一种猪BRS3基因CDs序列全长分段克隆的方法

文档序号：3320 发布日期：2021-09-17 浏览：51次英文

技术领域

本发明属于生物

技术领域

，具体涉及一种猪BRS3基因CDs序列全长分段克隆的方法。

背景技术

蛙皮素(Bombesin，Bn)最初是从欧洲青蛙皮肤分离的酰胺化十四肽。随后，在哺乳动物中人们发现了胃泌素释放肽(Gastrin-releasing peptide，GRP)和神经介素B(Neuromedin B，NMB)两个蛙皮素样肽。哺乳动物蛙皮素受体属于G-蛋白偶联受体，包括NMB受体(NMBR)、GRP受体(GRPR)和蛙皮素受体亚型3(bombesin receptor subtype 3，BRS3)。由于BRS3没有发现其内源性配体，又称为孤儿受体。虽然，还未发现BRS3的内源性配体，但是研究表明BRS3具有重要的生理功能，包括：影响肿瘤生长/分化，调节能量平衡和糖代谢，通过摄食调节饱腹感，调节体重、血压和心率，调节激素分泌等。

自BRS3发现以来，国内外研究者对BRS3的研究主要集中在人、大小鼠上，发现BRS3在中枢神经组织(CNS)和多种外周组织器官中有表达，尤其是在肿瘤和肺的发育高表达。猪是我国主要的经济家畜和人们动物蛋白的主要来源之一，也是一种重要的模型动物，保证猪的健康，提高猪的生产性能和繁殖能力，是畜牧兽医工作的重要责任，也为进一步研究人类疾病提供重要的参考价值。因此，克隆猪BRS3基因(包括全长CDs序列)为研究BRS3在猪体内的功能具有重要意义。通过对猪BRS3基因预测序列的分析，发现其CDs序列全长为1200bp。尽管猪BRS3基因序列并不是特别长，但是采用常规方法扩增起来却很难成功，即使更换多种高保真扩增酶也未成功，测序后发现和预测相差甚大，由于BRS3基因和其他基因的同源性较高，扩增较长序列很容发生错配，要么扩增出其他基因，要么扩增出的序列只包括部分BRS3序列，故不能使用。因此，使用直接扩增法未能得到有效的BRS3基因序列，很难实现对CDs序列全长的一次性扩增，猪BRS3基因目前还未有人成功克隆。

发明内容

为弥补现有技术的不足，本发明通过减少扩增片段长度来提高扩增成功率，采用分段克隆和基因拼接获得猪BRS3基因(包括全长CDs序列)，随后扩增获得BRS3全长CDs序列，并构建到克隆载体上，为BRS3基因的过表达和干扰序列筛选等以BRS3基因CDs序列为基础的研究与应用提供一种有效的方法。

为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案得以实现：

一种猪BRS3基因，所述基因CDs序列如SEQ ID NO：4所示。

一种猪BRS3基因CDs序列全长分段克隆的方法，将BRS3基因进行分段，通过分段克隆和基因拼接法获得猪BRS3基因序列。

进一步的，将BRS3基因分为三段序列，分别为fragment 1、fragment 2和fragment3；fragment 1、fragment 2和fragment 3彼此部分重叠，三段序列基因拼接后能够获得包含完整CDs序列的猪BRS3基因；fragment 1序列的5’端包括CDs序列的5’端，fragment 1序列的3’端和fragment 2序列的5’端部分序列重合，fragment 2序列的3’端和fragment 3序列的5’端部分序列重合，fragment 3序列的3’端包括CDs序列的3’端。

进一步的，fragment 1、fragment 2和fragment 3的序列分别如SEQ ID NO：1、SEQID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

进一步的，fragment 1、fragment 2和fragment 3PCR扩增引物如下：

fragment 1引物：

F1：ATGTCTTGAATTTGCTTGCCAT；

R1：TTACAGCCAATTCTTCCGAAC；

fragment 2引物：

F2：GGCGTTCCTAATGATACCAC；

R2：CATGGCTTTGTTCCTCCGTA；

fragment 3引物：

F3：TATTCTTTGATCGCTAGGACCC；

R3：GCCCAATAAGATCATTGTTCGT。

一种克隆载体，采用PCR扩增上述的猪BRS3基因的CDs序列，得到BRS3全长CDs序列片段，并插入pMD19T质粒构建TA克隆载体，获得BRS3全长CDs序列的克隆载体pMD19T-BRS3。

进一步的，PCR扩增引物为：

上游引物F：5’-GCTCTAGAATGGCTCAAAGGCAGC-3’；

下游引物R：5’-GGAATTCTTAGACTCTGTCTTCTTCCTTC-3’。

进一步的，选择Xba I和EcoR I为插入的酶切位点，其中上游引物插入保护碱基GC和Xba I酶切位点TCTAGA；下游引物插入保护碱基G和EcoR I酶切位点GAATTC。

