一种酶分消化结合组织块培养分离成骨细胞的方法
技术领域
本发明属于细胞分离鉴定领域，具体涉及一种酶分消化结合组织块培养分离成骨细胞的方法。
背景技术
骨的生长和发育是骨形成和骨吸收之间动态平衡过程，而成骨细胞决定着骨的生长和发育、以及影响着骨的发生和形成，对骨基质里面的胶原和糖蛋白的合成与分泌起到了非常重要的作用，而且成骨细胞能够保持动物机体细胞外液各种理化因素的相对稳定、协调动物机体内的各种生理机制和生命活动，对治疗各种由骨引起的疾病或疫病起到了及其重要的作用，成骨细胞在体内主要来源于骨膜和骨组织，培养成骨细胞的标本有很多，主要来源有人胚、大鼠、小鼠和兔，将鼠作为标本既经济实用又不难获得,乳鼠颅骨的成骨细胞活动也及其地活跃，表现出了良好的增殖能力，而且新生乳鼠颅骨收集的细胞数量较多,所以我们在实验中选择乳鼠作为标本分离培养成骨细胞。
对成骨细胞进行研究，建立正确的成骨细胞分离培养方法，对骨组织代谢的探究具有关键的作用，是骨组织工程以及骨组织代谢形成机制的基础，由于成骨细胞存在于致密的组织中，导致成骨细胞难以完全分离，造成分离培养出的成骨细胞纯度不一，而单纯酶消化法或单纯的组织块培养法，其分离出的细胞数量有限，或者细胞纯度低，不能满足实验的需求，因此，建立何种分离培养方法显得十分重要。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种酶分消化结合组织块培养分离成骨细胞的方法。
为了实现上述目的或者其他目的，本发明是通过以下技术方案实现：
一种酶分消化结合组织块培养分离成骨细胞的方法，S1、前期准备：取七日龄以内的颅骨组织，清洗后将颅骨组织剪碎成组织块；
S2、酶分消化：将组织块置于离心管中，通过胰蛋白酶和I型胶原酶分步对组织块进行消化，直至组织块松散成胡絮状；
S3、细胞培养：向离心管内加入培养液后静置，每隔1-3天采取半换液方式进行换液，直至细胞从组织块周边生长出来，再更换培养液并废弃组织块；
S4、细胞纯化：通过差速贴壁法去除步骤S3中离心管中的成纤维细胞，即可得到纯化的成骨细胞。
进一步地，步骤S2的酶分消化的具体过程如下：
1)将步骤S1中体积一致的组织块分别转移至一离心管内，向离心管中加入5-6倍于组织块体积的0.25％胰蛋白酶溶液，将离心管置于恒温水浴锅中进行振荡消化，吹打组织块使经过消化的细胞脱落，离心后移除上层溶液，采用PBS溶液清洗；
2)清洗完成后，再加入5-6倍于组织块体积的I型胶原酶，在恒温水浴锅中继续振荡消化，离心后弃去上层溶液；
3)重复上述步骤2)，直至组织块松散成胡絮状。
进一步地，步骤1)中,振荡消化的时间为20-40min；步骤2)和步骤3)中，振荡消化的时间为15-25min。
进一步地，所述恒温水浴锅的温度为34-37℃。
进一步地，步骤S1中，所述组织块的大小为1-3mm3。
进一步地，步骤S3中，所述半换液方式为：
使用胶头滴管吸取离心管内的细胞培养液1ml并废弃，再加入1ml新的培养液至离心管中。
进一步地，步骤S4中，所述差速贴壁法的具体过程为：
吸取离心管中旧培养液并弃去，每隔24-36h进行换液,用0.25％胰蛋白酶溶液进行消化，加入等量的培养液终止消化，吹打瓶壁与壁角的细胞使之分散，形成细胞悬液；
离心管转入六孔板中，在37℃、5％CO2培养箱中培养后，将培养液与离心管内未贴壁的细胞从离心管吸出，离心加入细胞培养液，垂悬后再转入新的六孔板中，并于37℃、5％CO2培养箱中进行培养，培养所得细胞即为纯化的成骨细胞。
本发明的有益效果：
本发明使用的培养方法使分离的成骨细胞的细胞纯度相比于对比例大幅度得到提升，且同时细胞培养所需的时间也大大缩短。
附图说明
图1为本发明的实施例1的成骨细胞在100倍显微镜下的图；
图2为对比例1的成骨细胞在100倍显微镜下的图；
图3为对比例2的成骨细胞在100倍显微镜下的图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
