1)，Chilo infuscatellus(QCI02835.1)，Chilosuppressalis (AAM78590.1)，Trichcplusiani(XP_026727179.1)，Helicoverpa armigera(ABI55357.1)，Helicoverpa zea(AKH49609.1)，Helicoverpa punctigera (AVE17268.1)，Heliothis virescens(AAK85198.1)，Spodoptera exigua (AEB97395.1)，Spodopteralitura(XP_022826291.1)，Mythimna separata (AEI61920.1)，Sesamia inferens(AEL22856.1)和Sesamia nonagrioides(ABV74206.1)。
图3是表达的CmCad-CR6-MPED重组蛋白的SDS-PAGE、Western blotting 分析。其中，A为CmCad-CR6-MPED片段的各分区结构示意图。B为pET26b重组质粒诱导蛋白表达和Ni柱纯化。泳道M：蛋白质分子量；泳道1：未诱导的全细胞；泳道2：IPTG诱导的全细胞；泳道3：来自周质的IPTG诱导的蛋白质；泳道4：IPTG诱导的包涵体；泳道5：纯化的CmCad-CR6-MPED重组蛋白。C为表达的CmCad-CR6-MPED重组蛋白与抗His抗体的Western blotting分析。泳道 M：蛋白质分子量；泳道6：抗His抗体检测pET26b空载；泳道7：抗His抗体检测纯化的CmCad-CR6-MPED重组蛋白。
图4是表达的CmCad-CR6-MPED重组蛋白与CrylAc毒素结合的ligand blotting分析。其中，A为链霉亲和素检测生物素标记的CrylAc毒素；未标记的CrylAc作对照。B为生物素标记CrylAc毒素检测CmCad-CR6-MPED重组蛋白的ligand blotting；pET26b空载作ligand blotting分析的阴性对照。
具体实施方式
为方便理解本发明所述技术方案，以下结合附图和具体实施例做进一步阐述，下列实施例仅用于说明而非是对本发明权利要求范围的限制；下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均从商业途径获得。
实施例1稻纵卷叶螟钙粘蛋白cadherin基因全长序列扩增
1.1稻纵卷叶螟钙粘蛋白cadherin基因保守区序列扩增
稻纵卷叶螟采自江苏省南京市(118°52’E，32°01’N)，室内饲养数代后，选取龄期一致的4龄幼虫，使用Invitrogen Trizol试剂盒提取RNA，并使用 InvitrogenSuperScriptTMII Reverse Transcriptase试剂盒对总RNA反转录获得cDNA模板。稻纵卷叶螟属于鳞翅目螟蛾科(Pidralidae)，使用生物信息学软件DNAMAN 9.0版对与其同一科的4个昆虫(O.nubilalis、O.furnacalis、 D.saccharalis和C.pressalis)的cadherin氨基酸序列进行比对(图1)。根据这4个昆虫钙粘蛋白的保守区特征，设计了一对简并引物(核苷酸序列如 SEQ ID No.1所示的上游引物CmCad-con-F，和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的下游引物CmCad-con-R)，用来扩增稻纵卷叶螟钙粘蛋白保守区；然后以cDNA为模板，并使用I-5TM2×High Fidelity Master Mix(美国MCLAB公司)通过PCR 扩增，其中，IUBcode简并引物核苷酸代码：R＝A/G；Y＝C/T；H＝A/C/T；N＝A/C/G/T
PCR扩增体系为：2×High Fidelity MasterMix 25μl、10μM的CmCad-con-F 引物和CmCad-con-R引物各2μl、cDNA模板2μl、ddH2O补足至反应总体系50 μl；
PCR扩增条件：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min 30s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保持。
PCR反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物为2667bp的单一产物，并将对应的PCR纯化产物送至南京擎科生物公司测序。测序的结果经过氨基酸序列比对，所得到的保守序列同鳞翅目螟蛾科4个昆虫具有高度保守性，表明已获得所需要的保守氨基酸区域。该保守区核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，大小为 2667bp，其对应的889个氨基酸残基序列如SEQ ID No.4所示。
1.2稻纵卷叶螟钙粘蛋白cadherin基因全长序列获得
以步骤1.1所获得的RNA为模板，使用Smart RACE cDNA amplification kit(Clontech)构建RACE cDNA文库，操作步骤按此试剂盒说明书进行。获得产物为 5’RACEReady cDNA和3’RACE Ready cDNA，分别作为5’RACE和3’RACE反应的模板。
根据步骤1.1所获得的保守区核苷酸序列(SEQ ID No.3)设计了两种特异性引物(核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的引物CmCad-5’-R，和核苷酸序列如 SEQ ID No.6所示的引物CmCad-3’-F)。使用Smart RACE试剂盒自带的通用引物 Universal Primer A Mix(UPM，其核苷序列如SEQ ID No.7所示)和引物 CmCad-5’-R进行5’RACE PCR反应。使用引物UPM和引物CmCad-3’-F进行3’RACE PCR扩增。PCR反应条件：94℃30s，72℃3min，5个循环；94℃30s， 70℃3min，5个循环；对于5’RACE PCR，94℃30s，68℃30s，72℃3min，25 个循环。而对于3’RACE PCR，每个步骤的延伸时间均为2分钟，其他步骤与5’RACE 相同。将所得PCR产物克隆到pClone007载体(擎科生物)中，并通过南京擎科生物公司进行测序。