一种过表达载体，采用上述克隆载体pMD19T-BRS3和pCD513B1质粒经双酶切后用T4 DNA Ligase连接，重组构建慢病毒过表达载体pCD513B1-BRS3。

上述基因、方法、克隆载体、或过表达载体在猪的基因改造或育种中的应用。

一种猪BRS3基因CDs序列全长分段克隆的方法，步骤如下：

步骤一：设计并合成BRS3基因分段扩增PCR引物；

步骤二：BRS3基因片段fragment 1/2/3的PCR扩增；

步骤三：fragment 1/2/3片段的克隆和拼接；

步骤四：设计并合成扩增BRS3全长CDs序列的引物；

步骤五：PCR扩增获得BRS3全长CDs序列；

步骤六：构建BRS3全长CDs序列克隆载体和过表达载体。

所述步骤一，BRS3基因分段扩增PCR引物设计步骤如下：

根据猪BRS3 mRNA预测序列，利用Primer Premier 5.0和Oligo7.0软件对BRS3基因进行分析，将BRS3基因分为三段设计扩增引物，引物序列如下：

(1)fragment 1引物

F1：ATGTCTTGAATTTGCTTGCCAT

R1：TTACAGCCAATTCTTCCGAAC

(2)fragment 2引物

F2：GGCGTTCCTAATGATACCAC

R2：CATGGCTTTGTTCCTCCGTA

(3)fragment 3引物

F3：TATTCTTTGATCGCTAGGACCC

R3：GCCCAATAAGATCATTGTTCGT

进一步的，所述步骤二具体为：

以猪全身各组织混合cDNA(实验室保存)为模板，分别PCR扩增获得fragment 1/2/3片段：

(1)fragment 1片段的扩增：

PCR反应体系为25μL(2×Taq Plus Master Mix 12.5μL，F1/R1各1μL，cDNA 2μL，ddH₂O 8.5μL)，反应条件为(94℃，5min；35个循环(94℃，30s；53℃(退火温度)，30s；72℃，90s)；72℃，7min)，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切取正确条带并进行胶回收纯化fragment 1片段，-20℃保存备用。

(2)fragment 2片段的扩增：

PCR反应退火温度为55℃，其他条件同(1)。

(3)fragment 3片段的扩增：

PCR反应退火温度为56℃，其他条件同(1)。

进一步的，所述步骤三包括：

将步骤二中获得的fragment 1/2/3片段分别插入pMD19T质粒构建克隆载体：

(1)fragment 1片段的TA克隆：

连接反应体系为10μL(fragment 1片段2μL，pMD19T质粒1μL，ddH₂O 2μL，SolutionI 5μL)，轻轻混匀，16℃反应30min；随后转化到DH5α感受态细胞中，铺板、蓝白斑筛选、挑取单菌落进行菌液扩增；然后进行菌液PCR鉴定，并提取质粒送测序公司进行测序，获得fragment 1片段的克隆载体，fragment 1片段序列为SEQ ID NO：1。

(2)fragment 2片段的TA克隆：

操作步骤同(1)，获得fragment 2片段的克隆载体，fragment 2片段序列为SEQ IDNO：2。

(3)fragment 3片段的TA克隆：

操作步骤同(1)，获得fragment 3片段的克隆载体，fragment 3片段序列为SEQ IDNO：3。

将fragment 1/2/3片段序列进行拼接，获得BRS3基因序列。

进一步的，所述步骤四，扩增BRS3全长CDs序列的引物设计，具体操作如下：

通过对BRS3 CDs序列进行分析，选择Xba I和EcoR I为插入的酶切位点，设计并合成上下游引物：

F：GCTCTAGAATGGCTCAAAGGCAGC

R：GGAATTCTTAGACTCTGTCTTCTTCCTTC

进一步的，所述步骤五PCR扩增BRS3 CDs全长序列，具体操作如下：

进一步的，所述步骤六具体操作为：

将步骤五中获得的BRS3全长CDs序列片段插入pMD19T质粒构建TA克隆载体，后经菌液PCR鉴定和质粒测序验证，克隆的目的片段为SEQ ID NO：4。获得BRS3全长CDs序列的克隆载体。构建的pMD19T-BRS3和pCD513B1质粒经双酶切后用T4 DNA Ligase连接，重组构建慢病毒过表达载体pCD513B1-BRS3。

有益效果：

为克服现有技术中很难通过PCR直接实现对猪BRS3基因(包括全长CDs序列)的一次性扩增的问题，本发明将BRS3基因进行分段，通过分段克隆和基因拼接法获得猪BRS3基因序列，弥补了BRS3基因在猪上研究的空白。

本发明又通过以克隆的各片段混合DNA为模板，成功扩增获得猪BRS3全长CDs序列片段，并构建到克隆载体上，为BRS3基因的过表达和干扰序列筛选等以BRS3基因CDs序列为基础的研究与应用提供一种有效的方法。

