一种含干细胞外泌体的生物墨水及其制造方法
技术领域
本发明属于医疗器械领域，具体涉及含干细胞外泌体的生物墨水及其制造方法。
背景技术
关节软骨是运动系统的重要的组成结构之一，与关节内骨端的表面相连接，质地光滑有弹性。关节软骨具有润滑关节、缓冲运动产生的震动和冲击、改善骨与骨的之间的运动和形态匹配，对维持关节正常运动功能至关重要。软骨损伤可以引起剧烈疼痛、关节肿胀、活动能力下降和周围软骨及软骨下骨的退化，甚至发展为骨关节炎，严重影响患者的生活质量，给个人和社会带来沉重的经济负担。随着我国人民群众体育锻炼的热情日益高涨，参与体育活动的种类也逐步扩大，人们发生运动创伤包括关节软骨损伤的机率大大增加。在运动创伤领域，越来越多的患者遭受关节软骨损伤的困扰。软骨缺损在临床常见，有研究显示在接受膝关节镜手术的患者中，有超过 60% 的患者存在软骨缺损。软骨组织没有血管、神经和淋巴分布，其营养来源主要依靠关节滑液和关节囊滑膜层周围的血管供应。因此，软骨损伤后自我修复困难。
目前，常用的软骨缺损修复的手术策略主要包括微骨折术（microfracture, MF）、自体软骨细胞移植（autologous chondrocyte implantation, ACI）、自体软骨组织移植、同种异体软骨组织移植、干细胞疗法以及组织工程技术等。但是，每种方法都有一定的局限性。许多临床结果表明 MF 和 ACI 方法修复的再生软骨组织主要是纤维软骨组织，并且生物力学性能不如天然的透明软骨。自体软骨组织或者同种异体软骨组织移植修复效果较好，但是由于取材部位容易发生并发症以及来源有限限制了在临床的广泛应用。细胞移植包括 ACI 和干细胞疗法往往需要两个阶段：第一阶段是在体外对自体软骨细胞或者干细胞进行分离、培养和扩增；第二阶段是手术移植到缺损部位。细胞体外扩增过程中的存在去分化、干性降低、衰老，以及高成本、较长的等待时间和二次手术等是细胞疗法临床应用的限制因素。此外，传统的细胞移植在缺损部位不易长期保留也是面临的一个重要问题。目前为止，这些治疗方法均无法完全修复受损的关节软骨。
有人证实，直接向待修复组织注射外泌体的实验组相比对照组具有更好的修复效果，但是多次注射带来的感染风险以及外泌体悬液在关节腔的弥散降低了其治疗效率。
传统冻干法难以制备不同空间特异的仿生支架，而3D生物打印技术的出现为精确构建仿生结构以模拟和重塑不同组织的三维空间结构提供了新的方法。脱细胞基质可以模拟其来源组织的生物和结构微环境，提供其再生的理想条件，被认为是组织工程最理想的仿生生物材料。但是，单纯的脱细胞基质材料由于力学强度较低，打印多层后容易出现的“坍塌效应”，导致无法维持仿生支架的空间排布。3D打印的其他生物材料虽然具有一定促进软骨细胞分化并修复软骨损伤的作用，但是最终修复效果欠佳，不具备仿生性能或者仿生性能差。
因此，需要一种能够解决以上所有或部分问题的方法和产品。
发明内容
本发明的第一个方面提供了一种生物墨水，其包含主体材料、软骨脱细胞基质和外泌体，所述主体材料包含甲基丙烯酸酐明胶（gelatin methacryloyl，GelMA）、氧化的透明质酸（oxidized hyaluronic acid，OHA）和多巴胺修饰的透明质酸（dopamineconjugated hyaluronic acid，HA-DA）；
可选地，GelMA的质量比例为6%-12%，OHA的质量比例为0.5%-4%，HA-DA的质量比例为0.5%-4%，脱细胞基质质量比例为0.5-5%；
外泌体为间充质干细胞外泌体，优选地外泌体来自脂肪间充质干细胞（ADSCs），外泌体的终浓度为 10 -1000μg/mL；优选为100±50μg/mL，最优选100μg/mL；
可选地，本发明的生物墨水还包含光引发剂，其质量比例为0.1-0.5%。
在一个实施例中，优选地，本发明的生物墨水包含质量比例9%的GelMA 、质量比例2%的OHA、2% 的HA-DA、 质量比例2%的脱细胞基质、和质量比例0.4%的光引发剂、以及终浓度为 100 μg/mL的外泌体。
