一种改善卵母细胞体外和体内成熟质量的方法与应用
技术领域
本发明属于生物医药
技术领域
，涉及一种改善卵母细胞体外和体内成熟质量的方法与应用。背景技术
褪黑素(melatonin，MT)的化学名称为N-乙酰基-5-甲氧基色胺，存在于哺乳动物包括人类等高等动物体内，最早发现于松果体。此外，很多器官、组织和细胞(卵巢、睾丸、皮肤、红细胞等)都可以合成及分泌少量MT(可参见：Rodr í guez C，Puente-Moncada N，Reiter RJ，et al.Regulation of cancer cell glucose metabolism is determinantfor cancer cell fate after melatonin administration.J Cell Physiol.2021；236(1)：27-40.)。褪黑素不仅本身具有直接清除自由基的功能，同时还能调控抗氧化酶的表达，对维持机体氧化还原平衡和提高雌性动物繁殖力发挥重要作用。近年来，许多研究表明在培养液中添加MT可以减少ROS、促进卵子成熟、提高卵母细胞质量，包括人、小鼠、猪、牛等(可参见：Rodr í guez-Varela C，Labarta E.Clinical Appl ication of Antioxidantsto Improve Human Oocyte Mitochondrial Function：A Review.Antioxidants(Basel).2020；9(12)：1197；Zhang M，Lu Y，Chen Y，Zhang Y，Xiong B.Insufficiency ofmelatonin in follicular fluid is a reversible cause for advanced maternalage-related aneuploidy in oocytes.Redox Biol.2020；28：101327；Niu YJ，Zhou W，NieZW，Shin KT，Cui XS.Melatonin enhances mitochondrial biogenesis and protectsagainst rotenone-induced mitochondrial deficiency in early porcine embryos.JPineal Res.2020；68(2)：e12627；Guti éJC，Lucas-Hahn A，Hadeler KG，AldagP，Niemann H.Melatonin enhances in vitro developmental competence of cumulus-oocyte complexes collected by ovum pick-up in prepubertal and adult dairycattle.Theriogenology.2020；161：285-293.)。此外，MT还可以改善环境污染物引起的卵母细胞成熟损伤及质量(可参见：Bahelka I，Stupka R，J，M.The impactof bisphenols on reproductive system and on offspring in pigs-A review 2011-2020.Chemosphere.2021；263：128203.)。
近年来，随着护肤品使用量的递增，造成氧苯酮(oxybenzone，OBZ)的过度使用，现已成为一种新型的环境污染物，它海洋、湖泊甚至日常饮用水等地方被检测到(可参见：Tsui MM，Leung HW，Wai TC，et al.Occurrence，distribution and ecological riskassessment of multiple classes of UV filters in surface waters from differentcountries.Water Res.2014；67：55-65.)。氧苯酮还可以通过皮肤直接吸收到人体内，已在人类血液、尿液、精液、羊水、胎盘及母乳中均被成功检测(可参见：US Food and DrugAdministration(FDA).Sunscreen drug products for over-the-counter human use：proposed rule.Fed Regist.2019；84：6204-6275.https：//www.govinfo.gov/content/pkg/FR-2019-02-26/pdf/2019-03019.pdf)。