附图说明

图1为猪BRS3基因扩增流程示意图；

图2为fragment 1/2/3片段PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中1、2为fragment 1片段(493bp)、3、4为fragment 2片段(700bp)和5、6为fragment 3片段(662bp)；

图3为fragment 1/2/3片段序列基因拼接后与预测序列的比对图(图示部分比对结果)；

图4为猪BRS3 CDs序列PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果；

图5为pMD19T-BRS3克隆载体双酶切鉴定结果；

图6位pCD513B1双酶切结果；

图7为慢病毒过表达载体。

具体实施方式

以下为通过具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，所举的实施例仅用于解释本发明，但并不会限制本发明应用范围。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、猪BRS3基因分段克隆和基因序列的获得，步骤如下：

一、设计并合成BRS3基因分段扩增PCR引物

根据猪BRS3 mRNA预测序列SEQ ID NO.6，利用Primer Premier 5.0和Oligo7.0软件对BRS3基因进行序列分析，将BRS3基因分为三段序列(fragment 1/2/3)。其中，fragment1序列的5’端包括CDs序列的5’端，fragment 1序列的3’端和fragment 2序列的5’端部分序列重合，fragment 2序列的3’端和fragment 3序列的5’端部分序列重合，fragment 3序列的3’端包括CDs序列的3’端(图1所以)。由于fragment 1/2/3片段彼此部分重叠，因此将fragment 1/2/3三段序列基因拼接后能够获得包含完整CDs序列的猪BRS3基因。

fragment 1/2/3序列PCR扩增引物设计如下：

(1)fragment 1引物

F1：ATGTCTTGAATTTGCTTGCCAT

R1：TTACAGCCAATTCTTCCGAAC

(2)fragment 2引物

F2：GGCGTTCCTAATGATACCAC

R2：CATGGCTTTGTTCCTCCGTA

(3)fragment 3引物

F3：TATTCTTTGATCGCTAGGACCC

R3：GCCCAATAAGATCATTGTTCGT

将设计的引物送公司合成，-20℃保存备用。

二、PCR扩增获得fragment 1/2/3片段

fragment 1片段PCR扩增的反应体系为25μL，具体为：2×Taq Plus Master Mix12.5μL、F1/R1各1μL、cDNA(猪各组织混合cDNA)2μL、ddH₂O 8.5μL。混匀后在PCR仪中按照优选的反应条件进行扩增，具体反应条件为：94℃5min、35个循环(94℃30s、53℃(退火温度)30s、72℃90s)、72℃7min、4℃终止。PCR程序结束后，扩增产物用2％琼脂糖凝胶进行核酸电泳，通过凝胶成像系统进行拍照(图2)。根据fragment 1片段的大小(493bp)切取相应条带，随后按照通用型DNA纯化回收试剂盒说明书进行操作，纯化回收获得fragment 1片段，-20℃保存备用。

fragment 2片段PCR扩增的反应体系(扩增引物为F2/R2)和反应条件(退火温度为55℃)同fragment 1。fragment 2片段大小为700bp，纯化回收后-20℃保存备用。

fragment 3片段PCR扩增的反应体系(扩增引物为F3/R3)和反应条件(退火温度为56℃)同fragment 1。fragment 3片段大小为662bp，纯化回收后-20℃保存备用。

三、fragment 1/2/3片段的克隆和序列拼接

分别将获得的fragment 1/2/3片段连接到TA克隆载体pMD19T中，连接反应体系为10μL，具体为：fragment 1/2/3片段2μL、pMD19T质粒1μL、ddH₂O 2μL、Solution I 5μL。轻轻混匀后，16℃水浴反应30min。随后将构建的TA克隆质粒转化到DH5α感受态细胞中，冰浴30min，随后42℃水浴准确热激90s，立刻置于冰水中静置2min，然后加入无氨苄(Amp^-)的普通LB液体培养基，在37℃180rpm/min震荡培养60min进行复壮。在含氨苄(Amp⁺)的LB固体培养基的平板上37℃倒置培养过夜，筛选克隆菌落，并挑取单个菌落在含Amp⁺的LB液体培养基中进行细菌扩增。

参照fragment 1/2/3片段扩增的PCR反应体系和条件，用菌液作为模板cDNA进行PCR扩增，初步筛选出成功转入目的片段TA克隆质粒的菌液。根据高纯度质粒小提试剂盒(离心柱型)说明书提取菌液中的质粒，并送测序公司进行测序。对测序结果进行分析，得知fragment 1/2/3片段的基因序列分别如序列表SEQ ID NO.1～3所示。

根据fragment 1/2/3片段的基因序列进行基因拼接获得猪BRS3基因序列如序列表SEQ ID NO.5所示，获得的猪BRS3基因序列长度为1501bp，其中132-1331位点之间为CDs序列，长度为1200bp。随后将克隆的猪BRS3序列与猪BRS3预测序列进行序列比对(图3)，比对结果表明：本发明克隆的1501bp的猪BRS3基因仅有2个碱基和预测序列不同，证明我们成功克隆了猪BRS3基因，其序列如SEQ ID NO.5所示。猪BRS3基因的成功克隆弥补了BRS3基因在猪上研究的空白，为研究BRS3基因在猪体内的功能提供基础。