将所得5’和3’核苷酸序列与步骤1.1的保守区核苷酸序列进行拼接，得到稻纵卷叶螟cadherin基因全长cDNA序列。获得全长基因cDNA序列后，设计了一对引物(核苷酸序列如SEQ ID No.8所示的CmCad-full-F，和核苷酸序列如SEQ ID No.9所示的CmCad-full-R)，用于验证稻纵卷叶螟钙粘蛋白的开放阅读框(Open Reading Fram，ORF)。最后将所获得得5，455bp全长序列CmCad cDNA (SEQ ID No.10)提交至NCBI数据库(GenBank NCBI登录号MN796259.1)。
序列分析表明，克隆的cDNA序列包含一个5，175bp的ORF，一个123bp 的5’非翻译区(UTR)和一个157bp的3’-UTR，其中包含26bp的poly(A) 尾巴。经典的多腺苷酸化信号序列之一ATTAAA位于poly(A)尾部上游20bp。 CmCad cDNA编码1725个氨基酸(SEQ IDNo.11)，预测分子量为192.85kDa， pI为4.06。
扩增所涉及的所有引物序列除UPM为试剂盒自带以外，均为南京擎科生物公司人工合成。
实施例2稻纵卷叶螟钙粘蛋白CmCad序列的结构与进化分析
使用ISRECProfile服务器(https：//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN) 分析稻纵卷叶螟钙粘蛋白CmCad的二级结构特征。使用MEGA 7.0软件，通过邻位连接法(theneighbor-joining method)构建系统进化树，节点处的数字为 1000次重复的自展置信值(bootstrap values)。
预测的CmCad二级结构由信号肽(SIG)、11个cadherin重复序列(CR)、近膜胞外区(MPED)、跨膜区(TMD)和胞质区(CYT)组成，显示为典型的昆虫中肠 Cadherin结构(图2A)。
为研究来自不同昆虫物种的cadherin的进化关系，使用邻接法构建系统发育树(图2B)，结果显示，3个蛱蝶科、3个粉蝶科、3个凤蝶科、2个蚕蝶科、 2个毒蛾科、2个裳蛾科、6个螟蛾科和9个夜蛾科(Trichoplusiani形成另一个簇)的Cadherin分别根据所属科进行聚类(图2B)。CmCad与欧洲玉米螟(O. nubilalis)和亚洲玉米螟(O.furnacalis)的cadherin聚集在一起(图2B)。
实施例3稻纵卷叶螟钙粘蛋白Cry毒素结合区的构建、表达和纯化
鳞翅目昆虫中钙粘蛋白Cry毒素的TBR主要位于靠近细胞膜的6个CR结构区(例如CR6-11/CR7-12)和MPED。具体到稻纵卷叶螟的CR6-MPED，为共计817 个氨基酸，对此进截短的CmCad-CR6-MPED片段行构建、表达和纯化(J.Zhong， X.Hu，X.Zhang，Y.Liu，C.Xu，C.Zhang，M.Lin，X.Liu.Broad specificity immunoassay for detection of Bacillusthuringiensis Cry toxins through engineering of a single chain variablefragment with mutagenesis and screening.International Journal of BiologicalMacromolecules，2018，107： 920-928.)。具体为：分别使用含有NcoI和NotI限制性酶切位点的正向引物(核苷酸序列如SEQ ID No.12所示的CmCad-CR6-MPED-F，)和反向引物(核苷序列如 SEQ ID No.13所示的CmCad-CR6-MPED-R)扩增CmCad-CR6-MPED片段，引物序列为南京擎科生物公司人工合成。
扩增采用I-5TM2×PCR Master Mix，以pClone007-CmCad质粒为模板，98℃ 2min，98℃20s，58℃20s，30个循环，72℃1min，最后的延伸步骤是72℃5min。
PCR产物用琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒(Axygen)纯化，并使用NcoI和 NotI酶切位点亚克隆到pET-26b(+)载体(Novagen)中。将连接产物转化到大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞(全式金生物公司)中。通过测序验证成功转化的重组质粒及核苷酸序列(南京擎科生物公司)。
经测序确认的pET-26b-CmCad-CR6-MPED重组蛋白在含有50μg/ml卡那霉素(kanamycin)(索莱宝公司)的2×TY培养基中培养，37℃、250rpm培养至对数生长后期(OD600＝0.5-0.6)，加入1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)(索莱宝公司)，然后在 30℃、220rpm下再培养14h诱导CmCad-CR6-MPED的表达。诱导表达的细胞在8，000×g下离心15min，在pH 7.4的PBS中重悬沉淀，并通过超声破碎裂解。细胞裂解产物在12,000×g离心30min，沉淀中的包涵体溶解在8M尿素中，在Labquake Shaker Rotisserie(Thermo Fisher Scientific公司)上4℃缓慢旋转孵育过夜。溶解的重组蛋白在HiTrap Ni2+柱(GE Healthcare公司)上纯化。CmCad-CR6-MPED用100mM咪唑洗脱，然后在含6M、4M、2M且无尿素的PBS 中逐渐透析以去除残留的尿素和咪唑。CmCad-CR6-MPED的纯度通过10％SDS-PAGE 进行评估，并通过Bradford蛋白检测试剂盒(索莱宝公司)确定蛋白浓度。
