一种提高青蒿中青蒿素含量的方法
技术领域
本发明涉及基因工程
技术领域
，尤其涉及一种提高青蒿中青蒿素含量的方法。背景技术
植物新陈代谢分为初生代谢和次生代谢，初生代谢产物(如糖类、脂类和核酸)存在于所有植物中，是维持细胞生命活动所必需的，而植物次生代谢产物是指植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布具有种属、组织器官和生长发育特异性。在天然植株中产生的次生代谢产物含量极低，而使用化学合成的方法，工艺流程复杂、成本高。因此，研究人员开始探索其他的提高植物次生代谢产物含量的方法，在诸多方法之中，提高分泌型腺毛的密度被认为是一种直接有效的方法，分泌型腺毛是植物表皮细胞特化出的一种多细胞结构，近年来对腺毛的研究发现，许多有价值的次生代谢产物都是在这一结构中特异性合成和储存，比如以薄荷精油、玫瑰精油为代表的一大类天然香精香料；以青蒿素为代表的中草药有效成分；以啤酒花为代表的天然植物添加剂。
在腺毛中特异性合成的次生代谢产物有个共同的特点，即参与这些次生代谢产物合成的关键酶基因只在腺毛中特异表达。因此，利用基因工程的方法调控腺毛密度是颇具应用价值的植物遗传操作手段。在次生代谢领域，关于分泌型腺毛的报道还比较少，特别是在传统中草药青蒿的研究中。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何提高青蒿中青蒿素的含量。
为实现上述目的，本发明第一方面提供了如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列在提高青蒿中青蒿素含量中的应用。
本发明第二方面提供一种提高青蒿中青蒿素含量的方法，所述方法包括如下步骤：将SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列导入所述青蒿中，得到含有所述核苷酸的再生转基因青蒿。
进一步地，所述方法包括如下步骤：
步骤1、根据所述核苷酸序列构建得到表达载体；
步骤2、将所述表达载体转入农杆菌，再将所述农杆菌转入青蒿中；
步骤3、通过抗生素筛选，获得含有所述核苷酸的再生转基因青蒿。
进一步地，所述核苷酸序列的制备方法包括：
根据青蒿的总RNA反转录得到cDNA，并根据所述cDNA扩增得到所述核苷酸序列。
进一步地，所述根据所述cDNA扩增得到所述核苷酸中，引物具有如SEQ ID NO.2和如SEQ ID NO.3所示的序列。
进一步地，步骤2中，根据所述核苷酸序列构建得到表达载体具体包括：
在所述核苷酸序列的5’和3’端引入BamHI和SpeI酶切位点，将pHB-GFP载体双酶切成线性化载体，并通过Infusion无缝克隆技术将所述核苷酸序列与pHB-GFP线性化载体连接，得到表达载体。
进一步地，采用冻融法将所述表达载体转入所述农杆菌中。
进一步地，将所述农杆菌转入青蒿中具体包括：将转入所述表达载体的农杆菌与所述青蒿的外植体共培养。
进一步地，所述再生转基因青蒿中腺毛密度大于等于30个每平方毫米，叶片总腺毛数量为96809个。
进一步地，所述再生转基因青蒿的青蒿素含量大于等于15mg/g DW。
本发明提供的核苷酸序列可编码SPL家族转录因子(简称AaSPL9)，经研究表明，AaSPL9参与青蒿腺毛密度的调控,本发明利用转基因技术将该核苷酸序列导入青蒿中得到再生转基因青蒿，通过调控青蒿表皮的腺毛密度，从而提高青蒿素的含量，具体地，非转基因青蒿的叶片腺毛密度为20个每平方毫米，每个叶片的总腺毛数量为56947个，而本申请得到的再生转基因青蒿的叶片腺毛密度提高到30个每平方毫米以上，总腺毛数量提高到96809个，与之对应的青蒿素含量从非转基因青蒿的11mg/g DW提高到15mg/g DW以上，说明本申请提供的方法能有效提高青蒿中青蒿素的含量，对青蒿素的规模化生产具有重要意义。
附图说明
图1为再生转基因青蒿中AaSPL9蛋白的相对表达量测试结果；
图2A为野生型青蒿叶片腺毛的荧光显微镜观察结果；
图2B为再生转基因青蒿叶片腺毛的荧光显微镜观察结果；
图3为腺毛密度统计结果；
图4为每个叶片总腺毛数量统计结果；
图5为青蒿素含量的分析结果。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法均按照常规方法进行，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、青蒿AaSPL9基因的克隆
1.青蒿总RNA的提取
取青蒿叶片组织，置于液氮中研碎，加入盛有裂解液的1.5mL Eppendorf(EP)离心管中，充分振荡后，按照TIANGEN试剂盒的说明书抽提总RNA。
2.编码AaSPL9蛋白的基因的克隆
以所提取的总RNA为模板，在PowerScript反转录酶的作用下合成cDNA；根据所需序列设计基因特异性引物(SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3)，通过PCR从总cDNA中扩增得到编码AaSPL9蛋白的基因，并测序。
通过测序结果，表明获得了编码AaSPL9蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
实施例2、表达载体的构建
通过PCR扩增在上述核苷酸序列的5’和3’端引入BamHI和SpeI酶切位点，将pHB-GFP载体双酶切成线性化载体，并通过Infusion无缝克隆技术将核苷酸序列与pHB-GFP线性化载体连接，得到表达载体。
实施例3、再生转基因青蒿的获得
1.含AaSPL9过量表达载体的根癌农杆菌工程菌的获得
将实施例2得到的表达载体采用冻融法转入根癌农杆菌(如EHA105，购自澳大利亚CAMBIA公司，菌株编号为Gambar 1)，并进行PCR验证，验证结果表明，表达载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。
2.根癌农杆菌介导AaSPL9基因转化青蒿
2.1.外植体的预培养
青蒿种子用75％乙醇浸泡1min，再用20％NaClO浸泡20min，无菌水冲洗3-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS(Murashige and Skoog,1962)固体培养基中，25℃、16h/8h(light/dark)光照培养，即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5cm左右后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化。
2.2.农杆菌与外植体的共培养