实施例2、猪BRS3基因CDs序列的获得和过表达载体的构建，步骤如下：

一、设计并合成扩增BRS3全长CDs序列的PCR引物

根据实施例1中我们克隆的猪BRS3基因的CDs序列，通过生物信息学软件对猪BRS3基因(SEQ ID NO.5)的CDs序列进行序列分析，选择Xba I和EcoR I为插入的酶切位点，设计并合成上游引物(插入保护碱基GC和Xba I酶切位点TCTAGA)F：5’-GCTCTAGAATGGCTCAAAGGCAGC-3’；下游引物(插入保护碱基G和EcoR I酶切位点GAATTC)R：5’-GGAATTCTTAGACTCTGTCTTCTTCCTTC-3’。将设计的引物送公司合成，-20℃保存备用。

二、PCR扩增BRS3 CDs全长序列

PCR反应体系为25μL(2×Taq Plus Master Mix 12.5μL，F/R各1μL，模板为fragment 1/2/3片段胶回收产物各1μL的混合DNA，ddH₂O 7.5μL)，反应条件为(94℃，5min；35个循环(94℃，30s；58℃(退火温度)，30s；72℃，90s)；72℃，7min；4℃终止)。PCR程序结束后，扩增产物用1.2％琼脂糖凝胶进行核酸电泳，通过凝胶成像系统进行拍照(图4)。根据CDs序列的大小(1200bp)切取相应条带，随后按照通用型DNA纯化回收试剂盒说明书进行操作，纯化回收后获得两端带酶切位点的猪BRS3 CDs片段，-20℃保存备用。

三、构建BRS3全长CDs序列克隆载体和过表达载体

将上面获得的BRS3全长CDs序列片段插入pMD19T质粒构建TA克隆载体，后经菌液PCR鉴定和质粒测序验证。获得BRS3全长CDs序列的克隆载体pMD19T-BRS3，其序列如SEQ IDNO.4所示。BRS3 TA克隆载体的构建、菌液PCR鉴定和质粒提取方法同上。

根据优化的酶切体系(50μL)，酶切体系如表1所示：

表1双酶切反应体系

酶切反应条件为37℃水浴2h，然后加入6μL 10×Loading Buffer终止酶切反应。将所得的酶切产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测(图5和图6)，并切取目的条带，并根据通用型DNA纯化回收试剂盒对目的片段进行纯化回收；将上述获得的目的条带根据优化的连接体系在T4 DNA Ligase作用下进行连接，重组构建慢病毒过表达载体pCD513B1-BRS3，并转化到DH5α感受态细胞内进行菌液扩增(菌落的培养、筛选和扩增同上)，并对质粒测序进行验证。

SEQ ID NO.1：fragment 1片段序列，长度为493bp；序列为：

SEQ ID NO.2：fragment 2片段序列，长度为700bp；序列为：

GGCGTTCCTAATGATACCACAAATAAAGGAAGGACCGGAGACAACTCTCCAGGAATAGAAGCATTGTGTGTCATCTATTTCACTTATGCCGTGATCATTTCAGTGGGCATCCTTGGAAATGCTATTCTCATCAAAGTCTTTTTCAAGACCAAGTCCATGCAAACAGTTCCCAACATTTTCATCACCAGCCTGGCTTTTGGAGATCTTTTACTTCTGCTAACTTGTGTGCCAGTGGATGCAACCCACTACCTTGCAGAAGGATGGCTGTTCGGAAGAATTGGCTGTAAGGTGCTCTCTTTCATCCGGCTCACTTCTGTTGGTGTATCAGTGTTCACGTTAACAATTCTCAGTGCTGACAGATACAAGGCAGTTGTGAAACCCCTGGAGCGGCAGCCCTCCAACGCCATCCTGAAGACCTGTGCCAAAGCTGGCTGCATCTGGATCGTGTCCATGCTAATTGCTCTACCAGAGGCTATATTTTCCAATGTATATACTTTTCACGATCCCAACAGAAATATGACATTTGAAGCGTGTGCCTCCTATCCTGTTTCTGAGAGGCTCCTGCAAGAGATACATTCTCTGCTGTGCTTCTTAGTATTCTACATTATTCCCCTCTCCATCATCTCTGTCTATTATTCTTTGATCGCTAGGACCCTTTACAAAAGCACCTTGAACATACCTACGGAGGAACAAAGCCATG；