为了检测CmCad-CR6-MPED重组蛋白的表达，采用了Western blotting方法。将2.0μg纯化蛋白通过10％SDS-PAGE分离，然后电转移至聚偏二氟乙烯 (polyvinylidenedifluoride，PVDF)膜(Millipore公司)。转移后，室温下将 PVDF膜在封闭缓冲液(含有0.1％Tween-20和3％BSA的PBS，PBST)中封闭1h，然后用抗His标签抗体(1∶7,500稀释)(康为世纪生物公司)孵育1h。印迹用洗涤缓冲液(含有0.1％Tween-20的PBS，PBST)洗涤5次，每次10分钟，然后使用ChromoSensor试剂(GenScript公司)在室温下显色2-3分钟，并使用分辨率高的数码相机拍照。
根据鳞翅目昆虫cadherin描述的Cryl毒素结合区的同源性特征，本实施例预测了CR6-MPED区(G759-L1575)作为CmCad候选的Cry1Ac毒素的毒素结合区(图3A)。构建了CmCad-CR6-MPED重组蛋白并克隆至pET26b(+)载体中，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，在IPTG诱导下并通过SDS-PAGE确定诱导蛋白的数量(图3B，泳道：1-4)。由于表达的CmCad-CR6-MPED重组蛋白带有His标签，使用HiTrap Ni2+柱纯化后，所表达的蛋白约为120kDa(图3B，泳道：5)。 Western blotting进一步检测，pET26b空载体与抗His标签抗体没有结合(图3C，泳道：6)，纯化的重组蛋白CmCad-CR6-MPED与抗His标签抗体结合大小(约 120kDa)(图3C，泳道：7)与SDS-PAGE结果一致。这些结果表明120kDa左右的条带是表达的重组蛋白CmCad-CR6-MPED，其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
实施例4稻纵卷叶螟钙粘蛋白Cry毒素结合区与Cry1Ac的结合
Cry1Ac毒素购自Envirotest-China(Envirologix Inc)，并溶解在碳酸钠缓冲液(CBS，pH 9.6)中，分装并储存于-80℃直至使用。使用EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotinylation试剂盒(Thermo Fisher Scientific)对可溶性 Cry毒素进行生物素标记，并按照试剂盒说明书进行操作。具体为：28.4μL 10 mM生物素用于标记1mL终体积反应中的1mg Cry毒素。在室温下缓慢旋转反应2h，然后通过脱盐柱去除过量的生物素试剂。通过使用辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase，HRP)偶联的链霉亲和素(streptavidin)(Thermo Fisher Scientific)结合Western blotting检测生物素标记效率。使用Bradford法测定生物素化Cry毒素的浓度。
为了检测CrylAc和CmCad-CR6-MPED之间的结合，使用ligand blotting 方法。具体方法跟上述Western blotting检测基本一致，不同之处在于封闭缓冲液封闭后，将PVDF膜与20nM生物素标记的Cry毒素在室温下孵育1h。PBST 洗涤5次后，然后用streptavidin-HRP(1∶7,500稀释)结合PVDF膜1h。最后显色方法跟前述Western blotting检测一样。
为了进一步确定CmCad-CR6-MPED重组蛋白与CrylAc毒素的结合，使用生物素标记的CrylAc对表达的重组蛋白进行ligand blotting分析。检测结果如图4A所示，Westernblotting结果表明了通过streptavidin-HRP检测证实了生物素标记的CrylAc毒素。ligandblotting分析的结果确定了CrylAc毒素与 CmCad-CR6-MPED重组蛋白的结合(图4B)。
稻纵卷叶螟cadherin的CrylAc毒素结合区定位到CmCad-CR6-MPED (G759-L1575)上，而且抗性机制主要是Cry毒素与昆虫BBMV上的受体蛋白结合能力的降低有关，所以当受体发生突变导致结合能力降低时，可以判断昆虫对Cry毒素产生了一定抗性。稻纵卷叶螟cadherin的CrylAc毒素结合区可以在分子水平检测该虫种是否产生了抗性成为可能。
另外，本申请明确了稻纵卷叶螟cadherin与CrylAc毒素发生结合的区域，如果某种Bt蛋白与该结合区具有高度亲和力，必然会插入入稻纵卷叶螟中肠 BBMV上，使上皮细胞膜形成孔洞致死，利用这种方法可以快速筛选或改造对稻纵卷叶螟具有高毒力的Bt杀虫蛋白。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 稻纵卷叶螟钙粘蛋白Cry毒素结合区编码基因及其编码蛋白与应用
<141> 2021-06-22
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
athathgaya tgaaygayaa y 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agggaattcc ggataacgat cagggcgaca gatggaggca cagatccagg tccactttca 1440
acggattccg ccttcacggt tatattcgtg ccttcgcgag gagatccggt cttcaatatg 1500
tcatcgactc cagttgcttt cattgagggc attgctggca tggagcagag cttccaacta 1560
ccgcaggcag aagatattaa gaacttcgcg tgtacagacg actgtttcaa catatactac 1620
aggattattg acggtaacaa tgaaggcctg ttcagcctgg aaccgtcaac caacgtgatc 1680
cgactggtgc gcgagttgga ccgagaggcc gccgctacac acacaatcat ggtggccgcc 1740