2014年，美国流行病学杂志报道，氧苯酮与人类生育力下降密切相关(Buck Louis GM，Kannan K，Sapra KJ，Maisog J，SundaramR.Urinary concentrations of benzophenone-type ultraviolet radiation filtersand couples′fecundity.Am J Epidemiol.2014；180(12)：1168-75.)。2019年，Matta等发现人类血浆中氧苯酮的浓度在0.74μM至0.92μM之间，然而美国食品药品监督管理局(FDA)的建议量仅仅是不超过2.2nM(可参见：Matta MK，Zusterzeel R，Pilli NR，et al.Effectof Sunscreen Application Under Maximal Use Conditions on Plasma Concentrationof Sunscreen Active Ingredients：A Randomized Clinical Trial.JAMA.2019；321(21)：2082-2091.)。近期的研究证明，氧苯酮的广泛应用对胎儿和婴儿发育中的脑细胞特别是神经元发生细胞产生病理效应，例如氧苯酮通过干扰神经嵴细胞的迁移诱发Hirschsprung’disease(可参见：Wnuk A，Rzemieniec J，LasoW，Krzeptowski W，KajtaM.Benzophenone-3 Impairs Autophagy，Alters Epigenetic Status，and DisruptsRetinoid X Receptor Signaling in Apoptotic Neuronal Cells.Mol Neurobiol.2018；55(6)：5059-5074.)。2019年，美国FDA发布的指导性规则中报道，女性尿液中高水平的氧苯酮与子代的初生重及头围有重要关联(可参见：US Food and Drug Administration(FDA).Sunscreen drug products for over-the-counter human use：proposed rule.FedRegist.2019；84：6204-6275.https：//www.govinfo.gov/content/pkg/FR-2019-02-26/pdf/2019-03019.pdf)。此外，氧苯酮还对精子、前列腺和子宫等器官发育有毒性作用(可参见：Frederiksen H，Krause M，N，Rehfeld A，Skakkebaek NE，Andersson AM.UVfilters in matched seminal fluid-，urine-，and serum samples from young men.JExpo Sci Environ Epidemiol.2020；10.1038/s41370-020-0209-3.)。综上，虽然已经发表了一些氧苯酮与生殖毒理的相关研究，但对氧苯酮暴露是否影响哺乳动物卵母细胞减数分裂成熟以及卵子质量的研究还未见报道。
目前现有技术中并没有对氧苯酮与卵母细胞减数分裂成熟及其质量的相关性研究，如能够研发出一种缓解氧苯酮致卵子成熟障碍并提高卵母细胞质量的方法，将对氧苯酮的安全使用量及其引起的女性不孕不育的治疗具有重要的理论指导意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种改善卵母细胞体外体内成熟质量的药物及其应用方法，该药物和应用方法能够对现有的由环境污染、肥胖、衰老等原因引起的卵子成熟障碍和卵母细胞质量下降的问题进行良好的改善。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种改善卵母细胞体外和体内成熟质量的方法，该方法包括对卵母细胞使用药物A，所述药物A包括褪黑素；
其中，在体外改善卵母细胞成熟质量时，所述褪黑素的体外添加浓度为10-5-10- 9M；在体内改善卵母细胞成熟质量时，褪黑素的灌胃剂量为13-17mg/kg/天，灌胃时间是26-30天。
作为本发明的一种优选技术方案，所述褪黑素的体外添加浓度为10-7M。
作为本发明的一种优选技术方案，所述褪黑素的灌胃剂量为15mg/kg/天，灌胃时间是28天。