本发明的第二个方面提供了一种生物支架，其使用本发明的生物墨水通过3D打印方法制造。
本发明的第三个方面提供了一种生物墨水的制备方法，包括以下步骤：
1）称取适量 GelMA 加入 ddH2O 中, 37℃ 搅拌溶解后加入OHA，继续搅拌溶解，得到第一溶液；
2）配制 4% 的脱细胞基质墨水，调整 pH 至 7.4后，加入 HA-DA 和 光引发剂，室温搅拌溶解，得到第二溶液；
3）将所述第一溶液和所述第二溶液混合均匀获得脱细胞基质生物墨水；
4）向所述脱细胞基质生物墨水的中加入间充质干细胞外泌体，使得其终浓度达到预期浓度，得到所述生物墨水；
其中步骤1）和2）没有先后顺序。
进一步地，在一个实施例中，制备生物墨水的方法如下进行：
1）称取0.9 g甲基丙烯酸酐明胶加入5 mL的ddH2O 中, 37℃ 搅拌溶解后加入0.2g氧化的透明质酸，继续搅拌溶解；
2）配制 4% 的软骨脱细胞基质墨水5 mL，调整 pH 至7.4后，加入0.2 g多巴胺修饰的透明质酸和0.04 g光引发剂，室温搅拌溶解；
3）将上述两种溶液混合均匀获得软骨脱细胞基质生物墨水；
4）向所述软骨脱细胞基质生物墨水的中加入外泌体，使得其终浓度为100μg/mL；
其中，软骨脱细胞基质墨水的配制如下进行：
a）称取15 mg的胃蛋白酶加入5 mL的0.1 M盐酸溶液中，室温搅拌30分钟；
b）称取150 mg的软骨脱细胞基质粉末，加入上述含有胃蛋白酶的盐酸溶液，室温密封搅拌 72小时获得软骨脱细胞基质墨水。试剂的使用量根据总量确定，前述质量仅仅是一个具体实例，可以成比例放大或者缩小。
该实施例中的质量仅仅作为例子，按照相同的比例可以制备不同需求的墨水体积是本领域人员所知晓的。
本发明的优点至少在于：
1、本发明的生物墨水及生物支架能够模拟关节软骨微环境，同时实现仿生修复；
2、本发明的生物支架加入的OHA中存在的醛基，可以与GelMA和脱细胞基质中的氨基发生席夫碱反应，实现动态共价交联，与HA-DA中的多巴胺活性基团联合，起到更好的外泌体缓释修效果；
3、缓释的外泌体保留了生物活力，可以促进间充质干细胞增殖、成软骨分化；
4、支架在体内吸收速率和组织再生速率相匹配，软骨生成效果好，效率高。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明的一个实施例中凝胶材料的 1H NMR分析。图1A为明胶和 GelMA的比对分析；图1B为HA、OHA 和 HA-DA的比对分析。
图2为根据本发明一个实施例的方法制备的软骨脱细胞基质的表征，显示软骨脱细胞前后的大体观、 HE 染色和 DAPI 染色；
图3为根据本发明一个实施例的方法制备的软骨脱细胞基质的表征，图3A. DNA含量检测。图3B. GAG 含量检测；图3C. 胶原（collagen）含量检测；
图4为根据本发明一个实施例的方法制备的软骨脱细胞基质的表征，图4A. 脱细胞基质生物墨水成胶试验；图4B. 流变学检测。n = 3, ** P < 0.01, *** P < 0.001。
图5为根据本发明一个实施例的方法制备的Hydrogel支架和Hydrogel-DCM支架在扫描电子显微镜下的微观形貌。
图6为根据本发明一个实施例的方法制备的Hydrogel支架、Hydrogel-DCM支架的溶胀、降解速率和傅里叶变换红外光谱分析，图6A. 支架的降解速率，n = 5，图6B. 支架的溶胀，n = 3，小时（h），图6C. 傅里叶变换红外光谱分析，透射比（transmittance），波数（wavenumber）。
图7为根据本发明一个实施例的方法制备的Hydrogel支架、Hydrogel-DCM支架的生物相容性检测。图7A. 骨髓间充质干细胞（BMSCs）种植在支架 24 h 的活/死（Live/Dead）染色；图7B. 支架上 BMSCs 培养 72 h 的细胞骨架染色。i 和 ii：3D 图；iv和v：叠加图；vii和viii：局部放大图。
图8示出使用本发明说明书所描述的方法获得的人髌下脂肪间充质干细胞（ADSCs）三系分化能力检测的结果。