将上述叶片外植体，转到共培养培养基(1/2MS+AS 100μmol/L)中，滴加含活化好的所述含AaSPL9植物过量表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3d。以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。
2.3.抗性再生植株的筛选
将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+NAA0.05mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L)上于25℃、16h/8h光照培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽。将生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基(1/2MS+Cb 125mg/L)上培养至生根，从而获得Kan抗性再生转基因青蒿植株。
3.再生转基因青蒿植株的PCR检测
根据目的基因所在表达盒上游的35S启动子区域和AaSPL9分别设计正向引物计和反向引物对目的基因进行检测。结果表明，利用所设计的PCR特异引物，能扩增出特异DNA片段，而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。
本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的含AaSPL9植物过量表达载体的根癌农杆菌菌株，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得再生转基因青蒿植株。
实施例4、转基因青蒿表皮腺毛密度和总腺毛数量的统计
使用奥林巴斯公司的BX51型号显微镜，在波长为450nm-480nm的激发光下观察非转基因青蒿和再生转基因青蒿的叶片。取同等大小的青蒿叶片，在不同的5个位置随机取样，统计腺毛密度。测量青蒿叶片总面积，计算得到每个叶片总腺毛数量。
所有附图中，CK代表野生型青蒿植株，OE6\OE22\OE32分别代表不同的AaSPL9过量表达转基因青蒿株系。图1为再生转基因青蒿中AaSPL9蛋白的相对表达量测试结果，图2A为野生型青蒿叶片腺毛的荧光显微镜观察结果，图2B为再生转基因青蒿叶片腺毛的荧光显微镜观察结果，图3为腺毛密度统计结果，图4为每个叶片总腺毛数量统计结果，根据图1-图4可知，在非转基因青蒿的腺毛密度为20个每平方毫米时，再生转基因青蒿的叶片腺毛密度提高到30个每平方毫米以上，而每片叶片总腺毛数量从56947个提高到96809个，在青蒿中过量表达AaSPL9可提高腺毛密度。**，P<0.01(T检验)
实施例5、利用HPLC-ELSD测定转基因青蒿中青蒿素含量
1.HPLC-ELSD条件及系统适用性以及标准溶液的配制
HPLC：采用water alliance 2695系统，色谱柱为C-18反相硅胶柱(SymmetryShield TM C18，5μm，250×4.6mm，Waters)，流动相为甲醇:水，甲醇：水的体积比为70:30，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，灵敏度(AUFS＝1.0)，理论塔板数按青蒿素峰计算不低于2000。
ELSD：采用water alliance 2420系统,蒸发光散射检测器漂移管温度40℃,放大系数(gain)为7，载气压力5bar；
精密称取青蒿素标准品(Sigma公司)2.0mg用1mL甲醇完全溶解，得到2mg/mL青蒿素标准品溶液，保存于-20℃备用。
本发明中流动相为甲醇(methanol):水，比例为70％:30％时，青蒿素的保留时间为5.1min,峰型良好。理论塔板数按青蒿素计算不低于2000。
2.标准曲线的制作
将所述对照品溶液在相应色谱条件下分别进样2μl，4μl，6μl，8μl，10μl记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品含量(X,g)进行回归分析。通过研究，本发明中青蒿素在4-20g范围内呈现良好的log-log线性关系。青蒿素对照品的log-log线性回归方程为：Y＝1.28e+000X+4.71e+000，R＝0.979546。
3.样品的制备和青蒿素含量的测定
在青蒿植株的上，中和下部共取2g新鲜的青蒿叶片，于45℃烘箱中烘至恒重。然后从烘干的枝条上敲下叶和花蕾，磨成粉末。称取约0.1g干粉于2mL Eppendorf管中，加入2mL乙醇，用40W超声波处理30min，5000rpm离心10min，取上清用0.22μm滤膜过滤，即可用于HPLC-ELSD测定青蒿素的含量。
采用HPLC-ELSD测定青蒿素含量，样品进样体积为20μl,根据峰面积代入线形回归方程计算出样品中的青蒿素含量(mg)，再除以样品的青蒿叶干重(g)，从而计算出青蒿植株中青蒿素的含量。
图5为青蒿素含量的分析结果，如图5所示，在非转化普通青蒿(CK)含量为11mg/gDW时，同时期再生转基因青蒿中青蒿素的含量在15mg/g DW以上，最高可达到20mg/g DW，是非转化青蒿含量的1.8倍。统计分析用t-test检验(**，P<0.01)。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一种提高青蒿中青蒿素含量的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 975
<212> DNA
<213> 青蒿(Artemisia carvifolia)
<400> 1
atggaaatgg gtggttcaag tggctcttct gagtcacact ttttaaaaat tggtcaaaaa 60
atttactttg aggatgctaa tggtggtgat gatggcaaac aagaagatgg gttgtcacca 120
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ggtgagcttg ggcttggtca acaaggtgga aggcgttatg actcttctgg cgaccacatt 960
gattggtctc tatga 975
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
atggaaatgg gtggttcaag 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
tcatagagac caatcaatgt gg 22
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