agcaactcgc ccgacgccac caaccagccg ctgcaggcat ccatcctagt cgtcaacatc 1800
aatgtgcgag aagctaaccc ccggccaata ttcgaacgag aactgtacac tgctggcatc 1860
tctacagccg acagcatcgg cagagagcta ctcactgtta aggcgacgca ctcggaagac 1920
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<211> 889
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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Glu Gln Asn Leu Arg Val Arg Glu Val Ser Ala Ser Gly Val Val Ile
20 25 30
Gly Ser Val Leu Ala Thr Asp Ile Asp Gly Pro Leu Tyr Asn Arg Val
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Arg Tyr Thr Ile Val Pro Arg Asn Asp Thr Pro Val Gly Leu Val Lys
50 55 60
Ile Asp Phe Asn Asn Gly Gln Ile Ala Val Asp Glu Asp Gly Ala Ile
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Asp Ala Asp Val Pro Pro Arg Gln Tyr Leu Tyr Tyr Thr Val Ile Ala
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Thr Tyr Trp Glu Thr Met Glu Asp Ile Gln Ile Glu Ile Leu Asp Thr
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Thr Asp Ser Ala Phe Thr Val Ile Phe Val Pro Ser Arg Gly Asp Pro
485 490 495
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Met Val Ala Ala Ser Asn Ser Pro Asp Ala Thr Asn Gln Pro Leu Gln
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595 600 605
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
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tgtattaatt aaagtaactt tatttttgaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 5455
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Gly Val Asp Thr Arg Leu Ala Ala Ala Val Leu Leu Leu Thr Ile
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Gln Ile Pro Arg Pro Asp Thr Pro Val Phe Pro Asp Gln Asp Phe Thr
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Ser Leu Glu Ile Val Asn Ile Asp Asp Asn Pro Pro Ile Ile Glu Val
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Phe Gln Ala Cys Gln Val Asp Glu Leu Gly Glu Pro Arg Ala Thr Asp
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Met Ser Phe Arg Val Glu Ser Asn Arg Pro Ser Asp Glu Gln Ile Phe
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Thr Val His Ile Thr Glu Pro Leu Asn Phe Glu Thr Asn Ala Leu His
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Val Leu Pro Gly Gly Arg Ser Gly Ala Ile Leu His Val Asp Lys Ile
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Asp Arg Asp Thr Leu Met Arg Glu Val Phe Gln Val Thr Ile Val Ala
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930 935 940
Val Asp Tyr Thr Thr Asp Glu Val Leu Asp Arg Asp Gly Asp Glu Pro
945 950 955 960
Lys His Thr Ile Phe Leu Asn Phe Ile Asp Asn Phe His Ser Glu Gly
965 970 975
Asp Gly Arg Arg Asn Gln Tyr Asp Thr Gln Val Glu Val Ile Leu Leu
980 985 990
