一种对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法
技术领域
本发明属于生物与新医药
技术领域
，尤其涉及一种对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法。背景技术
目前，培养食蟹猴的多能干细胞培养都需要饲养层提供部分营养，饲养层由12.5天的小鼠胚胎制成，需要将CF-1品系的小鼠交配后在第12.5天取出胚胎，将内脏、四肢和头部去除后，将剩余的组织消化成单细胞培养，待细胞增殖，即可当作饲养层。因此饲养层的制备需要花费大量的人力物力，并且饲养层由于含有动物源成分，培养基成分不确定，容易产生性能不稳定的情况，造成前后批次结果不一致，培养基的质量不稳定和不规范，直接影响研究结果的准确性。在人的多能干细胞和小鼠的多能干细胞培养中，科学家为了解决饲养层带来的影响，开发了新的培养体系，可以满足在不需要饲养层的情况下培养人和小鼠的多能干细胞。但是截止目前为止，针对食蟹猴无饲养层干细胞培养的培养体系还没有较好的开发，因此，亟需一种新的对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有饲养层的制备需要花费大量的人力物力，并且饲养层由于含有动物源成分，培养基成分不确定，容易产生性能不稳定的情况，造成前后批次结果不一致，培养基的质量不稳定和不规范，直接影响研究结果的准确性。
解决以上问题及缺陷的难度为：摸索一种新的培养方法需要较多的人力和物力，并且在专业知识上也需要有一定的储备。需要在培养体系的成份和浓度中进行较多的探索，因此需要对培养体系成份大量的筛查。
解决以上问题及缺陷的意义为：如果能解决食蟹猴干细胞无饲养层培养的难题，将有助于非人灵长类干细胞的开发，比如类器官的培养。也能为人多能干细胞的培养体系提供新的参考。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法。
本发明是这样实现的，一种对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法，所述对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法包括：
将在饲养层培养的多能干细胞用胶原酶消化；
用无饲养层培养基重旋消化下来的细胞，转移到提前用基质胶包被的培养皿中，放入培养箱中；
用ACCTUSE酶消化后，传到提前包被的培养皿中；当细胞密度到培养皿面积的80％-90％，用ACCTUSE酶消化后，传到提前包被的培养皿中；
细胞用ACCTUSE酶消化后，按照1：5-1：10的比例传到提前包被的培养皿中。
进一步，所述对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法包括以下步骤：
步骤一，将在饲养层培养的多能干细胞用胶原酶消化；首先将10mg/ml的胶原酶溶液吸取50ul进入提前准备好的1ml干细胞培养基中，混匀后弃掉培养皿中原有的培养基，加入含有胶原酶的培养基。放入培养箱，等待10-15min。等待发现克隆边缘卷起，弃掉培养皿里的培养基，用新的培养基将克隆脱离培养皿。将混有克隆的培养基转移到15ml离心管中，1000rpm，5min离心。
步骤二，取出步骤一中离心的离心管，弃上清，用无饲养层培养基重旋消化下来的细胞，转移到提前用基质胶包被的培养皿中，添加促进细胞贴壁因子 CloneR(Stemcell)后放入培养箱中；
步骤三，当细胞密度到培养皿面积的80％-90％，弃掉原来的培养基，加入ACCTUSE(Gibco)放入培养箱中等待5-10min，待细胞消化成单细胞后，用新鲜培养基重旋培养皿中的细胞，然后将含有消化的细胞转移到提前准备好干净的 15ml离心管中，1000rpm，5min离心后，去离心管中的上清，用新鲜培养基重旋底部的细胞，添加添加促进细胞贴壁因子CloneR(Stemcell)后，传到提前包被的培养皿中。
进一步，步骤三中，所述细胞用ACCTUSE酶消化后，按照(1：5)-(1： 10)的比例传到提前包被的培养皿中。
进一步，所述无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含：TeSRE8(Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX(L-谷氨酰胺的替代品)(Gibco,100X)0.5ml,Recombinant HumanNodal Protein(重组人的Nodal 蛋白)(R&Dsystem)5ug,chemically defined lipid concentrate(化学成分确定的脂质浓缩物)(Gibco)0.5ml,Glutathione(谷胱甘肽)(Sigma)1.94mg/L,LIF(白血病抑制因子)(peprotech)0.4ul/ml-3ul/ml。
进一步，所述无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含： TeSRE8(Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX (Gibco,100X)0.5ml,Recombinant HumanNodal Protein(R&D system)5ug, chemically defined lipidconcentrate(Gibco)0.5ml,Glutathione(Sigma)1.94mg/L， bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)(proteintech)4ng/ml-20ng/ml。
进一步，所述无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含： TeSRE8(Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX (Gibco,100X)0.5ml,N2supplement(N-2添加剂基于Bottenstein’s N-1配方，是一种化学成分确定的无血清添加剂)(Thermo Fisher Scientific)250ul,B27 supplement(B-27补剂是一种优化的无血清补剂)(Thermo Fisher Scientific) 500ul。