SEQ ID NO.3：fragment 3片段序列，长度为662bp；序列为：

TATTCTTTGATCGCTAGGACCCTTTACAAAAGCACCTTGAACATACCTACGGAGGAACAAAGCCATGCCCGAAGGCAGATCGAATCCCGGAAGCGAATTGCCAAAACAGTGTTGGTGCTGGTGGCTCTGTTTGCTCTCTGCTGGTTGCCGAATCACCTCCTGTATCTTTACCGCTCATTCACTTACCAAACCTACGTGGACTCCTCTGCCATTCATTTTATTGTCACCATTTTCTCTCGGGTTCTGGCTTTCAGCAATTCTTGCGTAGACCCCTTTGCTCTTTACTGGCTGAGCAAAACCTTCCAGCAGCATTTTAAAGCTCAGTTATTCTGTTGCAAGGCAGAGGCGCCTGAACCTTCTGCTGGTGATATACCTCTTGACAACCTGGCAGTGATGGGACGGGTCCGGGGTGCTGCGAGCACTCAGGTGTCTGAAATTAGTGCGTCCCTGTTTCCTGGCAGTGGTGTCAAGAAGGAAGAAGACAGAGTCTAACTTTTCCATTAAAACCGGTGTTTTTCCTTCCAGCATGTGTATTCGACTCTGGGCGACGTGTAGGTTTATGGTGTCAGGTTGCTCGTTTGTGAATAGTGCTGAAGTCTTAGGAGGGAAGGCTTGGACAAACCATGATTTTCTTCAAGGTACGAACAATGATCTTATTGGGC；

SEQ ID NO.4：BRS3基因CDs序列两端加酶切位点和保护碱基，长度为1215bp；序列为：

GCTCTAGAATGGCTCAAAGGCAGCCTCAGTCACCTAATCAGACTTTAATTTCAACCACAAATGACACAGAATCATCAAGCCCCGGCGTTCCTAATGATACCACAAATAAAGGAAGGACCGGAGACAACTCTCCAGGAATAGAAGCATTGTGTGTCATCTATTTCACTTATGCCGTGATCATTTCAGTGGGCATCCTTGGAAATGCTATTCTCATCAAAGTCTTTTTCAAGACCAAGTCCATGCAAACAGTTCCCAACATTTTCATCACCAGCCTGGCTTTTGGAGATCTTTTACTTCTGCTAACTTGTGTGCCAGTGGATGCAACCCACTACCTTGCAGAAGGATGGCTGTTCGGAAGAATTGGCTGTAAGGTGCTCTCTTTCATCCGGCTCACTTCTGTTGGTGTATCAGTGTTCACGTTAACAATTCTCAGTGCTGACAGATACAAGGCAGTTGTGAAACCCCTGGAGCGGCAGCCCTCCAACGCCATCCTGAAGACCTGTGCCAAAGCTGGCTGCATCTGGATCGTGTCCATGCTAATTGCTCTACCAGAGGCTATATTTTCCAATGTATATACTTTTCACGATCCCAACAGAAATATGACATTTGAAGCGTGTGCCTCCTATCCTGTTTCTGGGAGGCTCCTGCAAGAGATACATTCTCTGCTGTGCTTCTTAGTATTCTACATTATTCCCCTCTCCATCATCTCTGTCTATTATTCTTTGATCGCTAGGACCCTTTACAAAAGCACCTTGAACATACCTACGGAGGAACAAAGCCATGCCCGAAAGCAGATCGAATCCCGGAAGCGAATTGCCAAAACAGTGTTGGTGCTGGTGGCTCTGTTTGCTCTCTGCTGGTTGCCGAATCACCTCCTGTATCTTTACCGCTCATTCACTTACCAAACCTACGTGGACTCCTCTGCCATTCATTTTATTGTCACCATTTTCTCTCGGGTTCTGGCTTTCAGCAATTCTTGCGTAAACCCCTTTGCTCTTTACTGGCTGAGCAAAACCTTCCAGCAGCATTTTAAAGCTCAGTTATTCTGTTGCAAGGCAGAGGCGCCTGAACCTTCTGCTGGTGATATACCTCTTGACAACCTGGCAGTGATGGGACGGGTCCGGGGTGCTGCGAGCACTCAGGTGTCTGAAATTAGTGCGTCCCTGTTTCCTGGCAGTGGTGTCAAGAAGGAAGAAGACAGAGTCTAAAAGCTTG；