Asp Val Asn Asp Asn Ala Pro Glu Met Pro Ser Pro Glu Glu Leu Phe
995 1000 1005
Trp Asp Asn Val Ser Glu Asn Leu Leu Glu Gly Val Arg Leu Ser Pro
1010 1015 1020
His Ile Tyr Ala Pro Asp Arg Asp Glu Pro Asp Thr Asp Asn Ser Arg
1025 1030 1035 1040
Val Gly Tyr Arg Ile Leu Ala Leu Ala Val Thr Asp Arg Pro Gly Leu
1045 1050 1055
Asp Val Pro Asp Leu Phe Thr Met Val Gln Ile Gln Asn Ile Thr Gly
1060 1065 1070
Glu Leu Glu Thr Ala Leu Pro Leu Arg Gly Tyr Trp Gly Thr Tyr Gln
1075 1080 1085
Ile His Ile Glu Ala Phe Asp His Gly His Pro Gln Gln Phe Ser Asp
1090 1095 1100
Glu Val Tyr Arg Leu Thr Ile Gln Pro Tyr Asn Phe His Ser Pro Val
1105 1110 1115 1120
Phe Gln Phe Pro Leu His Asp Ser Thr Ile Arg Leu Ala Thr Glu Leu
1125 1130 1135
Thr Thr Glu Asn Gly Gln Leu Thr Thr Ala Ser Gly Gln Phe Leu Asp
1140 1145 1150
Arg Ile His Ala Thr Asp Glu Asp Gly Leu His Ala Gly Lys Val Thr
1155 1160 1165
Phe Gln Val Gln Gly Asn Glu Glu Ala Thr Glu Tyr Phe Asn Val Val
1170 1175 1180
Asn Ser Pro Asp Gly Asp Asn Thr Gly Thr Leu Val Leu Leu Lys Thr
1185 1190 1195 1200
Phe Pro Glu Glu Ile Arg Glu Phe Arg Ile Thr Ile Arg Ala Thr Asp
1205 1210 1215
Gly Gly Thr Asp Pro Gly Pro Leu Ser Thr Asp Ser Ala Phe Thr Val
1220 1225 1230
Ile Phe Val Pro Ser Arg Gly Asp Pro Val Phe Asn Met Ser Ser Thr
1235 1240 1245
Pro Val Ala Phe Ile Glu Gly Ile Ala Gly Met Glu Gln Ser Phe Gln
1250 1255 1260
Leu Pro Gln Ala Glu Asp Ile Lys Asn Phe Ala Cys Thr Asp Asp Cys
1265 1270 1275 1280
Phe Asn Ile Tyr Tyr Arg Ile Ile Asp Gly Asn Asn Glu Gly Leu Phe
1285 1290 1295
Ser Leu Glu Pro Ser Thr Asn Val Ile Arg Leu Val Arg Glu Leu Asp
1300 1305 1310
Arg Glu Ala Ala Ala Thr His Thr Ile Met Val Ala Ala Ser Asn Ser
1315 1320 1325
Pro Asp Ala Thr Asn Gln Pro Leu Gln Ala Ser Ile Leu Val Val Asn
1330 1335 1340
Ile Asn Val Arg Glu Ala Asn Pro Arg Pro Ile Phe Glu Arg Glu Leu
1345 1350 1355 1360
Tyr Thr Ala Gly Ile Ser Thr Ala Asp Ser Ile Gly Arg Glu Leu Leu
1365 1370 1375
Thr Val Lys Ala Thr His Ser Glu Asp Ala Thr Val Thr Tyr Thr Ile
1380 1385 1390
Asp Gln Ala Ser Met Gln Val Asp Ser Ser Leu Glu Ala Val Arg Glu
1395 1400 1405
Ser Ala Phe Ala Leu Asn Ala Ala Thr Gly Ala Leu Ala Leu Asn Met
1410 1415 1420
Gln Pro Thr Ala Ala Met His Gly Met Phe Asp Phe Leu Val Leu Ala
1425 1430 1435 1440
Thr Asp Pro Ala Asn Ala Asn Asp Thr Thr Gln Val Lys Val Tyr Leu
1445 1450 1455
Ile Ser Ser Leu Asn Arg Val Thr Phe Ile Phe Val Asn Thr Leu Glu
1460 1465 1470
Glu Val Glu Ala His Arg Asp Phe Ile Ala Gln Thr Phe Thr Ala Gly
1475 1480 1485
Phe Ser Met Thr Cys Asn Ile Asp Glu Val Val Pro His Ser Asp Ser
1490 1495 1500
Asn Gly Val Ala Arg Glu Asp Val Ser Glu Val Arg Gly His Phe Ile
1505 1510 1515 1520
Arg Gly Asn Val Pro Val Leu Ala Thr Glu Ile Glu Glu Leu Arg Ser
