OsAKR4C10在创建非转基因草甘膦抗性水稻种质资源中的应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及水稻基因OsAKR4C10通过调节水稻对草甘膦吸收累积去创建非转基因草甘膦抗性水稻种质资源中的应用。
背景技术
水稻是全世界约22亿人的主要粮食，其中杂草防控得当是保证水稻品质和产量的关键，人工拔除和生物防治方式效率低成本高，除草剂能很好克服这些弊端，仍是当下最重要的防治手段。目前稻田除草剂种类多达十几种，防治对象不一且使用技术要求各异，容易导致除草剂药害、过量农药残留、耐性杂草群增加等问题发生。
草甘膦因其广谱高效、对人畜无害且环境兼容性好的特点使其常年处于除草剂的龙头地位，但也受其对水稻非选择性灭生的制约，草甘膦无法在水稻田中大面积施用。而通过培育抗草甘膦水稻是目前常用的应对方法，例如中国专利CN107129993A公开了一种修饰的抗草甘膦基因及抗草甘膦水稻的培育方法，中国专利CN106497922A、CN106497924A、CN106497923A等公开了抗螟虫抗草甘膦转基因水稻的构建方法，上述方法均是通过将外源的草甘膦抗性基因遗传转化至水稻内，从而培育抗草甘膦转基因水稻品种。然而外源转入抗性基因存在研发时间长、效率低、基因污染的问题；而通过发掘内源的水稻的草甘膦转运蛋白基因，再通过植物基因工程技术使其失活可以较好解决上述问题。然而目前在水稻中发挥调节水稻对草甘膦吸收累积的相关基因还鲜有报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供水稻OsAKR4C10基因在调节水稻对草甘膦吸收累积中的应用。
本发明的第二个目的在于提供水稻OsAKR4C10基因在创建非转基因草甘膦抗性水稻种质资源中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
本发明研究表明，敲除水稻OsAKR4C10基因可以抑制水稻对草甘膦的吸收累积，降低水稻中草甘膦含量，提高水稻对草甘膦的抗性；利用基因编辑技术对生产主栽品种OsAKR4C10基因进行基因编辑，获得水稻草甘膦抗性品种，并利用有性或者无性繁殖获得的草甘膦抗性水稻品种。因此，本发明提供关于水稻OsAKR4C10基因和OsAKR4C10蛋白的以下应用：
水稻OsAKR4C10基因在调节水稻对草甘膦的吸收累积中的应用，所述水稻OsAKR4C10基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；或与SEQ ID NO：2所示核苷酸序列至少具有50％同源性，且编码如SEQ ID NO：1所示氨基酸的核苷酸序列。
水稻OsAKR4C10蛋白在调节水稻对草甘膦的吸收累积中的应用，所述水稻OsAKR4C10蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；或SEQ ID NO：1所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加仍具有相同功能的衍生蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列：
MAKHFVLNTGAKIPSVGLGTWQSDPGVVGDAVYAAVKAGYRHIDCARMYKNENEVGIALKKLFEEGVVKREDLFITSKLWCDCHAPEDVPESLDKTLSDLQLEYLDLYLIHWPFRVKKGSGISNTEDYIPPDIPSTWGAMEKLYDSGKSRAIGVSNFSSKKLGDLLAVACVPPAVDQVECHPGWQQTKLHNFCQSTGVHLSAYSPLGSPGSTWMNSNVLKESVIISIAEKLGKTPAQVALHWNIQMGHSVLPKSVTEERIKQNIDVYDWSIPEDLLVKFSEIKQVRLLRGDVIVNPHSVYKTHEELWDGEI.
SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列：
atggcgaagcatttcgtgctcaacaccggcgccaagatcccctcggtggggctcggcacctggcagtccgacccgggcgtcgtcggcgacgccgtctacgccgctgtcaaggcggggtaccggcacatcgattgcgccagaatgtacaaaaatgaaaatgaggtggggatagctctgaagaagctatttgaagaaggtgttgtcaagcgtgaagatttatttatcacatctaagctatggtgtgattgtcatgccccagaggatgtgcctgagtcactagacaaaactctgagtgacttacagcttgagtacctggatctttaccttattcattggccattcagagtcaagaagggctcaggcattagtaacactgaagactacataccacctgacatcccatctacctggggagcaatggagaagctatatgattctggtaaatctcgtgccattggtgtaagtaacttctcatcaaaaaaactgggtgacctgcttgctgtagcctgtgtacctccagctgttgatcaggtagaatgccatcctggttggcagcaaacgaagctacataacttctgccagtcaactggcgttcatctttctgcatactcgcctctaggttcacctggttcaacatggatgaacagtaacgtccttaaggaatccgtcatcatctcaattgcagagaagctcggcaaaactcctgcacaagtggcactgcactggaacattcagatgggtcacagtgtactcccaaaaagtgtgaccgaagaaaggataaagcagaacatagatgtttatgactggtctattccagaggacttgcttgttaagttctctgagattaagcaggttaggcttctcaggggcgacgtcattgttaatccccacagcgtttataagacccatgaggagctctgggacggcgaaatttag
水稻OsAKR4C10基因在培育抗草甘膦水稻品种中的应用，所述水稻OsAKR4C10基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；或与SEQ ID NO：2所示核苷酸序列至少具有50％同源性，且编码如SEQ ID NO：1所示氨基酸的核苷酸序列。
水稻OsAKR4C10蛋白在培育抗草甘膦水稻品种中的应用，所述水稻OsAKR4C10蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示或SEQ ID NO：1所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加仍具有相同功能的衍生蛋白质的氨基酸序列。
具体地，为通过抑制水稻中OsAKR4C10基因的表达，或抑制OsAKR4C10蛋白的表达量和/或活性，得到抗草甘膦水稻品种。
可选地，所述的抑制水稻中OsAKR4C10基因的表达，或抑制OsAKR4C10蛋白的表达量和/或活性为通过基因编辑、RNA干扰、同源重组或基因敲除等本领域常规方法来进行。
可选地，所述基因编辑为构建水稻CRISPR-Cas9系统，系统中含有识别水稻OsAKR4C10基因靶标序列的sgRNA。
可选地，所述靶标的序列如SEQ ID NO：3所示。
AGGTGCCGAGCCCCACCGAGGGG(SEQ ID NO：3)。
本发明通过水稻的草甘膦转运蛋白基因的功能鉴定，利用植物基因编辑技术使其失活，进而而获得以低吸收草甘膦为机理的草甘膦抗性水稻种质资源。其优势在于：发挥草甘膦高效灭生的特点去简约化稻田除草并延长除草适期；避免常规抗草甘膦作物外源转入抗性基因带来的研发时间长、效率低、基因污染的问题；最重要的是在杂草和作物中实现草甘膦输导选择性，杀除杂草的同时减少水稻中草甘膦的累积量和施用量，对环境和生态友好，能够为“加快生物育种创新，保障国家粮食安全”提供新思路。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了水稻OsAKR4C10基因在调节水稻对草甘膦吸收累积中的应用，本发明研究表明敲除水稻OsAKR4C10基因可以抑制水稻对除草剂草甘膦的吸收累积，减少水稻植株中草甘膦的含量，降低对人体的健康风险；同时敲除水稻OsAKR4C10基因可以从遗传上调节水稻对草甘膦的吸收累积，提高水稻对草甘膦的抗性，选育抗草甘膦水稻品种。本发明将草甘膦吸收累积和抗性机理结合的手段为抗除草剂作物的研究提供一个很好的选择，可用于创建非转基因草甘膦抗性水稻种质资源，具有较大的应用前景。