SEQ ID NO.5：BRS3基因序列，长度为1501bp；CDs为序列的132-1331位点处，长度为1200bp，序列为：

ATGTCTTGAATTTGCTTGCCATTCTGCTCTGTTCTCCTAGCATCTCATTGCTAGACGTAGGCATTAGACGTGACAATCAAGTACCTCTGAACTGAGCAGAAGAAAGATTAAAGGCATAGGCTTCAGAAGCAATGGCTCAAAGGCAGCCTCAGTCACCTAATCAGACTTTAATTTCAACCACAAATGACACAGAATCATCAAGCCCCGGCGTTCCTAATGATACCACAAATAAAGGAAGGACCGGAGACAACTCTCCAGGAATAGAAGCATTGTGTGTCATCTATTTCACTTATGCCGTGATCATTTCAGTGGGCATCCTTGGAAATGCTATTCTCATCAAAGTCTTTTTCAAGACCAAGTCCATGCAAACAGTTCCCAACATTTTCATCACCAGCCTGGCTTTTGGAGATCTTTTACTTCTGCTAACTTGTGTGCCAGTGGATGCAACCCACTACCTTGCAGAAGGATGGCTGTTCGGAAGAATTGGCTGTAAGGTGCTCTCTTTCATCCGGCTCACTTCTGTTGGTGTATCAGTGTTCACGTTAACAATTCTCAGTGCTGACAGATACAAGGCAGTTGTGAAACCCCTGGAGCGGCAGCCCTCCAACGCCATCCTGAAGACCTGTGCCAAAGCTGGCTGCATCTGGATCGTGTCCATGCTAATTGCTCTACCAGAGGCTATATTTTCCAATGTATATACTTTTCACGATCCCAACAGAAATATGACATTTGAAGCGTGTGCCTCCTATCCTGTTTCTGAGAGGCTCCTGCAAGAGATACATTCTCTGCTGTGCTTCTTAGTATTCTACATTATTCCCCTCTCCATCATCTCTGTCTATTATTCTTTGATCGCTAGGACCCTTTACAAAAGCACCTTGAACATACCTACGGAGGAACAAAGCCATGCCCGAAGGCAGATCGAATCCCGGAAGCGAATTGCCAAAACAGTGTTGGTGCTGGTGGCTCTGTTTGCTCTCTGCTGGTTGCCGAATCACCTCCTGTATCTTTACCGCTCATTCACTTACCAAACCTACGTGGACTCCTCTGCCATTCATTTTATTGTCACCATTTTCTCTCGGGTTCTGGCTTTCAGCAATTCTTGCGTAGACCCCTTTGCTCTTTACTGGCTGAGCAAAACCTTCCAGCAGCATTTTAAAGCTCAGTTATTCTGTTGCAAGGCAGAGGCGCCTGAACCTTCTGCTGGTGATATACCTCTTGACAACCTGGCAGTGATGGGACGGGTCCGGGGTGCTGCGAGCACTCAGGTGTCTGAAATTAGTGCGTCCCTGTTTCCTGGCAGTGGTGTCAAGAAGGAAGAAGACAGAGTCTAACTTTTCCATTAAAACCGGTGTTTTTCCTTCCAGCATGTGTATTCGACTCTGGGCGACGTGTAGGTTTATGGTGTCAGGTTGCTCGTTTGTGAATAGTGCTGAAGTCTTAGGAGGGAAGGCTTGGACAAACCATGATTTTCTTCAAGGTACGAACAATGATCTTATTGGGC；