图9示出使用流式细胞术检测本发明说明书所描述的方法获得ADSCs 表面标志物。
图10示出人ADSCs来源的外泌体的鉴定。图10A. 透射电子显微镜观察；图10B. 纳米粒径分析，浓度（concentration），颗粒（particles），尺寸（size）（纳米（nm））；图10C. 外泌体标志物的蛋白质免疫印迹检测。
图11示出本发明一个实施例的支架中外泌体的分布与性能，图11A示出使用激光共聚焦显微镜观察外泌体在支架中的分布；图11B. 外泌体的3D分布效果；图11C. 外泌体的缓释曲线；n = 3。
图12 示出使用CCK-8 检测支架上 BMSCs 细胞活力的结果。n = 5, ** P <0.01, *** P < 0.001。
图13示出根据本发明的方法制作的各组支架上 BMSCs 体外成软骨分化的评估。图13A-图13D. 体外诱导成软骨分化 7d 和 14 d 软骨相关基因ACAN、COL II 、SOX9、 COLX的 mRNA 表达分析，n = 5；图13E. 诱导成软骨分化 14 d后 COL II 和SOX9 蛋白质表达检测，n = 3。* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001，相对倍数改变（relative foldchange）。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
一、实验方法
1.1 成软骨诱导分化
(1) 当第二代脂肪间充质干细胞 （ADSCs） 生长至 90% 密度时，加入 0.25% 胰蛋白酶消化液 2 mL，1‒2分钟（min）通过倒置显微镜下观察细胞形态。当发现细胞回缩、变圆、间隙变大和悬浮后，加入等体积完全培养基终止消化。
(2) 转移细胞悬液至离心管，800 转/min, 离心 5 min。
(3) 使用细胞自动计数仪对细胞悬液进行计数，并调整细胞密度至 1.0 × 107个/mL，取 5 μL细胞悬液轻轻滴加于 24 孔细胞培养板，37℃ 细胞培养箱中静置 4 小时（h）。
(4) 加入成软骨诱导分化完全培养基后放入 37℃ 细胞培养箱。每3天更换新鲜诱导分化培养基。
(5) 当诱导分化 21 天后，弃去培养基，使用 PBS 溶液小心洗涤后，加入 10% 中性甲醛固定 30 min。
(6) PBS 溶液小心洗涤 2 次，室温下阿利辛蓝染液染色 30 min。
(7) 吸走染液，PBS 冲洗 3 次。
(8) 显微镜下观察并拍照。
1.2 成骨诱导分化
(1) 当第二代 ADSCs 生长至 90% 密度时，加入 0.25% 胰蛋白酶消化液 2 mL，1‒2 min 通过倒置显微镜下观察细胞形态。当发现细胞回缩、变圆、间隙变大和悬浮后，加入等体积完全培养基终止消化。
(2) 转移细胞悬液至离心管，800 转/min, 离心 5 min。
(3) 使用细胞自动计数仪对细胞悬液进行计数，并调整细胞密度至 0.5 × 105个/mL，取 2 mL细胞悬滴 6 孔细胞培养板（提前用 0.1% 明胶进行包被处理），在37℃细胞培养箱中孵育 12 h 使细胞充分贴壁。
(4) 吸出培养基后使用 PBS 溶液洗涤 2 次，加入成骨诱导分化完全培养基后放入 37℃ 细胞培养箱。每 3 天换液 1 次。
(5) 当诱导分化 21 天后，弃去培养基，使用PBS溶液小心洗涤后，加入 10% 中性甲醛固定 30 min。
(6) PBS 溶液小心洗涤 2 次，室温下茜素红染液染色 30 min。
(7) 吸去茜素红染液，PBS 冲洗 3 次。
(8) 显微镜下观察并拍照。
1.3 成脂诱导分化
(1) 当第二代 ADSCs 生长至 90% 密度时，加入 0.25% 胰蛋白酶消化液 2 mL，1‒2 min 通过倒置显微镜下观察细胞形态。当发现细胞回缩、变圆、间隙变大和悬浮后，加入等体积完全培养基终止消化。
(2) 转移细胞悬液至离心管，800 转/min, 离心 5 min。