附图说明
图1为中花11号和OsAKR4C10基因的突变体的序列比对结果图。
图2为草甘膦喷雾处理中花11号后，不同时间OsAKR4C10基因的实时荧光定量PCR检测结果图。(A)水稻地上部OsAKR4C10基因表达情况；(B)水稻地下部OsAKR4C10基因表达情况。
图3为中花11号和OsAKR4C10基因突变体在种子萌发期对草甘膦的耐受情况。(A)WT与osakr4c10在不同浓度草甘膦组培培养基中幼苗芽长比较；(B)WT与osakr4c10在不同浓度草甘膦组培培养基中幼苗地上部长度比较；(C)WT与osakr4c10在不同浓度草甘膦组培培养基中幼苗根长比较。
图4为中花11号和OsAKR4C10基因突变体在幼苗期根部吸收草甘膦后不同部位积累量检测结果图。(A)叶部草甘膦积累量；(B)茎部草甘膦积累量；(C)根部草甘膦积累量；(D)LC-MS/MS检测草甘膦和其代谢物AMPA峰图。
图5为中花11号和OsAKR4C10基因突变体在成株期离体叶片浸泡草甘膦后的耐受情况。(A)浸泡于5.75mmol/L草甘膦后叶片的表型观察；(B)浸泡于11.5mmol/L草甘膦后叶片的表型观察；(C)浸泡于5.75mmol/L草甘膦后叶片的Fv/Fm；(D)浸泡于11.5mmol/L草甘膦后叶片的Fv/Fm。
图6为中花11号和OsAKR4C10基因突变体在成株期喷施草甘膦后的耐受情况。
图7为中花11号和OsAKR4C10基因突变体在成株期喷施草甘膦后叶绿素含量的变化情况。(A)3.6mM草甘膦喷施下WT和osakr4c10水稻叶片叶绿素含量变化；(B)10.8mM草甘膦喷施WT和osakr4c10下水稻叶片叶绿素含量变化。
图8为中华1号和桂育11号背景OsAKR4C10基因突变体与其杂交后代在成株期喷施草甘膦后的耐受情况。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实施例中大肠杆菌DH5α和农杆菌EHA105为常用的菌株，可商业上购买得到；水稻品种为野生型中花11号(公开使用的水稻品种，市售)。实施例中所使用的引物由深圳华大基因公司合成，测序在深圳华大基因公司进行。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1CRISPR敲除构建OsAKR4C10突变体植株
1、利用CRISPR/Cas9系统，根据OsAKR4C10的外显子序列选择靶标序列
利用简单、高效的CRISPR/Cas9系统，根据OsAKR4C10外显子序列选择特异的靶标序列，靶标序列：5’-AGGTGCCGAGCCCCACCGAGGGG-3’。靶标序列针对OsAKR4C10基因，特异的使OsAKR4C10蛋白失活。
2、构建含上述靶标序列片段的pCRISPR/Cas9重组载体
1)根据靶标序列，设计带粘性末端的接头引物
将设计的靶序列添加pCRISPR/Cas9系统的特异粘性末端接头，并合成完整的接头引物。
F1：5’-TGTGTGGGTGCCGAGCCCCACCGAG-3’；
R1：5’-AAACCTCGGTGGGGCTCGGCACCCA-3’。
2)将带粘性末端的接头引物退火互补形成带粘性末端的双链小片段
将F1引物和R1引物稀释成浓度为10μM的溶液，各取10μL混匀，在PCR仪中进行退火反应，从98℃降至22℃，使F1引物和R1引物互补形成带粘性末端的双链小片段。
3)酶切包含sg-RNA的原始载体pOs-sgRNA(TAKARA Cat#632640)
用限制性内切酶BsaⅠ酶切包含sg-RNA的原始载体pOs-sgRNA，产生可以和靶标序列粘性末端互补的粘性末端。用BsaⅠ酶切pOs-sgRNA原始载体的体系为：10×buffer 2μL、BsaⅠ酶1μL、pOs-sgRNA载体4μg、ddH2O补足至20μL，37℃酶切12h。酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳核查条带大小后，试剂盒(OMEGA Cat#D2500-02)过柱回收纯化酶切产物，得到酶切过的pOs-sgRNA载体，加入灭菌的ddH2O溶解，测定浓度后待用。
