木薯抗病相关基因MeAHL17及其应用
技术领域
本发明涉及生物育种领域，具体涉及一种木薯抗病相关基因MeAHL17及其应用。
背景技术
木薯(Manihot esculenta Crantz)是热带、亚热带地区重要的经济作物和粮食作物，在我国农业和工业生产中占有举足轻重的地位。木薯细菌性枯萎病(cassavabacterial blight，CBB)是当前木薯生产中非常严重的病害之一，可导致木薯产量大幅度减少，严重威胁了农民增收和木薯产业的可持续发展。
因此，如何有效的挖掘木薯细菌性枯萎病抗性候选基因，并对其进行详细的功能研究，以期为木薯细菌性枯萎病改良提供重要基因资源，是当前木薯生物育种领域亟待解决的难题。
木薯细菌性枯萎病是一个重要的农艺性状。由于木薯基因组高杂合度，在很大程度上限制了通过亲本杂交构建分离群体、采用传统图位克隆的方法定位木薯细菌性枯萎病抗病基因；同时木薯科研基础较差、转基因体系也不成熟性，极大的限制了木薯细菌性枯萎病抗病基因的挖掘，使得尚没有可用的基因应用于木薯抗病遗传改良。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种木薯抗病相关基因MeAHL17及其应用，其可为木薯细菌性枯萎病改良提供基因资源和重要参考依据，为基因改良和生物育种提供依据。
为实现上述目的，本发明所提供一种木薯抗病相关基因MeAHL17，所述MeAHL17的CDS核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
上述木薯抗病相关基因MeAHL17编码的MeAHL17蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。
本发明还提供了一种木薯抗病相关基因MeAHL17的启动子，其核苷酸序列如SEQID No.3所示。
本发明还提供了一种上述木薯抗病相关基因MeAHL17或MeAHL17的启动子在防治木薯细菌性枯萎病中的应用。
本发明还提供了一种上述木薯抗病相关基因MeAHL17或MeAHL17的启动子在培育植物新品种中的应用，优选地，所述植物为木薯。
本发明的有益效果：
(1)本发明准确鉴定了MeAHL17在抵抗木薯细菌性枯萎病中的功能，为木薯细菌性枯萎病改良提供了理论依据和关键基因，具有重要的应用价值；
(2)本发明表明MeAHL17启动子区的A/G等位变异与木薯细菌性枯萎病的抗感性有关。通过检测该基因型，有利于木薯细菌性枯萎病抗性的早期预测和快速筛选，加快木薯抗病育种进程。
附图说明
图1为MeAHL17基因定位及功能SNP分析图；
图中，图1A为木薯细菌性枯萎病GWAS分析图，将候选基因定位于第2染色体11.65-11.70Mb区间；
图1B为候选基因转录组比较分析图；
图1C为MeAHL17基因模型，红色虚线表示功能SNP在MeAHL17的启动子区域中的位置；
图1D为双荧光素酶测定比较含A和含G的MeAHL17启动子区域(转录起始位点上游300bp和600bp)的活性图，每个样品包含8个生物学重复样品；
图1E为基于AA和AG的MeAHL17等位基因的木薯细菌性枯萎病抗性比较图；
图2为MeAHL17抗病性功能分析图；
图中，图2A为在Xam侵染0和2天后，带有AG等位基因(Yunnan8和ZM9781)和AA等位基因(ZM95308和RuishiX3)的木薯中MeAHL17表达量差异图，表达量通过qRT-PCR检测，每个样品测定3个生物学重复，数据表示为平均值±标准差，**表示P<0.01；
图2B为在上述四个品种(其中ZM95308和RuishiX3均携带AA等位基因；Yunnan8和ZM9781均携带AG等位基因)中分别用pCAMBIA1304(载体对照，VC1)，pCAMBIA1304::MeAHL17(超表达，OE)，pTRV(载体对照，VC2)或pTRV::MeAHL17(RNA沉默，RNAi)转化的木薯叶片中MeAHL17的表达量差异图；表达量通过qRT-PCR检测，每个样品测定3个生物学重复，数据表示为平均值±标准差，*表示P<0.05，**表示P<0.01；