如上所述一种改善卵母细胞体外和体内成熟质量的方法在卵子成熟障碍和卵母细胞质量下降领域的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明通过直接在卵母细胞体外成熟培养液中添加褪黑素和通过对小鼠灌胃的方式，证明褪黑素可以缓解氧苯酮引起的小鼠卵母细胞体外和体内成熟率下降的问题，改善卵母细胞质量，并有利于缓解氧苯酮引起的卵母细胞纺锤体形态异常的问题，改善线粒体功能，减少氧化应激对卵母细胞的损伤。
(2)本发明提供了改善氧苯酮影响雌性卵母细胞体内和体外成熟及其质量的方法，为提高女性生殖力提供有效的方法。
附图说明
为了便于本领域技术人员理解，下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1是氧苯酮对小鼠卵母细胞体外成熟的影响示意图；
图2是加入褪黑素和氧苯酮对小鼠卵母细胞体外成熟率的影响示意图；
图3是加入褪黑素和氧苯酮对小鼠胚胎体外发育的影响示意图；
图4是加入褪黑素和氧苯酮对小鼠卵母细胞纺锤体形态及α-tubulin表达水平的影响示意图；
图5是加入褪黑素和氧苯酮对小鼠卵母细胞氧化应激、线粒体质量及早期凋亡的影响示意图；
图6是灌胃褪黑素和氧苯酮对小鼠卵母细胞体内成熟及囊胚率的影响示意图；
图7是灌胃褪黑素和氧苯酮对小鼠体内成熟卵母细胞氧化应激、早期凋亡以及线粒体质量的影响。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
褪黑素缓解氧苯酮诱导卵母细胞体外成熟质量下降的表现：
步骤S1：准备实验动物及饲养管理；
实施例中使用的动物为ICR雌鼠和雄鼠，雌鼠鼠龄为6-10周龄，雄鼠鼠龄为10-14周龄，购自广东省医学实验动物中心，饲养于温度为20-25℃，光照为12h明暗间隔的控温控光环境中，实验小鼠可以自由采食和饮水，经过1周的适应后进行实验，操作均符合实验动物福利的相关规定；
步骤S2：准备实验用的主要试剂及仪器；
主要试剂和仪器包括：孕马血清促性腺激素PMSG、人体绒膜促性腺激素hCG，M2培养液、M16培养液、KSOM培养液、石蜡油、α-tubulin抗体、褪黑素、氧苯酮、活性氧试剂盒、GSH试剂盒、Annexin-V-FITC细胞早期凋亡试剂盒、MitoTracker Deep Red线粒体红色荧光探针、MitoProbeTM JC-1线粒体膜电位检测试剂盒、倒置荧光显微镜、共聚焦显微镜；
其中：人体绒膜促性腺激素hCG购自宁波第二激素厂，褪黑素购自美国Sigma公司，氧苯酮购自美国Selleck公司，MitoProbeTM JC-1线粒体膜电位检测试剂盒购自美国ThermoFisher Scientific公司，倒置荧光显微镜购自日本Nikon，Ti-U，共聚焦显微镜购自日本Nikon，A1R；
步骤S3：获取GV期卵母细胞和对卵母细胞进行体外培养；
对ICR雌鼠腹腔注射10IU的PMSG，在46-48h后脱颈处死，打开腹腔摘取两侧卵巢，在体式显微镜下用刀片将取出的卵巢剁碎并用M2培养液冲开，用口吸管捡取形态正常的GV期卵母细胞，用M2培养液清洗去除杂质后，转移至含有褪黑素和氧苯酮的M16培养液滴中，并放入CO2培养箱进行体外成熟培养，以第一极体排出情况判断成熟率；
步骤S4：获取MII期卵母细胞；
对CR雌鼠腹腔注射10IU的PMSG，48h后腹腔注射10IU的hCG，13-16h后脱颈处死，打开腹腔，暴露并剪下输卵管，将输卵管置于M2培养液中，在体式显微镜下找到输卵管彭大部并刺破，释放卵丘-卵母细胞复合体，用透明质酸酶脱去卵丘层颗粒细胞，将脱除卵丘的MII期卵母细胞移至M2培养液中，并以第一极体排出情况判断成熟率；
步骤S5：配置M16卵母细胞成熟培养液，并统计卵母细胞成熟率即第一极体排出率；
提前制备含有2nM，50nM，250nM，500nM，1000nM氧苯酮的M16卵母细胞成熟培养液。在60mm培养皿中制作30μL的卵母细胞培养液滴，CO2培养箱中预平衡6小时；在每个液滴中加入13-18枚采集得到的GV期卵母细胞，置于CO2培养箱中进行体外成熟培养；培养13h后，统计卵母细胞成熟率即第一极体排出率。
图1A为不同浓度氧苯酮处理后卵母细胞形态，比例尺＝100μm；图1B为不同浓度氧苯酮对小鼠卵母细胞第一极体排出率的影响(对照组：82.45±8.54％，n＝367；2nM组：76.84±12.84％，n＝360；50nM组：71.11±11.87％，n＝346，；250nM组：69.41±8.59％，n＝314；500nM，55.87±10.19％，n＝351；1000nM组：54.21±12.68％，n＝343)。Control代表“对照组”；OBZ代表“氧苯酮组”。a-d代表差异显著(P＜0.05)，数据以五次重复实验的Mean±SEM表示。