4)将带粘性末端的双链小片段连接到酶切过的pOs-sgRNA载体上，形成包含靶标序列和sg-RNA的重组载体
用T4连接酶将步骤2)中的双链小片段和步骤3)中酶切过的pOs-sgRNA载体连接，形成完整的包含针对OsAKR4C10蛋白的靶序列和sg-RNA的重组载体。15μL连接体系为：10×T4 ligation buffer 1.5μL、双链小片段4μL、酶切过的pOs-sgRNA载体3μL、T4 DNA ligase1μL、ddH2O补足至15μL，16℃连接12小时。连接产物转化大肠杆菌DH5α，卡那抗性LB平板过夜培养(含卡那霉素10mg/L)，挑选阳性菌株进行测序，得到测序正确的包含靶标序列和sg-RNA的重组载体。
5)用LR mix将包含靶标序列和sg-RNA的重组载体与包含Cas9的载体pH-Ubicas9-7进行LR反应重组，形成包含靶标序列-sg-RNA+Cas9的完整重组载体
用LR mix(上海北诺生物科技有限公司)将步骤4)得到的重组载体和包含Cas9的载体pH-Ubi-cas9-7(百格基因科技有限公司提供)进行LR反应重组。LR反应体系：包含靶标序列和sg-RNA的重组载体25-50ng、pH-Ubi-cas9-7载体75ng、5×LR Clonase TM buffer 1μL、TE Buffer(pH8.0)补充到4.5μL、LR ClonaseTM 0.5μL。将体系于25℃下温育2h，反应后加2μL 2μg/μL的Proteinase K，在37℃下处理10min，再将2μL反应产物转入大肠杆菌DH5α，庆大霉素抗性LB平板37℃过夜培养，挑选阳性菌株进行测序，得到测序正确的包含OsAKR4C10蛋白靶标序列-sg-RNA+Cas9的完整pCRISPR/Cas9-OsAKR4C10重组表达载体。
3、将所获得的包含OsAKR4C10蛋白靶标序列-sg-RNA+Cas9的完整重组载体导入水稻愈伤组织中得到转基因植株
1)将步骤2获得的重组表达载体pCRISPR/Cas9-OsAKR4C10电击转入农杆菌EHA105中(Olivia C.D,2019)，得到重组菌AGL1/pCRISPR/Cas9-OsAKR4C10。
2)将重组菌AGL1/pCRISPR/Cas9-OsAKR4C10用农杆菌介导的方法转化中花11号水稻愈伤组织，具体如下：
挑取AGL1/pCRISPR/Cas9-OsAKR4C10单菌落，接种于10mL的农杆菌培养基中(含卡那霉素50mg/L、利福平50mg/L)，28℃，180rpm摇床培养2-3天。取4mL菌液，4000rpm离心3min，倒去上清液，加入少量AAM培养基重新悬浮细胞，然后加入20mL的AAM培养基(含0.1mM乙酰丁香酮As)，28℃、150rpm摇床避光培养1-2h，培养至OD600＝0.4左右。挑选生长状态良好、颗粒状中花11号(以下也称为野生型水稻)水稻愈伤组织浸入农杆菌培养液(不含琼脂的YEP)中，28℃、150-200rpm摇20min，将愈伤组织倒出，用无菌滤纸吸干多余菌液，将愈伤组织平铺在含多层滤纸的无菌平皿中，超净台上吹干(愈伤分散不结块)，然后将愈伤组织转移到共培养培养基上，黑暗条件下培养2-3天。将愈伤转至含有100mg/L的潮霉素和400mg/L头孢霉素的NB基本培养基上筛选3-4周(一筛)。将成活的愈伤组织转入二筛培养基(含100mg/L潮霉素及200mg/L头孢霉素的NB基本培养基)上筛选3周。将抗性愈伤组织转入分化培养基(含100mg/L潮霉素)上进行分化，再生植株在含100mg/L潮霉素的壮苗培养基上生根后(约3-4周)转移至温室中，在T0代植株中就可以得到OsAKR4C10蛋白完全失活的转基因植株。
上述转化中所用的培养基如下：
共培养培养基(北京华越洋生物科技有限公司)：诱导愈伤及继代培养基+As(0.1mmol/L)+葡萄糖(10g/L)，pH 5.2。
农杆菌侵染水稻愈伤组织培养基(AAM培养基，北京华越洋生物科技有限公司)：AA大量元素+AA微量元素+AA氨基酸+MS维生素+水解酪蛋白(500mg/L)+蔗糖(68.5g/L)+葡萄糖(36g/L)+As(0.1mM)，pH 5.2。
NB基本培养基(北京华越洋生物科技有限公司)：N6大量元素+B5微量元素+B5有机成分+铁盐+水解酪蛋白(300mg/L)+脯氨酸(500mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(8g/L)，pH 5.8。