本发明所述的一种酶分消化结合组织块培养分离成骨细胞的方法，包括以下步骤：S1、前期准备：取七日龄以内乳鼠的颅骨，放入含有双抗的PBS中清洗，去骨膜后使用含有双抗的PBS清洗，清洗后将颅骨剪碎成体积为1-3mm3的组织块；S2、酶分消化：(1)将组织块分别转移至离心管内，并加入5-6倍于组织块体积的0.25％胰蛋白酶溶液，将离心管置于温度为34-37℃的恒温水浴锅中进行振荡消化20-40min，吹打组织块使经过消化的细胞脱落，采用2000r/min离心5min，移除上层溶液，使用PBS溶液清洗；(2)再加入5-6倍于组织块体积的I型胶原酶，在温度为34-37℃的恒温水浴锅中振荡消化15-25min，采用2000r/min离心5min，弃去上层溶液，(3)重复上述步骤(2)直至组织块松散成胡絮状；其中步骤(1)中的振荡消化时间优选多于步骤(2)中的振荡消化时间；S3、细胞培养：向离心管内加入2mL的培养液，并将离心管移入六孔板内静置，且每隔2天使用半换液方式维持细胞生长，所述半换液方式为将六孔板上离心管内的细胞培养液使用胶头滴管吸取1ml并废弃，再加入1ml新的培养液至离心管中，直至细胞从组织块周边生长出来，更换培养液并废弃组织块；S4、细胞纯化：采用差速贴壁法去除离心管内的成纤维细胞，所述差速贴壁法的过程为：吸取离心管中旧培养液并弃去，每隔一天换液1mL,用0.25％胰蛋白酶溶液进行消化，加入等量的培养液终止消化，吹打贴于瓶壁及壁角的细胞使之分散，形成细胞悬液，将细胞悬液转入六孔板中，并在37℃、5％CO2培养箱中培养后，将培养液与离心管内未贴壁的细胞从离心管吸出，离心加入细胞培养液，垂悬后再转入新的六孔板中，并于37℃、5％CO2培养箱中进行培养，培养所得细胞即为成骨细胞，并可进行细胞传代。
在上述中所用培养液均为RPMI1640培养液。
实施例1
培养方法如下：
S1、前期准备：取七日龄以内乳鼠的颅骨，放入含有双抗的PBS中清洗，去骨膜后使用含有双抗的PBS清洗，清洗后将颅骨剪碎成体积为3mm3的组织块；
S2、酶分消化：(1)将组织块分别转移至离心管内，并加入5倍于组织块体积的0.25％胰蛋白酶溶液，将离心管置于温度为37℃的恒温水浴锅中进行振荡消化20min，吹打组织块使经过消化的细胞脱落，采用2000r/min离心5min，移除上层溶液，使用PBS溶液清洗；(2)再加入5倍于组织块体积的I型胶原酶，在温度为37℃的恒温水浴锅中振荡消化15min，采用2000r/min离心5min，弃去上层溶液，(3)重复上述步骤(2)3次后，组织块松散成胡絮状；
S3、细胞培养：向离心管内加入2mL的RPMI1640培养液，并将离心管移入六孔板内静置，且每隔2天使用半换液方式维持细胞生长，所述半换液方式为将六孔板上离心管内的细胞培养液使用胶头滴管吸取1ml并废弃，再加入1ml新的培养液至离心管中，直至细胞从组织块周边生长出来，更换培养液并废弃组织块；
S4、细胞纯化：采用差速贴壁法去除离心管内的成纤维细胞，所述差速贴壁法的过程为：吸取离心管中旧培养液并弃去，每隔一天换液1mL,用0.25％胰蛋白酶溶液进行消化，加入等量的培养液终止消化，吹打贴于瓶壁及壁角的细胞使之分散，形成细胞悬液，将细胞悬液转入六孔板中，并在37℃、5％CO2培养箱中培养后，将培养液与离心管内未贴壁的成纤维细胞从离心管吸出，离心加入细胞培养液，垂悬后再转入新的六孔板中，并于37℃、5％CO2培养箱中进行培养，培养所得细胞即为成骨细胞，并可以此进行细胞传代。
如图1为采用上述步骤分离的成骨细胞，成骨细胞为贴壁生长型细胞，数量丰富，生长状态良好，细胞密集区表现为放射状和漩涡状，形态呈多种形态、不规则，多呈长梭形，细胞液中悬浮少量的死细胞；且当细胞接近融合时，形态趋向单一，以短梭型为主。
实施例2
培养方法如下：
S1、前期准备：取七日龄以内乳鼠的颅骨，放入含有双抗的PBS中清洗，去骨膜后使用含有双抗的PBS清洗，清洗后将颅骨剪碎成体积为3mm3的组织块；
S2、酶分消化：(1)将组织块分别转移至离心管内，并加入5倍于组织块体积的0.25％胰蛋白酶溶液，将离心管置于温度为37℃的恒温水浴锅中进行振荡消化20min，吹打组织块使经过消化的细胞脱落，采用2000r/min离心5min，移除上层溶液，使用PBS溶液清洗；(2)再加入5倍于组织块体积的I型胶原酶，在温度为37℃的恒温水浴锅中振荡消化25min，采用2000r/min离心5min，弃去上层溶液，(3)重复上述步骤(2)3次后，组织块松散成胡絮状；
步骤S3和步骤S4同实施例1。
实施例3
培养方法如下：
S1、前期准备：取七日龄以内乳鼠的颅骨，放入含有双抗的PBS中清洗，去骨膜后使用含有双抗的PBS清洗，清洗后将颅骨剪碎成体积为3mm3的组织块；