结果如图1所示：添加50nM，250nM，500nM，1000nM氧苯酮均能够显著降低卵母细胞成熟率。结合2019年JAMA论文数据，我们选择500nM的氧苯酮作为之后实验处理浓度。
步骤S6：对受精卵进行体外培养；
对ICR雌鼠腹腔注射10IU的PMSG，经过48h后腹腔注射10IU的hCG，与ICR雄鼠合笼，次日清晨检查阴道栓，见栓的雌鼠被脱颈处死，取其输卵管于M2培养液中，在显微镜下划破输卵管中庞大的壶腹部，可以看到受精卵游离出来，将卵丘细胞用透明质酸酶脱掉，清洗后将受精卵移入平衡过的50μL的KSOM培养液滴中，放入CO2培养箱培养，以囊胚形成情况判断囊胚率；
步骤S7：提前制备含有500nM氧苯酮和10-5mol/L、10-7mol/L、10-9mol/L褪黑素的M16培养液。采集GV期卵母细胞，经体外成熟培养后，统计卵母细胞成熟率。
图2A为氧苯酮和褪黑素处理后小鼠卵母细胞形态，比例尺＝100μm；图2B为不同浓度褪黑素对500nM氧苯酮暴露的小鼠卵母细胞第一极体排出率的影响(对照组：80.72±10.76％，n＝262；500nM氧苯酮组：51.62±11.59％，n＝245；500nM氧苯酮+10-9mol/L褪黑素组：69.09±7.01％，n＝220；500nM氧苯酮+10-7mol/L褪黑素组：76.33±8.34％，n＝241；500nM氧苯酮+10-5mol/L褪黑素组：57.40±13.95％，n＝254)。Control代表“对照组”；OBZ代表“氧苯酮组”；OBZ+MT代表“氧苯酮+褪黑素组”。a-c代表差异显著(P＜0.05)，数据以五次重复实验的Mean±SEM表示。
结果如图2所示：添加褪黑素能够显著缓解氧苯酮对卵母细胞第一极体排出的影响。其中添加10-7mol/L、10-9mol/L褪黑素均能够缓解氧苯酮致卵母细胞体外成熟率下降的影响。
步骤S8：提前制备含有500nM氧苯酮和10-7mol/L褪黑素的KSOM胚胎培养液。在60mm培养皿中制作30μL的胚胎培养液滴，CO2培养箱中预平衡10小时；在每个液滴中加入13-18枚采集得到的受精卵，置于CO2培养箱中进行体外培养；培养72h后，统计囊胚率。
图3A为氧苯酮和褪黑素处理后小鼠囊胚形态，比例尺＝100μm；图3B为褪黑素对氧苯酮处理胚胎的体外囊胚形成率的影响(对照组：84.52±7.08％，n＝184；氧苯酮组：41.25±7.04％，n＝191；氧苯酮+褪黑素组：76.12±8.61％，n＝217)。Control代表“对照组”；OBZ代表“氧苯酮组”；OBZ+MT代表“氧苯酮+褪黑素组”。a-c代表差异显著(P＜0.05)，数据以五次重复实验的Mean±SEM表示。
结果如图3所示：添加10-7mol/L褪黑素能够显著缓解氧苯酮对小鼠囊胚形成率的影响。
步骤S9：对纺锤体形态和α-tubulin水平进行检测；
将收集的卵母细胞用酸性台式液溶解掉透明带后，转移到4％多聚甲醛固定30min中，1％Triton渗透20min，2％BSA封闭2h，孵育一抗(α-tubulin按1∶300稀释)，将过夜后的卵母细胞清洗后，孵育二抗，清洗，DAPI染色，置于共聚焦显微镜下观察拍照，并用ImageJ软件分析卵母细胞的α-tubulin平均荧光强度；
步骤S10：对ROS与GSH含量进行检测；
按照试剂盒说明书，将MII期卵母细胞移入含100μmol/L DCHFDA或20μmol/LThiolTrackerTM Violet染色液的M2培养液中，37℃，5％CO2培养箱内避光孵育30min，清洗后置于倒置荧光显微镜下观察拍照，并用ImageJ软件分析卵母细胞的ROS和GSH平均荧光强度；
步骤S11：对卵母细胞线粒体分布与膜电位情况进行检测；
按照试剂盒说明书，将MII期卵母细胞移入含200nmol/L MitoTracker probe或4μmol/L JC-1的M2培养液中，37℃，5％CO2培养箱内避光孵育30min，清洗后，压片并转移至倒置荧光显微镜下观察拍照，用ImageJ软件分析卵母细胞的JC-1 red和JC-1 green平均荧光强度；
步骤S12：对卵母细胞早期凋亡情况进行检测；
按照试剂盒说明书，在避光条件下，用含10μL Annexin-V-FITC与490μL annexin-binding buffer在室温下对卵母细胞染色15min，M2培养液清洗后，压片，在倒置荧光显微镜下观察拍照，并统计卵母细胞早期凋亡率。