诱导愈伤及继代培养基：NB基本培养基+2，4-D(2mg/L)。
分化培养基：NB基本培养基+6-BA(3mg/L)+NAA(1mg/L)。
壮苗培养基：1/2MS培养基+NAA(0.5mg/L)+MET(0.25mg/L)。
农杆菌培养基(YEP)：10g/L胰化蛋白胨+10g/L酵母提取物+5g/L氯化钠+15g/L琼脂。
4、筛选转基因植株中的转基因阳性植株
将步骤3移栽的转基因植株(T0代)提取DNA(OMEGA Cat#D3485-02)，进行靶序列位点检测，共检测到12株阳性植株。
5、利用转基因阳性植株获得突变体植株
1)突变位点的鉴定
将移栽的步骤4的阳性植株提取DNA(OMEGA Cat#D3485-02)，针对含靶标位点的500bp以内的DNA片段，设计特异性引物F2和R2，扩增含靶标位点的DNA片段，扩增得到的289bp PCR产物经纯化后送公司测序，测序结果与野生型植株序列比对，筛选出突变体植株。
F2:5’-GGCCGCTGCCTACAGTAAAG-3’；
R2:5’-AGAGGAGAGGAGGAGACGC-3’。
2)将突变体植株进行繁种，于T1代转基因分离群体中检测不含潮霉素、Cas9等转基因元件的植株单株收种子，得到功能缺失突变体，命名为osakr4c10。功能缺失突变体与野生型植株的突变分析结果如图1所示。
实施例2草甘膦处理水稻后的实时荧光定量试验
配制10.8mmol/L草甘膦溶液，对生长25天的野生型品种中花11号植株进行喷雾处理，以清水处理作为对照。处理后分别提取5、72、120h的地上部分(茎和叶)和地下部分RNA(OMEGA Cat#R6827-02)，反转录(Takara,PrimeScript RT reagent Kit with gDNAEraser)后进行实时荧光定量PCR以检测OsAKR4C10基因的表达。实验设三次重复，结果取平均值。
实时荧光定量PCR使用Bio-Rad CFX96进行。PCR反应体系(20μL)按照产品使用说明书SYBR Green Real-Time PCR Master Mix reagent(Takara)进行，具体体系如下：10μLSYBR Green Real-Time PCR Master Mix、2μL上下游引物混合物(上下游引物浓度均为10μM)、7μL RNase-free water、1μL cDNA模板。具体反应程序如下：酶热激活95℃、30s，1个循环；变性95℃、5s，延伸60℃、30s，共40个循环。
扩增OsAKR4C10基因的引物序列为：
F3：5’-AACACTGAAGACTACATACCACCT-3’；
R3：5’-ACTTACACCAATGGCACGAGA-3’。
以UBQ2作为内参基因，扩增内参UBQ2的引物序列为：
F4：5’-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3’；
R4：5’-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3’。
数据的处理采用Comparative Ct的方法，即Ct值为PCR管中荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数，ΔCt＝Ct(OsAKR4C10)-Ct(UBQ2)，以2－△△Ct的值衡量基因转录水平，对样品中OsAKR4C10基因的表达进行分析比较。
结果如图2所示，在草甘膦诱导处理5h后，与清水处理对照组相比，水稻地上部中OsAKR4C10的表达量上调2.62倍；而在水稻地下部，OsAKR4C10基因的表达量在处理组和对照组间没有差异。72h后，处理组与清水对照组相比，无论是水稻地上部还是地下部OsAKR4C10基因的表达量均没有统计学意义差异，同时草甘膦处理组的水稻地上部OsAKR4C10基因的表达量出现回落。120h后，处理组与清水对照组相比，水稻地上部OsAKR4C10基因的表达量无统计学意义差异；而水稻的地下部，处理组OsAKR4C10基因诱导表达量相较对照组显著上调9.71倍。
实施例3萌发期水稻对草甘膦敏感性试验