图2C为在Xam侵染0和6天后，用pCAMBIA1304(载体对照，VC1)，pCAMBIA1304::MeAHL17(超表达，OE)，pTRV(载体对照，VC2)或pTRV::MeAHL17(RNA沉默，RNAi)转化的木薯叶片中的细菌数量图；数据表示为平均值±标准差，*表示P<0.05，**表示P<0.01，每个样品测定4个生物学重复。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例1木薯抗病相关基因MeAHL17筛选
1.基于木薯种质自然群体开展全基因组关联分析，快速锁定与木薯细菌性枯萎病相关的基因区间
木薯种质自然群体来自于农业农村部儋州木薯种质资源圃。任意选择其中299份木薯材料，取新鲜的嫩叶在液氮中冷冻，采用DNeasy Plant Mini试剂盒(Qiagen，北京)提取基因组DNA。每个样品均用5μg基因组DNA构建插入片段大小为500bp的pair-end文库。使用Illumina X-Ten平台对每个样品的150bp配对末端读数进行测序。使用BWA mem v0.7.17程序将每个样品的测序读数比对到木薯SC205参考基因组。使用Samtools v1.9和Picardv1.94对比对结果进行排序和重复标记处理。
删除低质量的reads后，单端和双端比对上的reads均采用GATK toolkit v3.5流程检测SNP。HaplotypeCaller模块用于建立包含SNP和Indel的原始基因型文件，并使用以下参数对其进一步过滤：“QUAL<2.0||QD<2.0||MQ<40.0||FS>60.0||MQRankSum<-12.5||ReadPosRankSum<-8.0-clusterSize 2-clusterWindowSize 5”和“QD<2.0||FS>200.0||ReadPosRankSum<-20.0”。使用SnpEff v3.6c软件对已识别的SNP和Indel进行注释。使用“主等位基因频率(MAF)>0.05和缺失数据<20％”过滤低质量SNP，共获得了1,313,775个高质量SNP。
根据中国木薯细菌性枯萎病的技术规范(NY/T 3005-2016)评估木薯种质的细菌性枯萎病。使用三个生物学重复的平均值来确定抗性水平。随后以木薯细菌性枯萎病为表型性状，开展全基因组关联分析(GWAS)。由ADMIXTURE v1.3.0生成的AQ矩阵被看作是固定效应，使用SPAGeDi v1.3a构建亲属(K)矩阵。相应的P值阈值0.000001被设置为控制全基因组I型错误率。
结果表明：第2染色体11.65-11.70Mb区间与木薯细菌性枯萎病显著关联(图1A)。
2.基于转录组比较分析，进一步筛选候选基因
转录组数据来自于NCBI-SRA数据库，登录号为SRP045199。去除接头序列和低质量reads后，通过HISAT2 v2.0.4将干净读数比对到SC205参考基因组。基因表达水平由StringTie v1.3.4d使用默认参数计算。基因表达水平采用FPKM进行归一化处理。使用DEseq2软件鉴定差异表达基因。差异表达基因被定义为FDR<0.01且倍数变化>2。
基于木薯基因组注释，在第2染色体11.65-11.70Mb区间共有6个候选基因。有趣地是，在木薯细菌性枯萎病处理条件下，仅Sc02g014000的表达受病菌显著诱导(图1B)。
因此，推断Sc02g014000是调控木薯细菌性枯萎病的重要候选基因，该基因编码一个含有AT-hook结构域的核定位蛋白，根据基因同源性将其命名为MeAHL17，MeAHL17的CDS核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；MeAHL17的启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
实施例2
1.基于基因组比较分析，挖掘与基因表达显著关联的SNP位点
基于基因组重测序数据，在MeAHL17启动子区域(起始密码子上游-53bp处，即MeAHL17的启动子的核苷酸序列的948位点)发现了一个SNP变异(A/G，图1C)。
为了探索A/G等位基因变异对MeAHL17启动子活性的影响，我们在木薯原生质体中进行了双重荧光素酶测定。克隆带有A或G的MeAHL17启动子序列(-1至-300bp和-1至-600bp)，并将其插入pGreenII0800-LUC载体，并转化木薯原生质体。使用双重荧光素酶报告基因检测试剂盒(RG027，Beyotime，上海)测定相对荧光素酶活性。结果显示：含G的MeAHL17启动子比含A的MeAHL17启动子具有更高的活性(图1D)，表明A/G等位变异影响MeAHL17的表达。