进一步，所述无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含： TeSRE8(Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX (Gibco,100X)0.5ml,N2supplement(Thermo Fisher Scientific)250ul,B27 supplement(Thermo FisherScientific)500ul,bFGF(proteintech)4ng/ml-20ng/ml, LIF(peprotech)0.4ul/ml-3ul/ml。
进一步，所述无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含：TeSRE8(Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX(Gibco,100X) 0.5ml,Recombinant HumanNodal Protein(R&D system)5ug,chemically defined lipidconcentrate(Gibco)0.5ml,Glutathione(Sigma)1.94mg/L。
进一步，所述无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含：TeSRE8(Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX(Gibco,100X) 0.5ml,Recombinant HumanNodal Protein(R&D system)5ug,chemically defined lipidconcentrate(Gibco)0.5ml,Glutathione(Sigma)1.94mg/L,Thiazovivin (Thiazovivin抑制剂)(Selleck)2.4uM。
进一步，所述无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含：TeSRE8(Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX(Gibco,100X) 0.5ml。
进一步，所述无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含：TeSRE8(Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX(Gibco,100X) 0.5ml，KOSR(KnockOut血清替代物)(Thermo Fisher Scientific)500ul。
进一步，所述无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含：TeSRE8(Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX(Gibco,100X) 0.5ml,N2supplement(Thermo Fisher Scientific)250ul,B27 supplement(Thermo FisherScientific)500ul，LIF(peprotech)10ng/ul。
进一步，所述无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含：TeSRE8(Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX(Gibco,100X) 0.5ml,N2supplement(Thermo Fisher Scientific)250ul,B27 supplement(Thermo FisherScientific)500ul，IWR(IWR-1-endo是一种Wnt通路抑制剂)(selleck)。
进一步，所述无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含TeSRE8(Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX(Gibco,100X) 0.5ml,Recombinant HumanNodal Protein(R&D system)5ug,chemically defined lipidconcentrate(Gibco)0.5ml,Glutathione(Sigma)1.94mg/L,IWR-1(IWR-1-endo 是一种Wnt通路抑制剂)(selleck)。
进一步，所述无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含：TeSRE8(Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX(Gibco,100X) 0.5ml,N2supplement(Thermo Fisher Scientific)250ul,B27 supplement(Thermo FisherScientific)500ul，ActivinA(激活素A)(peprotech)10ng/ml。
进一步，所述无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含：TeSRE8(Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX(Gibco,100X) 0.5ml，Recombinant HumanNodal Protein(R&D system)5ug,chemically defined lipidconcentrate(Gibco)0.5ml,Glutathione(Sigma)1.94mg/L,Activin A(激活素 A)(peprotech)10ng/ml。
进一步，所述无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含：TeSRE8(Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX(Gibco,100X) 0.5ml,N2supplement(Thermo Fisher Scientific)250ul,B27 supplement(Thermo FisherScientific)500ul，ActivinA(激活素A)(peprotech)10ng/ml，IWR-1。