采用组培苗的种植方式进行osakr4c10突变体与野生型水稻萌发期对草甘膦的敏感性试验。将osakr4c10突变体水稻和作为对照的中花11号野生型水稻种子在49℃下烘种4天，进行种子活力复苏。种前水稻种子先用75％酒精(用无水乙醇和灭菌水配制)，再用50％NaClO溶液清洗，最后用无菌水冲洗干净以完成种子彻底消毒。种时把镊子在酒精灯下烧热，冷却后夹住种子置于MS培养基(分别含有0、10、25、50μmol/L草甘膦)，种完后组培瓶瓶口封好前期置于28℃避光发芽，待出苗后转至光暗周期12/12h，温度为光照30℃，黑暗28℃的环境条件下继续培养15天。观察表型拍照记录并测量地上和地下部分长度。
结果显示，在10μmol/L草甘膦浓度下，突变体植株的根长和芽长明显比高于野生型。在25μmol/L草甘膦浓度下，osakr4c10突变体水稻幼苗的生长相较于不含草甘膦时生长仅受到轻微的抑制，而野生型水稻种子萌发后几乎不能生长。在50μmol/L草甘膦浓度下，osakr4c10突变体水稻幼苗种子仍能萌发但进一步的幼苗营养生长阶段受到显著抑制，野生型水稻种子完全变黑皱缩死亡(图3)。结果说明OsAKR4C10基因的缺失显著提高了水稻种子萌发期对草甘膦的耐受性，且有利于植株的生长。
实施例4幼苗期水稻根部吸收草甘膦试验
将水培21天长势均一的osakr4c10突变体和中花11号水稻苗转移至50mL离心管，每组内6株为一重复，每处理3组重复。施药前，将水稻根置于0.5mmol/LCaCl2(pH＝5.8)中进行1h的预培养后，换用0.5mM CaCl2(pH＝5.8)含0.5mmol/L的草甘膦药液培养3天后对水稻的根、茎、叶分别收样并称重保存。样品前处理方法为：用液氮将样品研磨至粉末，每0.2g样品使用1mL灭菌水提取，将提取液混合物转移至10mL离心管中，涡旋5min后，超声30min，6000rpm离心5min。取上清液1mL，加入0.4mL CH2Cl2去除杂质，涡旋混匀3min，6000rpm离心5min，取上清水相1mL，加入50mg C18进行净化，涡旋3min，最高转速离心10min，取0.8mL离心后的上清，加入0.4mL的5％硼酸钠缓冲溶液和0.4mL的1.0g/L的FMOC-Cl丙酮溶液，涡旋混匀后置于37℃下过夜衍生处理，衍生结束后过0.45μm有机滤膜，LC-MS/MS测定草甘膦和AMPA量。
结果显示，24h后无论是在根、茎、叶中，osakr4c10突变体的草甘膦含量都低于野生型水稻，说明OsAKR4C10功能缺失后对草甘膦的吸收能力降低；72h后osakr4c10突变体叶部和根部的草甘膦含量低于野生型水稻，但osakr4c10突变体和野生型的茎部草甘膦含量之间没有显著性差异，这可能是水稻根部向上运输能力饱和导致的结果，同时所有样品中未检测到草甘膦代谢物AMPA(图4)。结果说明OsAKR4C10基因参与了草甘膦从水稻根部向上的转运。
实施例5成株期水稻离体叶片对草甘膦抗性试验
挑选在水稻培养箱生长35天的植株，剪取同等长度的叶片浸泡于20mL 0.1％(v/v)Silwet L-77(北京博奥拓达科技有限公司)溶液中(含5.75或11.5mmol/L草甘膦)，静置于光暗周期12/12h，温度为光照时30℃，黑暗时28℃的环境条件下培养。不同时段观察其药害发展进程，利用叶绿素荧光成像仪在5h、24h、48h时段分别测量每个叶片PS II最大量子产量(Fv/Fm)值。并于4天后检查osakr4c10突变体和野生型水稻叶段各处理药害情况并拍照记录。
结果显示，在低浓度草甘膦处理下，野生型(中花11号)和osakr4c10突变体水稻叶片受害不严重，Fv/Fm虽随时间增加而变低但无显著差异(图5A和C)；而在高浓度下，野生型水稻叶片相较于osakr4c10突变体药害更明显，出现更多黄斑且失绿情况严重，结合光合作用指标Fv/Fm一致说明osakr4c10突变体相较于野生型对草甘膦更耐受(图5B和D)。
实施例6成株期水稻植株对草甘膦抗性试验
将osakr4c10突变体水稻种子和野生型中花11号水稻种子消毒、催芽后播种于盆栽盆内，置于光暗周期12/12h，温度为光照时30℃，黑暗时28℃的环境条件下培养55天后进行草甘膦喷雾实验(浓度为3.6或10.8mmol/L)，药剂选用草甘膦商品化产品农达(草甘膦有效含量30％)，持续记录植物的生长和形态特征。
同时选取喷雾后0、1、3、5、7、9天时间点测量了各处理叶片的叶绿素含量，实验条件和方法按照文献(周勇，范晓磊，林拥军，陈浩.(2018).水稻叶绿素含量的测定.Bio-101e1010147.)。