1525 1530 1535
Asp Thr Leu Leu Leu Arg Asn Ile Gln His Ser Leu Ser Ala Asn Leu
1540 1545 1550
Leu Leu Leu Gln Asp Phe Val Thr Asp Ala Ser Pro Asp Gly Gly Ala
1555 1560 1565
Asp Ser Ala Thr Thr Thr Leu Tyr Val Leu Ala Ala Leu Ser Ala Leu
1570 1575 1580
Leu Ala Ala Leu Cys Leu Val Leu Leu Leu Thr Phe Phe Ile Arg Thr
1585 1590 1595 1600
Arg Glu Leu Asn Arg Arg Leu Gln Ala Leu Ser Met Thr Lys Tyr Gly
1605 1610 1615
Ser Val Asp Ser Gly Leu Asn Arg Val Gly Leu Ala Pro Gly Thr Asn
1620 1625 1630
Lys His Ala Val Glu Gly Ser Asn Pro Ile Trp Asn Glu Ala Ile Lys
1635 1640 1645
Ala Pro Asp Phe Asp Ala Ile Ser Asp Leu Ser Gly Asp Ser Asp Leu
1650 1655 1660
Ile Gly Ile Glu Asp Leu Pro Gln Phe Arg Glu Asp Tyr Phe Pro Pro
1665 1670 1675 1680
Ala Asp Thr Asn Ser Ala Thr Leu Ile Ala Val His Pro Arg Gly Gly
1685 1690 1695
Asp Glu Gly Leu Ala Thr His Glu Asn Asn Phe Gly Phe Asn Thr Ser
1700 1705 1710
Pro Phe Ser Gln Asp Phe Thr Asn Lys Gln Phe Asn Arg
1715 1720 1725
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggcacgctgg agcagaactt 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cagcgtggtg gtggcggagt 20
<210> 14
<211> 2451
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggcacgctgg agcagaactt gcgcgtgcgc gaggtgtccg ccagcggcgt cgtcatcggg 60
tccgtgctcg ccaccgacat cgacggaccc ctctacaaca gagtacgcta caccatagtt 120
cctcgcaatg acacgccagt tgggttggtg aagatagact tcaacaacgg gcagatcgcg 180
gtggatgagg acggcgccat cgacgcggac gtcccgccgc gccagtacct gtactacact 240
gtcattgcca gcgaccggtg ctacgagacc gaccagagcc tgtgtccgcc agaccctacc 300
tactgggaga cgatggagga tatccaaata gaaatcctag acacgaacaa caaggtaccc 360
gaagccgact acgagaggtt caacgtgacg gtgtacgtgt gggagaacgc cacgacaggc 420
gacgaggtgg tgcagctcta ctccagtgac ctcgacagag acgaaatata caacacggtg 480
cgatatcaga tcaactacgc ggtgaacgct cggctgcggc cgttcttctc ggtggaccag 540
gactcggggc tggtggtggt ggactacacc acggacgagg tgctggaccg cgacggcgac 600
gagcccaaac acaccatctt cctcaacttc atcgacaact tccactcgga aggagatgga 660
agacgaaatc agtatgatac gcaagtggaa gtgatcctcc tggatgtgaa cgacaacgct 720
ccagaaatgc cctcgccaga agaacttttc tgggataatg tatccgagaa ccttttagag 780
ggtgtgagac tatcgccgca catatacgcg ccggaccgcg acgagccgga cacggacaac 840
tcgcgcgtcg gataccgcat cctcgccctg gccgtcacgg accggccggg gctcgacgtg 900
cccgacctct tcaccatggt gcagatccag aacatcacgg gcgagctgga gaccgcgctc 960
ccactgcggg gctactgggg cacgtaccag attcacatcg aggcgttcga ccacggtcat 1020
ccccagcagt tttcagacga ggtttacagg ctcacgatcc aaccgtacaa cttccattcg 1080
ccggtattcc agtttcctct acacgactcc accatcagac ttgcgacgga gcttacaaca 1140
gagaatggac agctgacgac cgcttctggt cagtttctgg accgaatcca cgccaccgac 1200
gaagacggcc tacacgccgg gaaagtcacc ttccaagtgc aaggaaacga ggaagcaaca 1260