(3) 使用细胞自动计数仪对细胞悬液进行计数，并调整细胞密度至 0.5 × 105个/mL，取 2 mL细胞悬于 6 孔细胞培养板，在 37℃ 细胞培养箱中孵育12 h使细胞充分贴壁。
(4) 吸出培养基后使用 PBS 溶液洗涤 2 次，加入成脂肪诱导分化完全培养基 A液诱导分化 3 天后，更换为 B 液诱导分化1天。
(5) 使用 A 液和 B 液交替诱导 4 次，用 B 液继续培养 5 天，每 3 天更换。
(6) 当诱导分化 21 天后，弃去培养基，使用PBS溶液小心洗涤后，加入 10% 中性甲醛固定 30 min。
(7) PBS溶液小心洗涤 2 次，室温下油红 O 染液染色 30 min。
(8) 吸走油红 O 染液，PBS 冲洗 3 次。
(9) 显微镜下观察并拍照。
1.4 流式细胞术
(1) 当第二代 ADSCs 生长至 90% 密度时，使用 0.25% 胰蛋白酶消化液 2 mL消化细胞 1‒2 min，观察细胞形态，当发现细胞回缩、变圆、间隙变大和悬浮后，加入等体积完全培养基终止消化。
(2) 转移细胞悬液至离心管，按照 300 g/min 的转速, 离心 5 min。
(3) 加入 5 mL PBS 轻轻吹打细胞，重复步骤 (2)。
(4) 使用 400 μL PBS 重悬细胞，均按照 1：100 的比例分别加入CD29、CD34、CD45、CD90 和 CD105 抗体，避光孵育1 h。
(5) 300 g/min 的转速下离心 5 min，使用 400 μL PBS 重悬细胞。
(6) 使用细胞筛过滤细胞悬液为单细胞悬液，上机检测。
(7) 使用 FlowJo 软件对数据进行分析。
1.5统计学分析
采用 SPSS 22.0 软件进行统计学分析，结果以（均数 ± 标准差）表示。两组之间比较采用独立样本 T 检验分析。三组及以上比较时，先进行方差齐性检验，方差齐时采用单因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）；方差不齐时采用非参数检验。当 P < 0.05 时，认为结果具有统计学差异。
1.6 BMSCs 的原代分离和培养
取80‒100g 的雄性 SD 大鼠，处死后在 75% 酒精中浸泡 30 min。取膝关节处胫骨和股骨并暴露干骺端，使用注射器吸取 PBS 冲洗骨髓腔并收集骨髓抽吸物。采用 800rpm/min 的转速离心 5 min 后，加入MEM-α 完全培养基重悬底部细胞团，放入含有 5%CO2 的37℃ 细胞培养箱中静置培养 5 天，随后每 3 天更换一次培养基，1‒2 周可获得BMSCs。当细胞长至 80‒90% 密度后，按照1:3‒1:4的比例传代扩增细胞或者冻存。
1.7 外泌体的提取
提取 MSCs 来源的外泌体需要扩增足够的细胞，为了保证扩增效率和减少 MSCs的去分化，采用康宁公司的 Falcon 多层细胞培养瓶（875 cm2）扩增三种MSCs。当细胞长至约80% 密度时，弃去培养上清，使用 PBS 洗 2 遍后，更换含5% 无外泌体 FBS 的MEM-α培养基继续培养 48 h, 收集细胞上清即条件培养基。随后条件培养基按以下步骤处理：
(1) 条件培养基在300 × g离心10 min，收集上清。
(2) 2,000 × g 离心10 min，收集上清。
(3) 10,000 × g离心 30 min，收集上清。
(4) 应用切向流技术，采用含有 100 kDa 分子量界限的过滤膜系统（CentriconPlus-70，Millipore），上清在3,500 × g条件下离心浓缩。
(5) 使用 0.22 μm 孔径的滤器过滤上清。
(6) 4℃，100,000 × g离心2 h，小心吸出上清，预冷的 PBS 重悬沉淀。
(7) 4℃，100,000 × g离心2 h，小心吸出 PBS，加入100‒200 μL预冷的 PBS 重悬底部沉淀，分装后冻存于 ‒80℃ 保存。
1.8 外泌体的鉴定
1.8.1透射电子显微镜观察
取 10 μL 新鲜分离的外泌体，PBS 稀释后滴加到铜网上，用 2% 磷钨酸室温负染2 min。采用JEOL -1400透射电子显微镜（JEOL, Tokyo, Japan）进行观察。
