一种gv期冷冻卵母细胞解冻后体外成熟培养液及其应用
技术领域
本发明涉及繁殖
技术领域
，具体涉及一种GV期冷冻卵母细胞解冻后体外成熟培养液及其应用。技术背景
卵母细胞冷冻技术是重要的生殖生物学技术，广泛应用于种质资源保存、生育力保存及辅助生殖技术中。卵母细胞的发育过程分为多期，其中卵原细胞成为初级卵母细胞之后，经细线期、偶线期、粗线期发育到双线期，在双线期后期，卵母细胞的核很大，染色质高度疏松，外包完整的核膜，此时的卵母细胞称为GV期卵母细胞。GV期卵母细胞冷冻与体外成熟技术相结合可为辅助生殖技术和实验研究扩展卵母细胞来源，在生育力保存及濒危动物保护中具有重要应用价值。
研究发现对GV期卵母细胞进行冷冻保存时可能会损伤卵母细胞膜或卵丘细胞，这些细胞与结构能通过间隙连接影响卵母细胞的成熟过程，GV期卵母细胞周围存在的多层紧密卵丘细胞可能会改变脱水的速度和程度，进而可能加剧细胞质损伤的程度，影响解冻后卵母细胞的内在质量。现有技术主要关注GV期卵母细胞的冷冻过程，如中国专利201510528179.2《一种GV期卵母细胞冷冻保存液及冷冻保存方法》中，为了解决现有卵母细胞冷冻保存解冻后卵母细胞受精卵裂率、囊胚发育率低的问题，提供一种GV期卵母细胞冷冻保存液及冷冻保存方法，卵母细胞冷冻采用cryoloop为载体，以常规培养液为基质，以DMSO和乙二醇为冷冻保护剂，冷冻、解冻过程中添加维生素B12和叶酸，有效提高解冻后卵母细胞存活率及卵母细胞经体外受精和孤雌激活后的胚胎发育率。
虽然冷冻GV期卵母细胞可以产生后代，但解冻后的GV期卵母细胞体外成熟培养发育的质量并不高。提高冷冻卵母细胞体外成熟培养质量已成为促进未成熟卵母细胞冷冻技术有效应用的决定因素。但目前，市场上常用的培养为商业化的M2和M16培养液，没有针对改善GV期冷冻卵母细胞解冻后体外成熟培养质量的专用培养液及相应方法。
发明内容
为了解决以上问题，本发明提出一种GV期冷冻卵母细胞解冻后体外成熟培养液及其应用。
本发明提出的GV期冷冻卵母细胞解冻后体外成熟培养液，是在M16培养液中添加Nampt激活剂P7C3，所述Nampt激活剂P7C3的添加浓度为0.1-10μM。
本发明同时提出一种改善GV期冷冻卵母细胞解冻后体外成熟培养质量的方法，包括如下步骤：
S1、采集GV期卵母细胞并置于M2液滴中备用；
S2、将卵母细胞转移至平衡液中30秒，随后转移至玻璃化冷冻液中20-30秒，然后迅速将卵母细胞置于载杆前端，投入液氮；
S3、解冻时，将S2所述载杆迅速从液氮中取出，置于含0.5M蔗糖的PBS中作用5min，然后用M2液清洗三遍后备用；
S4、将S3获得的卵母细胞放入GV期冷冻卵母细胞解冻后体外成熟培养液中，覆盖上石蜡油于培养箱中进行体外成熟培养。
优选地，所述Nampt激活剂P7C3的添加浓度为1μM。
优选地，所述步骤S2中，卵母细胞从进入玻璃化冷冻液开始到投入液氮的时间控制在25秒内。
优选地，所述平衡液为含10％DMSO和10％EG的PBS液。
优选地，所述玻璃化冷冻液为含15％EG、15％DMSO、0.5M蔗糖、30％Ficoll的PBS液。
本发明的有益效果如下：
1、提出一种GV期冷冻卵母细胞解冻后体外成熟培养液：GV期卵母细胞成熟需经历生发泡破裂(germinal vesicle breakdown,GVBD)，进而恢复第一次减数分裂，卵母细胞纺锤体在胞质中央或临近中央区组装，随后染色体在赤道板排列，纺锤体在肌动蛋白作用下沿其长轴向皮质区迁移，当纺锤体迁移至皮质区时，肌动蛋白在皮质区聚集，第一极体排出(polar body extrusion，PBE)，随后卵母细胞迅速进入第二次减数分裂中期，等待受精完成第二次减数分裂，纺锤体在皮质下第一次分裂位置组装。减数分裂过程中的纺锤体组装及迁移均依赖于线粒体产能，肌动蛋白细胞骨架也依赖于可利用的ATP调节卵母细胞纺锤体运动。我们前期研究发现冷冻可影响纺锤体完整性及染色体排列，导致卵母细胞减数分裂进程受阻、非整倍体显著增加，其中未成熟卵母细胞冷冻后表现为极体排出延迟。上述现象表明冷冻卵母细胞能量供应不足，可能是影响其发育能力的重要因素。烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase，Nampt)是补偿途径的限速酶，催化烟酰胺产生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成的前体物质烟酰胺腺嘌呤单核苷酸，在能量代谢中发挥重要作用。目前尚未见其应用于卵母细胞体外成熟培养的报道，结合冷冻卵母细胞发育中存在能量供应不足的表型，我们以小鼠卵母细胞为模型，在传统体外培养液的基础上添加Nampt激活剂P7C3用于GV期冷冻卵母细胞的体外成熟培养，满足GV期冷冻卵母细胞体外成熟过程中对能量的需求，进而提高卵母细胞内在质量。