结果显示，在不施用草甘膦条件下，osakr4c10突变体水稻和野生型中花11号的生长状态是相当的；在3.6mmol/L的草甘膦处理下，野生型中花11号植株4天后出现生长停滞的现象，9天后出现失水萎焉，叶片出现黄化卷曲；在10.8mmol/L的草甘膦处理下，WT植株4天后出现叶片黄化卷曲，9天后枯萎死亡。而osakr4c10突变体水稻的生长在两个浓度处理下4天或者9天后均没有明显药害特征出现，和没有喷施的草甘膦的植株生长态势相当(图6)。同时检测不同处理后的叶片叶绿素含量，发现WT叶片的叶绿素含量随时间持续降低，osakr4c10突变体水稻叶片的叶绿素含量随着草甘膦施用后减少但不显著(图7)。说明OsAKR4C10基因功能的丧失赋予了水稻成株对草甘膦的抗性。
实施例7桂育11号背景OsAKR4C10基因编辑植株与水稻品种杂交后代草甘膦抗性测定
桂育11号背景的OsAKR4C10基因编辑植株，在稻穗已完全抽出或部分抽出，当天能开花的植株作为父本植株；选择中华1号，在稻穗已完全抽出或部分抽出，但尚有较多谷粒尚未开花的植株作为母本。用剪刀剪去母本植株稻穗上部已完全开过花的枝梗和稻穗下部尚未发育的枝梗，然后剪去中部不透明、内有花药的谷粒的上部1/2～2/3的颖壳，具体以剪破谷粒内的花药和不伤害谷粒内的雌性器官为标准。随后用装满70％药用酒精的喷壶对上述处理的稻穗进行喷雾，去雄套袋。当天中午或者次日中午人工授粉。父本稻穗开花盛期用剪刀轻轻把花粉量大的稻穗在穗颈处剪下，将稻穗朝下轻轻放入事先准备好的母本植株牛皮纸杂交袋内，抖落使父本花粉充分落在母本植株稻穗上，达到授粉的目的。获得F1按照实施例1方法鉴定OsAKR4C10基因位点的突变，选择纯合突变体，连续进行3代自交，每一代都按照实施例1方法鉴定目标位点的突变。获得OsAKR4C10基因位点突变纯化株系，以中华1号为对照，按照实施例6方法鉴定植株草甘膦抗性。结果发现，在不施用草甘膦条件下，株系GY11-1、GY11-2和GY11-3突变体水稻株系和中华1号的生长状态是相当的；在10.8mmol/L的草甘膦处理下，中华1号植株4天后出现叶片严重黄化卷曲，9天后枯萎死亡。而株系GY11-1、GY11-2和GY11-3突变体水稻株系均没有明显药害特征出现，和没有喷施草甘膦的植株生长态势相当(图8)。说明OsAKR4C10基因功能的丧失赋予了水稻成株对草甘膦的抗性，且可用于通过杂交方式创制草甘膦抗性种质资源。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> OsAKR4C10在创建非转基因草甘膦抗性水稻种质资源中的应用
<141> 2021-05-08
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 311
<212> PRT
<213> 水稻(Oryza sativa L)
<400> 1
Met Ala Lys His Phe Val Leu Asn Thr Gly Ala Lys Ile Pro Ser Val
1 5 10 15
Gly Leu Gly Thr Trp Gln Ser Asp Pro Gly Val Val Gly Asp Ala Val
20 25 30
Tyr Ala Ala Val Lys Ala Gly Tyr Arg His Ile Asp Cys Ala Arg Met
35 40 45
Tyr Lys Asn Glu Asn Glu Val Gly Ile Ala Leu Lys Lys Leu Phe Glu
50 55 60
Glu Gly Val Val Lys Arg Glu Asp Leu Phe Ile Thr Ser Lys Leu Trp
65 70 75 80
Cys Asp Cys His Ala Pro Glu Asp Val Pro Glu Ser Leu Asp Lys Thr
85 90 95
Leu Ser Asp Leu Gln Leu Glu Tyr Leu Asp Leu Tyr Leu Ile His Trp
100 105 110
Pro Phe Arg Val Lys Lys Gly Ser Gly Ile Ser Asn Thr Glu Asp Tyr
115 120 125
Ile Pro Pro Asp Ile Pro Ser Thr Trp Gly Ala Met Glu Lys Leu Tyr
130 135 140
Asp Ser Gly Lys Ser Arg Ala Ile Gly Val Ser Asn Phe Ser Ser Lys
145 150 155 160
Lys Leu Gly Asp Leu Leu Ala Val Ala Cys Val Pro Pro Ala Val Asp