进一步，所述无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含：TeSRE8(Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX(Gibco,100X) 0.5ml，Recombinant HumanNodal Protein(R&D system)5ug,chemically defined lipidconcentrate(Gibco)0.5ml,Glutathione(Sigma)1.94mg/L,Activin A(激活素 A)(peprotech)10ng/ml，IWR-1。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法，通过开发新的的培养条件，可以解决食蟹猴多能干细胞在无饲养层的条件下培养，并且能够长期保持干细胞具有多能性，具有多能性的干细胞会表达一些多能性蛋白，通过免疫荧光染色如图三，即可证明无饲养层培养的食蟹猴干细胞具有多能性。本发明开发出一种新的食蟹猴多能干细胞无饲养层培养体系，可以长期保持食蟹猴多能干细胞的多能性，不需要饲养层的制备节省了大量的人力物力，并且培养成分明确，可以长期保持干细胞的多能性，本方法通过长期培养，超过6个月细胞依旧能保持正常的核型如图4，并且具有往三胚层分化的能力如图5。这种无饲养层培养食蟹猴干细胞的方法，无批次检影响，有助于提高实验的准确性，培养体系可以被临床借鉴。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法流程图。
图2是本发明实施例提供的食蟹猴多能干细胞无饲养层培养的明场图片。
图3是本发明实施例提供的食蟹猴多能干细胞无饲养层培养的免疫荧光染色结果示意图。
图4是本发明实施例提供的食蟹猴多能干细胞无饲养层培养的核型检测正常结果示意图。
图5是本发明实施例提供的食蟹猴多能干细胞无饲养层培养的三胚层分化示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法包括以下步骤：
S101，将在饲养层培养的多能干细胞用胶原酶消化；
S102，用无饲养层培养基重旋消化下来的细胞，转移到提前用基质胶包被的培养皿中，放入培养箱中；
S103，当细胞密度到培养皿面积的80％-90％，用ACCTUSE酶消化后，按照(1：5)-(1：10)的比例传到提前包被的培养皿中。
本发明提供的对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法业内的普通技术人员还可以采用其他的步骤实施，图1的本发明提供的对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法仅仅是一个具体实施例而已。
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。
本发明的方法通过开发新的的培养条件，可以解决食蟹猴多能干细胞在无饲养层的条件下培养，并且能够长期保持干细胞具有多能性。
本发明实施例提供的对食蟹猴干细胞的无饲养层培养方法包括：首先在饲养层培养的多能干细胞用胶原酶消化后，用无饲养层培养基重旋消化下来的细胞，转移到提前用基质胶包被的培养皿中，放入培养箱中。当细胞密度到培养皿面积的80％-90％，用ACCTUSE酶消化后，按照(1：5)-(1：10)的比例传到提前包被的培养皿中。
本发明实施例提供的食蟹猴多能干细胞无饲养层培养的明场图片如图2所示，本发明实施例提供的食蟹猴多能干细胞无饲养层培养的免疫荧光染色结果示意图如图3所示。
本发明的无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含：TeSRE8 (Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX(L-谷氨酰胺的替代品)(Gibco,100X)0.5ml,Recombinant HumanNodal Protein(重组人的Nodal 蛋白)(R&D system)5ug,chemically defined lipid concentrate(化学成分确定的脂质浓缩物)(Gibco)0.5ml,Glutathione(谷胱甘肽)(Sigma)1.94mg/L,LIF(白血病抑制因子)(peprotech)0.4ul/ml-3ul/ml。
本发明的无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含： TeSRE8(Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX (Gibco,100X)0.5ml,RecombinantHumanNodal Protein(R&D system)5ug, chemically defined lipid concentrate(Gibco)0.5ml,Glutathione(Sigma)1.94mg/L， bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)(proteintech)4ng/ml-20ng/ml。
本发明的无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含： TeSRE8(Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX (Gibco,100X)0.5ml,N2supplement(N-2添加剂基于Bottenstein’s N-1配方，是一种化学成分确定的无血清添加剂)(ThermoFisher Scientific)250ul,B27 supplement(B-27补剂是一种优化的无血清补剂)(ThermoFisher Scientific) 500ul。
本发明的无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含： TeSRE8(Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX (Gibco,100X)0.5ml,N2supplement(Thermo Fisher Scientific)250ul,B27 supplement(Thermo Fisher Scientific)500ul,bFGF(proteintech)4ng/ml-20ng/ml, LIF(peprotech)0.4ul/ml-3ul/ml。
本发明的无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含：TeSRE8 (Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX(Gibco,100X) 0.5ml,RecombinantHumanNodal Protein(R&D system)5ug,chemically defined lipid concentrate(Gibco)0.5ml,Glutathione(Sigma)1.94mg/L。