gagtatttca acgtggtaaa tagtccagat ggtgacaata ctggaaccct tgttctgttg 1320
aagacattcc cagaagagat cagggaattc cggataacga tcagggcgac agatggaggc 1380
acagatccag gtccactttc aacggattcc gccttcacgg ttatattcgt gccttcgcga 1440
ggagatccgg tcttcaatat gtcatcgact ccagttgctt tcattgaggg cattgctggc 1500
atggagcaga gcttccaact accgcaggca gaagatatta agaacttcgc gtgtacagac 1560
gactgtttca acatatacta caggattatt gacggtaaca atgaaggcct gttcagcctg 1620
gaaccgtcaa ccaacgtgat ccgactggtg cgcgagttgg accgagaggc cgccgctaca 1680
cacacaatca tggtggccgc cagcaactcg cccgacgcca ccaaccagcc gctgcaggca 1740
tccatcctag tcgtcaacat caatgtgcga gaagctaacc cccggccaat attcgaacga 1800
gaactgtaca ctgctggcat ctctacagcc gacagcatcg gcagagagct actcactgtt 1860
aaggcgacgc actcggaaga cgcgacagtg acgtacacca tagaccaggc cagcatgcag 1920
gtggacagca gcctggaggc ggtgcgcgag tcggccttcg cgctcaacgc agccaccggc 1980
gcgctggcgc tcaacatgca gcccaccgcc gccatgcacg gcatgttcga cttcctcgtc 2040
ctggccactg accctgctaa tgcaaatgac acgactcagg tgaaggtcta cctcatttcg 2100
tctcttaacc gtgtgacctt catattcgtc aacacgctgg aagaagtgga ggcgcacaga 2160
gatttcatag cgcagacgtt caccgccgga ttcagcatga cgtgcaacat cgacgaggtg 2220
gtcccgcaca gcgacagcaa cggcgtcgcg cgcgaggacg tgtccgaggt gcgcggccac 2280
ttcatccgcg gcaacgtgcc cgtgctcgcc accgagatcg aggagctccg cagcgacacg 2340
ttgctgctgc gcaacatcca gcacagcctg agcgccaacc tgctgctgct gcaggacttt 2400
gtgacggacg ccagccccga cggcggcgcc gactccgcca ccaccacgct g 2451
<210> 15
<211> 817
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gly Thr Leu Glu Gln Asn Leu Arg Val Arg Glu Val Ser Ala Ser Gly
1 5 10 15
Val Val Ile Gly Ser Val Leu Ala Thr Asp Ile Asp Gly Pro Leu Tyr
20 25 30
Asn Arg Val Arg Tyr Thr Ile Val Pro Arg Asn Asp Thr Pro Val Gly
35 40 45
Leu Val Lys Ile Asp Phe Asn Asn Gly Gln Ile Ala Val Asp Glu Asp
50 55 60
Gly Ala Ile Asp Ala Asp Val Pro Pro Arg Gln Tyr Leu Tyr Tyr Thr
65 70 75 80
Val Ile Ala Ser Asp Arg Cys Tyr Glu Thr Asp Gln Ser Leu Cys Pro
85 90 95
Pro Asp Pro Thr Tyr Trp Glu Thr Met Glu Asp Ile Gln Ile Glu Ile
100 105 110
Leu Asp Thr Asn Asn Lys Val Pro Glu Ala Asp Tyr Glu Arg Phe Asn
115 120 125
Val Thr Val Tyr Val Trp Glu Asn Ala Thr Thr Gly Asp Glu Val Val
130 135 140
Gln Leu Tyr Ser Ser Asp Leu Asp Arg Asp Glu Ile Tyr Asn Thr Val
145 150 155 160
Arg Tyr Gln Ile Asn Tyr Ala Val Asn Ala Arg Leu Arg Pro Phe Phe
165 170 175
Ser Val Asp Gln Asp Ser Gly Leu Val Val Val Asp Tyr Thr Thr Asp
180 185 190
Glu Val Leu Asp Arg Asp Gly Asp Glu Pro Lys His Thr Ile Phe Leu
195 200 205
Asn Phe Ile Asp Asn Phe His Ser Glu Gly Asp Gly Arg Arg Asn Gln
210 215 220
Tyr Asp Thr Gln Val Glu Val Ile Leu Leu Asp Val Asn Asp Asn Ala
225 230 235 240
Pro Glu Met Pro Ser Pro Glu Glu Leu Phe Trp Asp Asn Val Ser Glu
245 250 255