1.8.2 纳米粒径分析
使用NanoSight NS300系统（Malvern Instruments）通过纳米颗粒跟踪分析来确定外泌体的大小和浓度。取 2 μL 新鲜分离的外泌体，PBS 稀释到 1 mL 置于注射器中，自动机械泵匀速将样品注入仪器，通过颗粒的布朗运动进行追踪分析计算纳米颗粒的大小及浓度。
1.8.3 蛋白质免疫印迹实验
（1）细胞和外泌体蛋白质样品的制备
细胞蛋白质提取：细胞在直径 10 cm 的细胞培皿生长至 90% 密度时，弃去上清，预冷的 PBS 洗涤 2 遍后，使用移液器将残留的 PBS 充分吸净，在冰上加入含有蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解液，迅速用细胞刮刀收集裂解产物。冰上孵育 30 min 后, 于 4℃、10,000 × g条件下离心15 min，所获上清即细胞的蛋白质提取物。
外泌体蛋白质提取：将外泌体和含有蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解液按照 1:1 的体积比混匀，冰上孵育 30 min 后, 于 4℃、10,000 × g条件下离心15 min，所获上清即外泌体的蛋白质提取物。
（2）蛋白质浓度测定
使用 BAC 法测定蛋白质浓度，按照Thermo公司蛋白定量试剂盒（BCA 法）说明书进行，具体如下：
1）工作液配制：将试剂 A 和试剂 B 按照 50:1 的体积比混匀制备工作液。工作液需要现用现配。
2）标准品溶液配制：使用 PBS 和蛋白质标准品溶液（2000 μg/mL），通过稀释法获得不同浓度（1500、1000、750、500、250、125和0 μg/mL）的标准品溶液。取各浓度标准品25 μL加入96 孔板中。
3）取各样品 2.5 μL 加入96 孔板中，加入 PBS 补充样品体积至25 μL。
4）将 200 μL 工作液加入 96 孔板中，轻轻混匀，避免气泡。
5）37℃ 恒温箱内避光孵育 30 min。
6）通过多功能酶标仪检测 562 nm 波长处的吸光度值。
7）根据各标准品溶液的浓度和所测得的吸光度值建立标准曲线，通过标准曲线计算各样品的蛋白质浓度。
（3）蛋白质免疫印迹实验
1）制作 10% 分离胶，各成分比例如下：
30% 丙烯酰胺溶液
3.3 mL
分离胶缓冲液
2.5 mL
ddH<sub>2</sub>O
4.1 mL
10% APS
0.1 mL
TEMED
4 μL
混合均匀后将分离胶灌入干净的玻璃板之间中，加入的ddH2O使分离胶水平。室温静置 30 min 后，水和分离胶之间可见明显的分界线。
2）制作 5% 浓缩胶，各成分比例如下：
30% 丙烯酰胺溶液
0.68 mL
浓缩胶缓冲液
1.0 mL
ddH<sub>2</sub>O
2.28 mL
10% APS
40 μL
TEMED
4 μL
小心弃去分离胶上层的ddH2O，加入浓缩胶至玻璃板顶部，插入梳子，室温静置 30min 后拔去梳子。
3）上样：在电泳槽中加入 1 × 电泳缓冲液后，根据所测的蛋白质浓度将等量的蛋白样品加入到浓缩胶各孔中，预染蛋白质 marker上样 6 μL。
4）电泳：使用 80 V 恒压电泳，待样品进入分离胶以后，调整至 120 V 电压继续电泳，溴酚蓝到达分离胶底部时候结束电泳。
5）拆胶：取下并小心去除一侧玻璃板，切除浓缩胶和分离胶无样品部分，切角标记。
6）转膜：测量剩余胶的大小，按照相应尺寸剪裁一张 PVDF 膜，并在甲醇中浸泡 3min 平衡PVDF 膜，按照“黑胶白膜”顺序放置在电转槽中。接通电源，设置电流大小为250mA 恒流，冰浴或者 4℃ 转膜 2 h。
7）封闭和一抗孵育：将膜在 TBST 中漂洗 3 次，用 5% 脱脂奶粉或 5% BSA 室温条件下封闭 1 h后加入一抗，放于摇床4℃ 过夜。
8）二抗孵育：室温下 TBST 漂洗 3 次，每次 10 min，加入二抗，室温孵育 1 h。