2、明确体外成熟培养液中P7C3添加的适宜浓度：本发明给出Nampt激活剂P7C3在M16培养液中的添加浓度为0.1-10μM，优选1μM。
3、明确P7C3对GV期冷冻卵母细胞体外成熟质量的影响：本发明的实施例可以看出，冷冻可显著降低卵母细胞体外成熟率：新鲜GV期卵母细胞经常规体外成熟培养后GVBD发生率为91.31％，PBE发生率为85.06％，而GV期冷冻卵母细胞经常规体外成熟培养后GVBD发生率为79.24％，PBE发生率为73.29％；在常规培养液M16中添加1μM P7C3的体外成熟液可促进GV期冷冻卵母细胞体外成熟，并可降低冷冻卵母细胞氧化应激，提高冷冻卵母细胞内在质量；体外成熟培养液中添加1μM P7C3可显著降低冷冻卵母细胞非整倍体比例(P<0.05)，且其非整倍体比例与新鲜卵母细胞相比无明显差异。
附图说明
图1为冷冻对GV期卵母细胞解冻后体外成熟的影响对比图；
图2为不同浓度的Nampt激活剂P7C3培养液对GV期卵母细胞解冻后体外成熟的影响对比图；
图3为不同浓度的Nampt激活剂P7C3培养液对GV期卵母细胞解冻后体外成熟氧化应激的影响对比图；其中：A为不同浓度P7C3处理后荧光染色对比图；B为不同浓度P7C3处理后荧光强度定量分析；
图4为Nampt激活剂P7C3对GV期卵母细胞解冻后体外成熟非整倍体率的影响对比图；其中：A为整倍体卵母细胞；B为非整倍体卵母细胞；C为新鲜GV期卵母细胞常规培养、冷冻GV期卵母细胞常规培养、冷冻GV期卵母细胞在添加1μM P7C3的培养液中培养的非整倍体率的对比分析。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。
以下实验中，M2和M16培养液均为传统配子及胚胎体外培养试剂，为商品化试剂。
M2培养液是一种修正的Krebs-Ringer溶液，成分为：丙酮酸钠0.036g/L，MgSO4×7H2O 0.293g/L,链霉素5.0g/L，KH2PO4 0.162g/L，青霉素G 7.5g/L，KCl 0.356g/L，葡萄糖1.0g/L，NaHCO3 0.349g/L，NaCl 5.533g/L，60％乳酸钠4.349ml/L，Hepes 4.969g/L，CaCl2×2H2O 0.252g/L，BSA 4.0g/L。
M16是胚胎体外培养试剂，成分为：CaCl2×2H2O 0.25137g/L，MgSO4 0.1649g/L，KCl 0.35635g/L，KH2PO4 0.162g/L，NaHCO3 2.101g/L，NaCl 5.53193g/L，BSA4.0g/L，D-葡萄糖1.0g/L，酚红钠0.0106g/L，丙酮酸钠0.0363g/L，DL-乳酸钠2.95g/L，青霉素G钾0.06g/L，硫酸链霉素0.05g/L。
实施例1：GV期卵母细胞收集及冷冻
①GV期卵母细胞收集
小鼠腹腔注射10IU的孕马血清促性腺激素，48h后采集小鼠卵巢组织。将卵巢置于含有2μM米力农的M2液中，在显微镜下利用1mL注射器针头刺破卵泡。用口吸管收集释放的GV期卵母细胞，并将其置入35mm培养皿中一个100μL含有2μM米力农的M2液滴中备用。
②卵母细胞冷冻
卵母细胞玻璃化冷冻解冻方法参照课题组常规步骤，具体为：将卵母细胞置于ED液，即含10％DMSO、10％EG的PBS液，30sec，随后转移至EDFS30液，即含15％EG、15％DMSO、0.5M蔗糖、30％Ficoll的PBS液，将卵母细胞置于载杆前端，投入液氮，卵母细胞从进入EDFS30液开始到投入液氮的时间控制在25sec内。
