本发明属于生物与新医药技术领域,公开了一种对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法,在饲养层培养的多能干细胞用胶原酶消化后,用无饲养层培养基重旋消化下来的细胞,转移到提前用基质胶包被的培养皿中,放入培养箱中;当细胞密度到培养皿面积的80%-90%,用ACCTUSE酶消化后,按照(1:5)-(1:10)的比例传到提前包被的培养皿中。本发明通过开发新的的培养条件,可以实现食蟹猴多能干细胞在无饲养层条件下的培养,无需饲养层的制备节省大量的人力物力,培养成分明确,可以长期保持食蟹猴多能干细胞的多能性。本发明的无饲养层培养食蟹猴干细胞的方法,无批次检影响,有助于提高实验的准确性,培养体系可被临床借鉴。