Asn Leu Leu Glu Gly Val Arg Leu Ser Pro His Ile Tyr Ala Pro Asp
260 265 270
Arg Asp Glu Pro Asp Thr Asp Asn Ser Arg Val Gly Tyr Arg Ile Leu
275 280 285
Ala Leu Ala Val Thr Asp Arg Pro Gly Leu Asp Val Pro Asp Leu Phe
290 295 300
Thr Met Val Gln Ile Gln Asn Ile Thr Gly Glu Leu Glu Thr Ala Leu
305 310 315 320
Pro Leu Arg Gly Tyr Trp Gly Thr Tyr Gln Ile His Ile Glu Ala Phe
325 330 335
Asp His Gly His Pro Gln Gln Phe Ser Asp Glu Val Tyr Arg Leu Thr
340 345 350
Ile Gln Pro Tyr Asn Phe His Ser Pro Val Phe Gln Phe Pro Leu His
355 360 365
Asp Ser Thr Ile Arg Leu Ala Thr Glu Leu Thr Thr Glu Asn Gly Gln
370 375 380
Leu Thr Thr Ala Ser Gly Gln Phe Leu Asp Arg Ile His Ala Thr Asp
385 390 395 400
Glu Asp Gly Leu His Ala Gly Lys Val Thr Phe Gln Val Gln Gly Asn
405 410 415
Glu Glu Ala Thr Glu Tyr Phe Asn Val Val Asn Ser Pro Asp Gly Asp
420 425 430
Asn Thr Gly Thr Leu Val Leu Leu Lys Thr Phe Pro Glu Glu Ile Arg
435 440 445
Glu Phe Arg Ile Thr Ile Arg Ala Thr Asp Gly Gly Thr Asp Pro Gly
450 455 460
Pro Leu Ser Thr Asp Ser Ala Phe Thr Val Ile Phe Val Pro Ser Arg
465 470 475 480
Gly Asp Pro Val Phe Asn Met Ser Ser Thr Pro Val Ala Phe Ile Glu
485 490 495
Gly Ile Ala Gly Met Glu Gln Ser Phe Gln Leu Pro Gln Ala Glu Asp
500 505 510
Ile Lys Asn Phe Ala Cys Thr Asp Asp Cys Phe Asn Ile Tyr Tyr Arg
515 520 525
Ile Ile Asp Gly Asn Asn Glu Gly Leu Phe Ser Leu Glu Pro Ser Thr
530 535 540
Asn Val Ile Arg Leu Val Arg Glu Leu Asp Arg Glu Ala Ala Ala Thr
545 550 555 560
His Thr Ile Met Val Ala Ala Ser Asn Ser Pro Asp Ala Thr Asn Gln
565 570 575
Pro Leu Gln Ala Ser Ile Leu Val Val Asn Ile Asn Val Arg Glu Ala
580 585 590
Asn Pro Arg Pro Ile Phe Glu Arg Glu Leu Tyr Thr Ala Gly Ile Ser
595 600 605
Thr Ala Asp Ser Ile Gly Arg Glu Leu Leu Thr Val Lys Ala Thr His
610 615 620
Ser Glu Asp Ala Thr Val Thr Tyr Thr Ile Asp Gln Ala Ser Met Gln
625 630 635 640
Val Asp Ser Ser Leu Glu Ala Val Arg Glu Ser Ala Phe Ala Leu Asn
645 650 655
Ala Ala Thr Gly Ala Leu Ala Leu Asn Met Gln Pro Thr Ala Ala Met
660 665 670
His Gly Met Phe Asp Phe Leu Val Leu Ala Thr Asp Pro Ala Asn Ala
675 680 685
Asn Asp Thr Thr Gln Val Lys Val Tyr Leu Ile Ser Ser Leu Asn Arg
690 695 700
Val Thr Phe Ile Phe Val Asn Thr Leu Glu Glu Val Glu Ala His Arg
705 710 715 720
Asp Phe Ile Ala Gln Thr Phe Thr Ala Gly Phe Ser Met Thr Cys Asn
725 730 735
Ile Asp Glu Val Val Pro His Ser Asp Ser Asn Gly Val Ala Arg Glu
740 745 750
Asp Val Ser Glu Val Arg Gly His Phe Ile Arg Gly Asn Val Pro Val
755 760 765
Leu Ala Thr Glu Ile Glu Glu Leu Arg Ser Asp Thr Leu Leu Leu Arg
770 775 780
Asn Ile Gln His Ser Leu Ser Ala Asn Leu Leu Leu Leu Gln Asp Phe
785 790 795 800
Val Thr Asp Ala Ser Pro Asp Gly Gly Ala Asp Ser Ala Thr Thr Thr
805 810 815
Leu