2.大量木薯种质分析发现A/G变异与木薯细菌性枯萎病抗性显著关联
通过筛选大量木薯种质，我们发现MeAHL17携带AA等位基因的种质比携带AG等位基因的种质对木薯细菌性枯萎病更加敏感(图1E)。由此推论，启动子区的A/G等位变异调控MeAHL17的表达，进而影响木薯细菌性枯萎病的抗性。
实施例3超表达和RNAi功能验证表明MeAHL17在抵抗木薯细菌性枯萎病中发挥重要作用
为了检测MeAHL17响应细菌性枯萎病(Xam)的表达谱，我们在Xam侵染0和2天后收集了4个代表性木薯品种(其中ZM95308和RuishiX3携带AA等位基因；Yunnan8和ZM9781携带AG等位基因)的叶片。使用cDNA合成试剂盒(K1622，USA)分离总RNA并反转录。然后，以MeEF1a为内参，使用2-ΔΔCt方法通过定量实时PCR(qRT-PCR)鉴定MeAHL17的相对表达水平。
结果显示：与AG等位基因相比，携带AA等位基因的MeAHL17在Xam处理后其表达量诱导较少(图2A)。
随后，在上述4个木薯品种中同时开展超表达和RNAi功能验证。为了过表达MeAHL17，先扩增MeAHL17的编码序列并将其插入pCAMBIA1304载体，随后将带有重组载体或pCAMBIA1304(对照)的农杆菌菌株(GV3101)注射到木薯叶片中。为了沉默MeAHL17，扩增MeAHL17特异性区域并将其克隆到pTRV2载体中，随后将带有重组载体或pTRV2(对照)的农杆菌菌株(GV3101)与pTRV1一起注射到木薯叶片中。待pCAMBIA1304::MeAHL17和pCAMBIA1304转化的植物培养两天，或者pTRV::MeAHL17和pTRV转化的植物培养两周后，将Xam接种到木薯叶片中，6d后检查细菌数量和基因表达水平。
结果显示：Xam处理6天后，MeAHL17过表达后不同品种中细菌种群数量比对照显著减小，而MeAHL17沉默的品种(Yunnan8和ZM9781)中细菌种群数量比对照显著增加(图2B-C)。这些结果表明，MeAHL17在抵抗木薯细菌性枯萎病中发挥重要作用，且其启动子区的A/G等位变异与细菌性枯萎病的抗感性有关。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所
中国热带农业科学院三亚研究院
<120> 木薯抗病相关基因MeAHL17及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 939
<212> DNA
<213> 木薯(Manihot esculenta)
<400> 1
atgaaaggtg aatatgtaga ggcacaccat ccaccaaagc atgaaaacgt cacccctatg 60
aacatgttct ctaaacttca tccccatccc catcaccagc tccctttctc tcagcacttc 120
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<211> 312
<212> PRT
<213> 木薯(Manihot esculenta)
<400> 2
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115 120 125
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Phe Cys Arg Arg Lys Asn Ile Gly Ile Cys Val Leu Thr Gly Ser Gly
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<210> 3
<211> 1000
<212> DNA
<213> 木薯(Manihot esculenta)
<400> 3
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