实施例2在M16培养液中添加不同浓度Nampt激活剂P7C3对GV期冷冻卵母细胞解冻后体外成熟质量的对比实验
①解冻实施例1的GV期冷冻卵母细胞
解冻时，将待解冻的载杆迅速从液氮中取出，置于含0.5M蔗糖的PBS中作用5min，然后用M2液清洗三遍后备用。
②卵母细胞体外成熟
将解冻后或新鲜的GV期卵母细胞分别放入含不同浓度Nampt激活剂P7C3的M16溶液中，覆盖上石蜡油于培养箱中进行体外成熟。
P7C3在M16溶液中的浓度分别为：0μM、0.1μM、1μM、10μM。
③GVBD及PBE观测方法
在卵母细胞开始体外成熟后2.5h统计卵母细胞的GVBD率，体外成熟12h后统计PBE排出率。
④卵母细胞氧化应激指标检测
采用2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯(2′,7′-dichlorofluorescin diacetate,DCFDA)测定ROS，取卵母细胞置于1mM DCFDA液滴中，于37℃培养箱中孵育20min。卵母细胞经含0.1％BSA的DPBS洗涤三次后置于荧光显微镜下观察，激发光460nm。实验重复三次。
⑤卵母细胞非整倍体检测
MII期卵母细胞于含0.5％链霉蛋白酶的M2液中处理5分钟，消化透明带。配置铺片固定液：将1％多聚甲醛，0.15％Triton X100和3mM DTT溶于PBS液中，用NaOH溶液将PH调至9.2。用疏水笔在载玻片上画一个边长为1cm的方格，将方格内滴入100μl的固定液。将卵母细胞由液滴上方轻轻放入，然后放到4℃过夜风干。然后再向方格内滴加DAPI，室温避光放置5分钟后于倒置荧光显微镜下进行拍照。
⑥数据统计方法
每个实验至少重复3次。数据采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，P<0.05被认为是差异显著。
结果：
1、冷冻可显著降低卵母细胞体外成熟率
GV期冷冻卵母细胞经常规体外成熟培养后GVBD发生率为79.24％，PBE发生率为73.29％；新鲜GV期卵母细胞经常规体外成熟培养后GVBD发生率为91.31％，PBE发生率为85.06％，如图1所示，冷冻卵母细胞GVBD、PBE比例均显著低于相应新鲜GV期卵母细胞体外成熟发育(P<0.05)。
2、不同浓度P7C3对GV期冷冻卵母细胞体外成熟的影响
浓度为0.1μM P7C3添加组：共对50枚GV期冷冻卵母细胞行体外成熟培养，GVBD发生率为93.87％，PBE发生率为83.82％。
浓度为1μM P7C3添加组：共对50枚GV期冷冻卵母细胞行体外成熟培养，GVBD发生率为96.08％，PBE发生率为84.19％。
浓度为10μM P7C3添加组：共对49枚GV期冷冻卵母细胞行体外成熟培养，GVBD发生率为87.75％，PBE发生率为87.75％。
如图2所示，与对照的GV期冷冻卵母细胞经常规体外成熟培养(仅采用M16培养液)相比，添加P7C3可显著提高冷冻卵母细胞GVBD发生比例(P<0.05)，10μM处理组可显著提高PBE比例(P<0.05)。
3、不同浓度P7C3对GV期冷冻卵母细胞氧化应激的影响
现有研究发现卵母细胞内氧化还原稳态被破坏是导致解冻后发育能力下降的必然原因，ROS水平可反映卵母细胞氧化应激状态，高水平ROS可致氧化应激、影响卵母细胞线粒体功能、降低卵母细胞内在质量、引起DNA损伤、脂质过氧化及蛋白氧化，严重影响细胞功能。本发明提供的体外成熟培养液能降低GV期卵母细胞ROS水平。如图3所示，体外成熟培养液M16中添加1μM P7C3可显著降低冷冻卵母细胞ROS水平(P<0.05)，而10μM P7C3处理组可显著增加冷冻卵母细胞ROS水平(P<0.05)。因此，综合不同浓度P7C3对冷冻卵母细胞GVBD、PBE发生率及氧化应激状态的影响，可得出：添加1μM P7C3的体外成熟液可促进GV期冷冻卵母细胞体外成熟，并可降低冷冻卵母细胞氧化应激，提高冷冻卵母细胞内在质量。
4、P7C3可降低GV期冷冻卵母细胞体外成熟后的非整倍体率