SEQ ID NO.6：BRS3基因预测序列，长度为2808bp；CDs为序列的173-1372位点处，序列为：

TGCTGGGAGATACAGAACTACTGAAGGGAAGGAGTCTCCGGATGTCTTGAATTTGCTTGCCATTCTGCTCTGTTCTCCTAGCATCTCATTGCTAGACGTAGGCATTAGACGTGACAATCAAGTACCTCTGAACTGAGCAGAAGAAAGATTAAAGGCATAGGCTTCAGAAGCAATGGCTCAAAGGCAGCCTCAGTCACCTAATCAGACTTTAATTTCAACCACAAATGACACAGAATCATCAAGCCCCGGCGTTCCTAATGATACCACAAATAAAGGAAGGACCGGAGACAACTCTCCAGGAATAGAAGCATTGTGTGTCATCTATTTCACTTATGCCGTGATCATTTCAGTGGGCATCCTTGGAAATGCTATTCTCATCAAAGTCTTTTTCAAGACCAAGTCCATGCAAACAGTTCCCAACATTTTCATCACCAGCCTGGCTTTTGGAGATCTTTTACTTCTGCTAACTTGTGTGCCAGTGGATGCAACCCACTACCTTGCAGAAGGATGGCTGTTCGGAAGAATTGGCTGTAAGGTGCTCTCTTTCATCCGGCTCACTTCTGTTGGTGTATCAGTGTTCACGTTAACAATTCTCAGTGCTGACAGATACAAGGCAGTTGTGAAACCCCTGGAGCGGCAGCCCTCCAACGCCATCCTGAAGACCTGTGCCAAAGCTGGCTGCATCTGGATCGTGTCCATGCTAATTGCTCTACCAGAGGCTATATTTTCCAATGTATATACTTTTCACGATCCCAACAGAAATATGACATTTGAAGCGTGTGCCTCCTATCCTGTTTCTGAGAGGCTCCTGCAAGAGATACATTCTCTGCTGTGCTTCTTAGTATTCTACATTATTCCCCTCTCCATCATCTCTGTCTATTATTCTTTGATCGCTAGGACCCTTTACAAAAGCACCTTGAACATACCTACGGAGGAACAAAGCCATGCCCGAAAGCAGATCGAATCCCGGAAGCGAATTGCCAAAACAGTGTTGGTGCTGGTGGCTCTGTTTGCTCTCTGCTGGTTGCCGAATCACCTCCTGTATCTTTACCGCTCATTCACTTACCAAACCTACGTGGACTCCTCTGCCATTCATTTTATTGTCACCATTTTCTCTCGGGTTCTGGCTTTCAGCAATTCTTGCGTAAACCCCTTTGCTCTTTACTGGCTGAGCAAAACCTTCCAGCAGCATTTTAAAGCTCAGTTATTCTGTTGCAAGGCAGAGGCGCCTGAACCTTCTGCTGGTGATATACCTCTTGACAACCTGGCAGTGATGGGACGGGTCCGGGGTGCTGCGAGCACTCAGGTGTCTGAAATTAGTGCGTCCCTGTTTCCTGGCAGTGGTGTCAAGAAGGAAGAAGACAGAGTCTAACTTTTCCATTAAAACCGGTGTTTTTCCTTCCAGCATGTGTATTCGACTCTGGGCGACGTGTAGGTTTATGGTGTCAGGTTGCTCGTTTGTGAATAGTGCTGAAGTCTTAGGAGGGAAGGCTTGGACAAACCATGATTTTCTTCAAGGTACGAACAATGATCTTATTGGGCTTTCTAAATAAAGCGAAGCCCCACCAGGCATAGGAAGACACGTTTGTATATGTCAGTGGGTCCTAAGGGAAGTTGAAGAGGAAGGGAAGGCGAAATCAACAAGATGACACTGAAAAATCTAATTTATTTCCATCACATCTACGAAGCTTCTAATTTCACATATGCTCCTGTGATTTGCATAAAACTGTGATTGTGTTTGTTATGTGGTGTAAATCTATAGATTATACTTTGCATTTGAAGAGGGGATCAAAGTGAGGTAAAACATGTCTTCTGCAGTTTTCTTTTTAAAAAGTCCTAAAAAAGAATCCTTCGTGGGTGGCTTTTTTGTTTGGCTGATTTTCGTTTTTGACTGCCCTTTTCCATTAATCGCTATTCCATCAGAATCAATGCTGTGAAATGGCAATGAAAATGTTTTGGGGTCAGCGGCGTACACGAGAAAGGATCTGGGGCAAGGTGTTTGCCTTACTAGGTCAGCGCTTACTAACTTAAGGTAGTTCTACTTCCAACTACCATTGATTGATAATTGGGCAAAGTTATCTTTCACAAATATTGTGAAGAACTTGCCTTCTTCACGGGCAGAATAAGTGGCCACGTTTATGGTGTCATTTGAGGGCTCCAAAGAGGGCCCCCCTGGTCAAAAACTCTGCGAGCCTGCCAGTGTCTGAAATTCTTCCTTTAAGGAAATTCATTTCTTTCTGGTAAGCAGTGCCCTCTTTCTAAAAGATGCAGAAGTACCACATGTGATCCCTAACACCTGGGTGTGCAGATGTCATCAGATCATCTTCCTGCCTGACTACCCGAAACCCCAAGTGTGCCTGAGTCCTGTAAGAGTATGACCTCATTAATCTCTGCCCTTGGAAATCAGATGGAAGGTTCTGATTTTCTGTCCTCTGCTCCTACTTGCTACCGCTTTAAGCTTACTAATAAATATTATTTCCAACAACTGCTGTTGTCAATAGATGTGTCAGATTTAGATTTGTGGTTTCAGAAAAATGTTTTCTTGGGGCAAATTAAAGCATATGTTTGGCACTATTGATAGTTAAATCTGTATTTTCAAAAACTTGATTTTGGGGTGTGCTTTTGGTAACTCCGAGCTTCTTTAAGTGGCTTGTGTACCTGTGAGCTTTTGCTTAAAGATGTGGCTTGAATGGGGACATCTATATTAACACTAGGCTTTCCATTTCTGTAAAACTGGCTTCCTTAAAGTGGGAGGGGGTCTTAGTATTGTTTTGAGTTGGACATTGTACTAAGTGGAGAGAAACAAAT。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种猪BRS3基因CDs序列全长分段克隆的方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 493

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtcttgaa tttgcttgcc attctgctct gttctcctag catctcattg ctagacgtag 60

gcattagacg tgacaatcaa gtacctctga actgagcaga agaaagatta aaggcatagg 120

cttcagaagc aatggctcaa aggcagcctc agtcacctaa tcagacttta atttcaacca 180

caaatgacac agaatcatca agccccggcg ttcctaatga taccacaaat aaaggaagga 240

ccggagacaa ctctccagga atagaagcat tgtgtgtcat ctatttcact tatgccgtga 300

tcatttcagt gggcatcctt ggaaatgcta ttctcatcaa agtctttttc aagaccaagt 360

ccatgcaaac agttcccaac attttcatca ccagcctggc ttttggagat cttttacttc 420

tgctaacttg tgtgccagtg gatgcaaccc actaccttgc agaaggatgg ctgttcggaa 480

gaattggctg taa 493

<210> 2

<211> 700

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggcgttccta atgataccac aaataaagga aggaccggag acaactctcc aggaatagaa 60