S2、酶分消化：(1)将组织块分别转移至离心管内，并加入6倍于组织块体积的0.25％胰蛋白酶溶液，将离心管置于温度为37℃的恒温水浴锅中进行振荡消化30min，吹打组织块使经过消化的细胞脱落，采用2000r/min离心5min，移除上层溶液，使用PBS溶液清洗；(2)再加入6倍于组织块体积的I型胶原酶，在温度为37℃的恒温水浴锅中振荡消化25min，采用2000r/min离心5min，弃去上层溶液，(3)重复上述步骤(2)3次后，组织块松散成胡絮状；
步骤S3和步骤S4同实施例1。
实施例4
培养方法如下：
S1、前期准备：取七日龄以内乳鼠的颅骨，放入含有双抗的PBS中清洗，去骨膜后使用含有双抗的PBS清洗，清洗后将颅骨剪碎成体积为1mm3的组织块；
S2、酶分消化：(1)将组织块分别转移至离心管内，并加入5.5倍于组织块体积的0.25％胰蛋白酶溶液，将离心管置于温度为34℃的恒温水浴锅中进行振荡消化25min，吹打组织块使经过消化的细胞脱落，采用2000r/min离心5min，移除上层溶液，使用PBS溶液清洗；(2)再加入5.5倍于组织块体积的I型胶原酶，在温度为35℃的恒温水浴锅中振荡消化20min，采用2000r/min离心5min，弃去上层溶液，(3)重复上述步骤(2)3次后，组织块松散成胡絮状；
步骤S3和步骤S4同实施例1。
实施例5
培养方法如下：
S1、前期准备：取七日龄以内乳鼠的颅骨，放入含有双抗的PBS中清洗，去骨膜后使用含有双抗的PBS清洗，清洗后将颅骨剪碎成体积为2mm3的组织块；
S2、酶分消化：(1)将组织块分别转移至离心管内，并加入6倍于组织块体积的0.25％胰蛋白酶溶液，将离心管置于温度为34℃的恒温水浴锅中进行振荡消化40min，吹打组织块使经过消化的细胞脱落，采用2000r/min离心5min，移除上层溶液，使用PBS溶液清洗；(2)再加入5倍于组织块体积的I型胶原酶，在温度为34℃的恒温水浴锅中振荡消化25min，采用2000r/min离心5min，弃去上层溶液，(3)重复上述步骤(2)3次后，组织块松散成胡絮状；
步骤S3和步骤S4同实施例1。
实施例6
培养方法如下：
S1、前期准备：取七日龄以内乳鼠的颅骨，放入含有双抗的PBS中清洗，去骨膜后使用含有双抗的PBS清洗，清洗后将颅骨剪碎成体积为2mm3的组织块；
S2、酶分消化：(1)将组织块分别转移至离心管内，并加入6倍于组织块体积的0.25％胰蛋白酶溶液，将离心管置于温度为34℃的恒温水浴锅中进行振荡消化25min，吹打组织块使经过消化的细胞脱落，采用2000r/min离心5min，移除上层溶液，使用PBS溶液清洗；(2)再加入5倍于组织块体积的I型胶原酶，在温度为34℃的恒温水浴锅中振荡消化25min，采用2000r/min离心5min，弃去上层溶液，(3)重复上述步骤(2)3次后，组织块松散成胡絮状；
步骤S3和步骤S4同实施例1。
对比例1
组织块法：取七日龄内乳鼠颅骨，置于含有双抗的PBS液无菌培养皿中，在显微镜下仔细去除骨内的组织及骨膜，PBS液反复冲洗，去除杂质和血液，将骨块剪成1.0-3.0mm3大小的碎块，直接均匀接种与25cm2的培养瓶中，翻转培养瓶置于37℃体积分数5％CO2孵箱中培养3h左右，翻转培养瓶加入含有体积分数15％胎牛血清的DMEM培养液后继续培养，3d后换液，细胞融合成单层后在传代培养。
图2为组织块法分离培养的成骨细胞：从组织块中游离出来的成骨细胞数量少，生长状态不佳。
对比例2
酶消化法：取七日龄内乳鼠颅骨，置于含有双抗的PBS液无菌培养皿中，在显微镜下仔细去除骨内的组织及骨膜，PBS液反复冲洗，去除杂质和血液，将骨块剪成1.0-3.0mm3大小的碎块；再用0.25％胰蛋白酶且含有0.02％EDTA在37℃体积分数5％CO2孵箱分别消化30min后，反复两三次消化，恒温摇床不断振荡，2000r/min离心5min后，弃掉胰蛋白酶，加入含体积分数15％胎牛血清的完全培养基DMEM，垂悬细胞后于37℃、5％CO2培养箱中培养，3d后换液，待细胞融合达75％左右时进行传代继续培养。
图3为酶消化法分离培养的成骨细胞：单纯的0.25％胰酶消化下来的成骨细胞数量虽多，但胰酶消化能力强，导致细胞死亡多，存活下来的成骨细胞数量少。
将实施例1-6与对比例1和对比例2的分离培养方法进行比较，结果见表1。
表1
由表1数据可以看出，本发明方法的细胞纯度相比与对比例1和对比例2提高很多，同时细胞培养所需时间也大大缩短。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
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