本发明的无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含：TeSRE8 (Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX(Gibco,100X) 0.5ml,RecombinantHumanNodal Protein(R&D system)5ug,chemically defined lipid concentrate(Gibco)0.5ml,Glutathione(Sigma)1.94mg/L,Thiazovivin (Thiazovivin抑制剂)(Selleck)2.4uM。
本发明的无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含：TeSRE8 (Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX(Gibco,100X) 0.5ml。
本发明的无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含：TeSRE8 (Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX(Gibco,100X) 0.5ml，KOSR(KnockOut血清替代物)(Thermo Fisher Scientific)500ul。
本发明的无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含：TeSRE8 (Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX(Gibco,100X) 0.5ml,N2supplement(Thermo Fisher Scientific)250ul,B27 supplement(Thermo Fisher Scientific)500ul，LIF(peprotech)10ng/ul。
本发明的无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含：TeSRE8 (Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX(Gibco,100X) 0.5ml,N2supplement(Thermo Fisher Scientific)250ul,B27 supplement(Thermo Fisher Scientific)500ul，IWR(IWR-1-endo是一种Wnt通路抑制剂)(selleck)。
本发明的无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含TeSRE8 (Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX(Gibco,100X) 0.5ml,RecombinantHumanNodal Protein(R&D system)5ug,chemically defined lipid concentrate(Gibco)0.5ml,Glutathione(Sigma)1.94mg/L,IWR-1(IWR-1-endo 是一种Wnt通路抑制剂)(selleck)。
本发明的无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含：TeSRE8 (Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX(Gibco,100X) 0.5ml,N2supplement(Thermo Fisher Scientific)250ul,B27 supplement(Thermo Fisher Scientific)500ul，ActivinA(激活素A)(peprotech)10ng/ml。
本发明的无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含：TeSRE8 (Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX(Gibco,100X) 0.5ml，RecombinantHumanNodal Protein(R&D system)5ug,chemically defined lipid concentrate(Gibco)0.5ml,Glutathione(Sigma)1.94mg/L,Activin A(激活素 A)(peprotech)10ng/ml。
本发明的无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含：TeSRE8 (Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX(Gibco,100X) 0.5ml,N2supplement(Thermo Fisher Scientific)250ul,B27 supplement(Thermo Fisher Scientific)500ul，ActivinA(激活素A)(peprotech)10ng/ml，IWR-1。
本发明的无饲养层培养方法的无饲养层培养体系50ml包含：TeSRE8 (Stemcell)47ml，TeSRE8 supplement(Stemcell)2ml，GlutaMAX(Gibco,100X) 0.5ml，RecombinantHumanNodal Protein(R&D system)5ug,chemically defined lipid concentrate(Gibco)0.5ml,Glutathione(Sigma)1.94mg/L,Activin A(激活素 A)(peprotech)10ng/ml，IWR-1。
本发明开发了一种食蟹猴干细胞无饲养层培养的方法，可以长期保持食蟹猴多能干细胞的多能性。不需要饲养层的制备节省了大量的人力物力，并且培养成分明确，可以长期保持干细胞的多能性。这种无饲养层培养食蟹猴干细胞的方法，无批次检影响，有助于提高实验的准确性，培养体系可以被临床借鉴。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