gcattgtgtg tcatctattt cacttatgcc gtgatcattt cagtgggcat ccttggaaat 120

gctattctca tcaaagtctt tttcaagacc aagtccatgc aaacagttcc caacattttc 180

atcaccagcc tggcttttgg agatctttta cttctgctaa cttgtgtgcc agtggatgca 240

acccactacc ttgcagaagg atggctgttc ggaagaattg gctgtaaggt gctctctttc 300

atccggctca cttctgttgg tgtatcagtg ttcacgttaa caattctcag tgctgacaga 360

tacaaggcag ttgtgaaacc cctggagcgg cagccctcca acgccatcct gaagacctgt 420

gccaaagctg gctgcatctg gatcgtgtcc atgctaattg ctctaccaga ggctatattt 480

tccaatgtat atacttttca cgatcccaac agaaatatga catttgaagc gtgtgcctcc 540

tatcctgttt ctgagaggct cctgcaagag atacattctc tgctgtgctt cttagtattc 600

tacattattc ccctctccat catctctgtc tattattctt tgatcgctag gaccctttac 660

aaaagcacct tgaacatacc tacggaggaa caaagccatg 700

<210> 3

<211> 662

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tattctttga tcgctaggac cctttacaaa agcaccttga acatacctac ggaggaacaa 60

agccatgccc gaaggcagat cgaatcccgg aagcgaattg ccaaaacagt gttggtgctg 120

gtggctctgt ttgctctctg ctggttgccg aatcacctcc tgtatcttta ccgctcattc 180

acttaccaaa cctacgtgga ctcctctgcc attcatttta ttgtcaccat tttctctcgg 240

gttctggctt tcagcaattc ttgcgtagac ccctttgctc tttactggct gagcaaaacc 300

ttccagcagc attttaaagc tcagttattc tgttgcaagg cagaggcgcc tgaaccttct 360

gctggtgata tacctcttga caacctggca gtgatgggac gggtccgggg tgctgcgagc 420

actcaggtgt ctgaaattag tgcgtccctg tttcctggca gtggtgtcaa gaaggaagaa 480

gacagagtct aacttttcca ttaaaaccgg tgtttttcct tccagcatgt gtattcgact 540

ctgggcgacg tgtaggttta tggtgtcagg ttgctcgttt gtgaatagtg ctgaagtctt 600

aggagggaag gcttggacaa accatgattt tcttcaaggt acgaacaatg atcttattgg 660

gc 662

<210> 4

<211> 1215

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctctagaat ggctcaaagg cagcctcagt cacctaatca gactttaatt tcaaccacaa 60

atgacacaga atcatcaagc cccggcgttc ctaatgatac cacaaataaa ggaaggaccg 120

gagacaactc tccaggaata gaagcattgt gtgtcatcta tttcacttat gccgtgatca 180

tttcagtggg catccttgga aatgctattc tcatcaaagt ctttttcaag accaagtcca 240

tgcaaacagt tcccaacatt ttcatcacca gcctggcttt tggagatctt ttacttctgc 300

taacttgtgt gccagtggat gcaacccact accttgcaga aggatggctg ttcggaagaa 360

ttggctgtaa ggtgctctct ttcatccggc tcacttctgt tggtgtatca gtgttcacgt 420

taacaattct cagtgctgac agatacaagg cagttgtgaa acccctggag cggcagccct 480

ccaacgccat cctgaagacc tgtgccaaag ctggctgcat ctggatcgtg tccatgctaa 540

ttgctctacc agaggctata ttttccaatg tatatacttt tcacgatccc aacagaaata 600

tgacatttga agcgtgtgcc tcctatcctg tttctgggag gctcctgcaa gagatacatt 660

ctctgctgtg cttcttagta ttctacatta ttcccctctc catcatctct gtctattatt 720

ctttgatcgc taggaccctt tacaaaagca ccttgaacat acctacggag gaacaaagcc 780

atgcccgaaa gcagatcgaa tcccggaagc gaattgccaa aacagtgttg gtgctggtgg 840

ctctgtttgc tctctgctgg ttgccgaatc acctcctgta tctttaccgc tcattcactt 900

accaaaccta cgtggactcc tctgccattc attttattgt caccattttc tctcgggttc 960

tggctttcag caattcttgc gtaaacccct ttgctcttta ctggctgagc aaaaccttcc 1020

agcagcattt taaagctcag ttattctgtt gcaaggcaga ggcgcctgaa ccttctgctg 1080

gtgatatacc tcttgacaac ctggcagtga tgggacgggt ccggggtgct gcgagcactc 1140

aggtgtctga aattagtgcg tccctgtttc ctggcagtgg tgtcaagaag gaagaagaca 1200

gagtctaaaa gcttg 1215

<210> 5

<211> 1501

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5