减数分裂过程中染色体的正确分离是受精及后续胚胎正常发育的基础。研究发现冷冻可影响纺锤体完整性及染色体排列，导致卵母细胞减数分裂进程受阻、非整倍体显著增加，而非整倍体可导致唐氏综合症、流产等，是女性不孕的首要因素,因此，非整倍体率是卵母细胞的内在质量的重要指标之一。本实验进一步分析添加1μM P7C3的新型体外成熟培养液对MII期卵母细胞非整倍体比例的影响，如图4所示，未添加组中冷冻卵母细胞非整倍体比例显著升高(P<0.05)，而体外成熟培养液中添加1μM P7C3可显著降低冷冻卵母细胞非整倍体比例(P<0.05)，且其非整倍体比例与新鲜卵母细胞相比无明显差异。
实施例3 Nampt抑制剂FK866对GV期冷冻卵母细胞体外成熟的影响
参照实施例2的方法，对GV期冷冻卵母细胞进行解冻后行体外成熟培养，但是将体外成熟培养液配方进行修改，其余试剂和操作不变。体外成熟培养液配方改为：在M16培养液中添加不同浓度Nampt抑制剂FK866(浓度分别为1μM、10μM、100μM)。GVBD及PBE观测方法同实施例2。
结果：添加FK866后冷冻卵母细胞GVBD及PBE呈浓度依赖性下降，1μM、10μM、100μMFK866处理组GVBD比率分别为89.12％、77.97％、33.69％，PBE发生比例分别为76.48％、70.46％、63.53％。该结果表明Nampt在GV期冷冻卵母细胞体外成熟中发挥重要作用，并从侧面验证了Nampt激活剂P7C3对GV期冷冻卵母细胞体外成熟的改善效果。
实施例4褪黑素melatonin对GV期冷冻卵母细胞体外成熟的影响
参照实施例2的方法，对GV期冷冻卵母细胞进行解冻后行体外成熟培养，但是将体外成熟培养液配方进行修改，其余试剂和操作不变。体外成熟培养液配方改为：在M16培养液中添加不同浓度褪黑素(浓度分别为10-5,10-7,10-9,10-11mol/L)。GVBD及PBE观测方法同实施例2。
结果：体外成熟培养液中添加褪黑素对冷冻卵母细胞的GVBD发生率无明显影响，分别为82.57％、83.35％、82.03％、82.03％。添加10-5,10-7,10-9,10-11mol/L褪黑素后，冷冻卵母细胞PBE发生比率分别为76.38％、75.07％、69.92％、83.35％。10-11mol/L褪黑素可使冷冻卵母细胞PBE比例显著升高，但对GVBD无明显影响。说明其促进减数分裂恢复(GVBD)作用劣于P7C3。该结果表明，褪黑素作为细胞体外培养常用的抗氧化剂，对GV期冷冻卵母细胞解冻后体外成熟培养质量的影响并不显著。
实施例5 Mito-Q对GV期冷冻卵母细胞体外成熟的影响
参照实施例2的方法，对GV期冷冻卵母细胞进行解冻后行体外成熟培养，但是将体外成熟培养液配方进行修改，其余试剂和操作不变。体外成熟培养液配方改为：在M16溶液中添加不同浓度Mito-Q(浓度分别为0.01,0.05,0.25μM)。GVBD及PBE观测方法同实施例2。
结果：体外成熟培养液中添加0.01,0.05,0.25μM Mito-Q后冷冻卵母细胞GVBD发生率分别为79.02％、82.93％、76.85％，PBE发生比率分别为74.96％、80.92％、72.07％。0.05μM Mito-Q可以使冷冻卵GVBD、PBE比例有所提高，但仍低于P7C3处理组，与新鲜卵母细胞仍有差距。该结果表明，Mito-Q作为细胞体外培养常用的抗氧化剂，对GV期冷冻卵母细胞解冻后体外成熟培养质量的影响并不显著。
表1实施例2-5结果对比
由上表可知，冷冻可使卵母细胞GVBD、PBE比例显著降低，抗氧化剂可促进GV期冷冻卵母细胞体外成熟，表现在GVBD、PBE发生比例较冷冻组有所提高，但同种抗氧化剂不同浓度及不同抗氧化剂间作用效果不尽相同，比较卵母细胞体外成熟比例，可见1μM P7C3添加组效果最好，可使冷冻卵母细胞GVBD及PBE发生率与新鲜卵母细胞相近。ROS水平及非整倍体比例的分析结果表明P7C3通过降低冷冻卵母细胞氧化应激及非整倍体率促进了GV期冷冻卵母细胞体外成熟质量。
综上，在GV期冷冻卵母细胞解冻后的体外成熟培养液中添加Nampt激活剂P7C3可有效提高GV期冷冻卵母细胞解冻后体外培养成熟率，降低卵母细胞氧化应激及非整倍体发生率，可提高未成熟冷冻卵母细胞的内在质量。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