图4A为氧苯酮和褪黑素处理后MI期卵母细胞α-tubulin染色图；图4B为卵母细胞纺锤体形态异常率；图4C为卵母细胞α-tubulin荧光强度。Control代表“对照组”；OBZ代表“氧苯酮组”；OBZ+MT代表“氧苯酮+褪黑素组”。a，b代表差异显著(P＜0.05)，数据以3次重复实验的Mean±SEM表示。
图5A为氧苯酮和褪黑素处理后小鼠卵母细胞内ROS的荧光强度；图5B为卵母细胞内GSH的荧光强度；图5C为卵母细胞线粒体异常分布率；图5D为卵母细胞膜电位水平；图5E为卵母细胞早期凋亡率。Control代表“对照组”；OBZ代表“氧苯酮组”；OBZ+MT代表“氧苯酮+褪黑素组”。a，b代表差异显著(P＜0.05)，数据以3次重复实验的Mean±SEM表示。
纺锤体形态、胞内ROS和GSH水平、线粒体功能以及早期凋亡水平是卵母细胞质量评估的重要指标，因此对卵母细胞纺锤体形态和α-tubulin表达水平进行检测结果发现，如图4所示，褪黑素能够明显缓解氧苯酮诱导纺锤体形态紊乱和α-tubulin表达异常。此外，如图5所示，褪黑素能够明显改善氧苯酮对线粒体功能和早期凋亡水平，并减少MII期卵母细胞内ROS水平、提高GSH水平。
实施例2
褪黑素缓解氧苯酮诱导卵母细胞体内成熟质量下降的表现：
步骤SS1：采用实验小鼠作为研究对象，对实验小鼠进行饲养管理；
实施例中使用的动物为ICR雌鼠和雄鼠，雌鼠鼠龄为6-10周龄，雄鼠鼠龄为10-14周龄，购自广东省医学实验动物中心，饲养于温度为20-25℃，光照为12h明暗间隔的控温控光环境中，实验小鼠可以自由采食和饮水，经过1周的适应后进行实验，操作均符合实验动物福利的相关规定；
步骤SS2：准备实验用的主要试剂及仪器，主要试剂和仪器包括：孕马血清促性腺激素PMSG、人体绒膜促性腺激素hCG，M2培养液、M16培养液、KSOM培养液、石蜡油、α-tubulin抗体、褪黑素，氧苯酮，活性氧试剂盒、GSH试剂盒、Annexin-V-FITC细胞早期凋亡试剂盒、MitoTracker Deep Red线粒体红色荧光探针、MitoProbeTM JC-1线粒体膜电位检测试剂盒、倒置荧光显微镜、共聚焦显微镜；
其中：人体绒膜促性腺激素hCG购自宁波第二激素厂，褪黑素购自美国Sigma公司，氧苯酮购自美国Selleck公司，MitoProbeTM JC-1线粒体膜电位检测试剂盒购自美国ThermoFisher Scientific公司，倒置荧光显微镜购自日本Nikon，Ti-U，共聚焦显微镜购自日本Nikon，A1R；
步骤SS3：将褪黑素(15mg/kg/天)与氧苯酮(500nM/天)按剂量灌胃28天后，检测卵母细胞成熟率和囊胚率。
图6A为对照组、氧苯酮组、氧苯酮+褪黑素组的小鼠卵母细胞体内成熟率(对照组：81.51±8.51％，n＝252；氧苯酮组：59.58±9.92％，n＝301；氧苯酮+褪黑素组：71.16±12.01％，n＝267)；图6B为对照组、氧苯酮组、氧苯酮+褪黑素组的小鼠囊胚率(对照组：78.89±6.29％，n＝186；氧苯酮组：68.53±26.25％，n＝180；氧苯酮+褪黑素组：84.10±11.98％，n＝183)。Control代表“对照组”；OBZ代表“氧苯酮组”；OBZ+MT代表“氧苯酮+褪黑素组”。a，b代表差异显著(P＜0.05)，数据以3次重复实验的Mean±SEM表示。
图7A为对照组、氧苯酮组、氧苯酮+褪黑素组的小鼠卵母细胞内ROS的荧光强度；图7B为卵母细胞内GSH的荧光强度；图7C为卵母细胞线粒体异常分布率；图7D为卵母细胞膜电位水平；图7E为卵母细胞早期凋亡率；图7F为卵母细胞纺锤体形态异常率。Control代表“对照组”；OBZ代表“氧苯酮组”：OBZ+MT代表“氧苯酮+褪黑素组”。a，b代表差异显著(P＜0.05)，数据以3次重复实验的Mean±SEM表示。
结果如图6所示：褪黑素能够显著降低氧苯酮致小鼠卵母细胞体内成熟率和囊胚率下降的危害。对卵母细胞质量的评估结果发现，如图7所示，褪黑素能够明显缓解氧苯酮诱导的卵母细胞纺锤体形态异常、减少胞内ROS水平、提高GSH水平、抑制卵母细胞的早期凋亡、改善线粒体的均匀分布与膜电位水平。
由上述实施例可知，褪黑素可以缓解氧苯酮引起的小鼠卵母细胞体外和体内成熟率下降的问题，改善卵母细胞质量；并有利于缓解氧苯酮引起的卵母细胞纺锤体形态异常的问题，改善线粒体功能，减少氧化应激对卵母细胞的损伤。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