165 170 175
Gln Val Glu Cys His Pro Gly Trp Gln Gln Thr Lys Leu His Asn Phe
180 185 190
Cys Gln Ser Thr Gly Val His Leu Ser Ala Tyr Ser Pro Leu Gly Ser
195 200 205
Pro Gly Ser Thr Trp Met Asn Ser Asn Val Leu Lys Glu Ser Val Ile
210 215 220
Ile Ser Ile Ala Glu Lys Leu Gly Lys Thr Pro Ala Gln Val Ala Leu
225 230 235 240
His Trp Asn Ile Gln Met Gly His Ser Val Leu Pro Lys Ser Val Thr
245 250 255
Glu Glu Arg Ile Lys Gln Asn Ile Asp Val Tyr Asp Trp Ser Ile Pro
260 265 270
Glu Asp Leu Leu Val Lys Phe Ser Glu Ile Lys Gln Val Arg Leu Leu
275 280 285
Arg Gly Asp Val Ile Val Asn Pro His Ser Val Tyr Lys Thr His Glu
290 295 300
Glu Leu Trp Asp Gly Glu Ile
305 310
<210> 2
<211> 936
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L)
<400> 2
atggcgaagc atttcgtgct caacaccggc gccaagatcc cctcggtggg gctcggcacc 60
tggcagtccg acccgggcgt cgtcggcgac gccgtctacg ccgctgtcaa ggcggggtac 120
cggcacatcg attgcgccag aatgtacaaa aatgaaaatg aggtggggat agctctgaag 180
aagctatttg aagaaggtgt tgtcaagcgt gaagatttat ttatcacatc taagctatgg 240
tgtgattgtc atgccccaga ggatgtgcct gagtcactag acaaaactct gagtgactta 300
cagcttgagt acctggatct ttaccttatt cattggccat tcagagtcaa gaagggctca 360
ggcattagta acactgaaga ctacatacca cctgacatcc catctacctg gggagcaatg 420
gagaagctat atgattctgg taaatctcgt gccattggtg taagtaactt ctcatcaaaa 480
aaactgggtg acctgcttgc tgtagcctgt gtacctccag ctgttgatca ggtagaatgc 540
catcctggtt ggcagcaaac gaagctacat aacttctgcc agtcaactgg cgttcatctt 600
tctgcatact cgcctctagg ttcacctggt tcaacatgga tgaacagtaa cgtccttaag 660
gaatccgtca tcatctcaat tgcagagaag ctcggcaaaa ctcctgcaca agtggcactg 720
cactggaaca ttcagatggg tcacagtgta ctcccaaaaa gtgtgaccga agaaaggata 780
aagcagaaca tagatgttta tgactggtct attccagagg acttgcttgt taagttctct 840
gagattaagc aggttaggct tctcaggggc gacgtcattg ttaatcccca cagcgtttat 900
aagacccatg aggagctctg ggacggcgaa atttag 936
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L)
<400> 3
aggtgccgag ccccaccgag ggg 23