9）发光：室温下 TBST 漂洗 3 次，每次 10 min，滴加适量发光液进行化学显色，采集图像。
二、实施例：使用3D打印制备含有外泌体的支架及其性能检测方法
2.1 实验动物
本发明遵循美国国立卫生研究院出版的《The Guide for the Care and Use ofLaboratory Animals》（1996 版）进行，动物实验方案经过北京大学医学部动物伦理委员会批准。
2.2 MSCs 的分离和培养
2.2.1 大鼠 BMSCs 的分离和鉴定
使用 1.6描述的方法分离和鉴定的大鼠 BMSCs。
2.2.2 人 ADSCs 分离、培养和鉴定
人脂肪组织标本的取材及实验方案通过北京大学第三医院医学伦理委员会批准。患者签署知情同意书。人脂肪组织标本来自关节镜下行膝关节交叉韧带重建术中废弃的髌下脂肪垫组织。获得组织后立即放入无菌生理盐水中，使用临床标本专用低温冰盒送至实验室进行原代细胞培养。对第2代 ADSCs 细胞进行三系分化（参见 1.1-1.3）和流式细胞术（参见1.4）鉴定。
2.3 外泌体的提取和鉴定
参见 1.7 和 1.8。
2.4 材料制备和表征
2.4.1 明胶-甲基丙烯酸酐制备
（1）称量 6 g 的明胶加入 60 mL 体积的 PBS 中，置于 50℃ 水浴中搅拌溶解。
（2）使用移液器逐滴滴加甲基丙烯酸酐 300 μL。
（3）50℃ 水浴中避光持续搅拌 1 h。
（4）加入200 mL 37℃的 PBS 终止反应，快速搅拌 10 min。
（5）转移到透析袋后封口，放入含有 ddH2O 的大烧杯 37℃ 烘箱中透析 3 天，每间隔 12 h 更换 ddH2O。
（6）冷冻干燥后于 ‒20℃ 保存备用。
2.4.2 氧化透明质酸制备
（1）称量 1 g 的透明质酸，加入到 100 mL 体积的 ddH2O 中，室温磁力搅拌溶解。
（2）称量 550 mg 的高碘酸钠，溶于5 mL体积的 ddH2O 中。
（3）使用移液器将高碘酸钠溶液逐滴加入透明质酸溶液中，室温搅拌 2 h。
（4）转移到透析袋后封口，放入含有 ddH2O 的大烧杯透析 3 天，每间隔 12 h 更换ddH2O。
（5）冷冻干燥后于 ‒20℃ 保存备用。
2.4.3 透明质酸-多巴胺制备
（1）称量 1 g 的透明质酸，加入到 100 mL 体积的 ddH2O 中，室温磁力搅拌溶解。
（2）加入 575 mg 的EDC，345 mg 的NHS，室温搅拌 20 min。
（3）加入 569 mg 的盐酸多巴胺，避光搅拌 3 h，在此期间需维持 pH在 5‒6 范围内，随后继续反应 21 h。
（4）装入透析袋并封口，使用 pH 为 3‒4的 ddH2O 透析 2 天后，继续用 ddH2O 透析 1 天，期间每间隔 12 h 更换ddH2O。
（5）冷冻干燥后于 ‒20℃ 保存备用。
2.4.4 核磁共振波谱检测
使用重水分别配制 1% 明胶、1% GelMA、0.8% HA、0.8% OHA和 0.8% HA-DA的水凝胶，充分搅拌均匀后，移入圆柱形核磁共振波谱（nuclear magnetic resonance，NMR）玻璃样品管中，注意避免气泡，上机检测。
2.5 脱细胞基质制备
使用 6 月龄大的猪股骨的新鲜标本，剔除周围的脂肪、肌肉、筋膜等软组织。按照如下方法分别制备软骨脱细胞基质（decellular cartilage matrix, DCM）。
2.5.1 软骨脱细胞基质制备
（1）使用外科手术刀片小心切取股骨远端滑车处的软骨，切成厚度约 1 mm 的软骨片，注意不要切取到软骨下骨。
（2）将软骨片置于 50 mL 离心管，液氮冷冻后 37℃ 水浴，进行 6 个循环。
（3）37℃ 条件下，0.25% 胰蛋白酶溶液（含 EDTA）洗涤 4 次，每次 6 h。
（4）37℃ 条件下，含10 mM Trizma-HCl、DNase（50 U/mL）和 RNase A（1 U/ mL）的DPBS洗涤 4 h。
（5）10 mM Trizma-HCl 洗涤 24 h。
（6）含 0.5% SDS 的 DPBS 洗涤 24 h。
（7）含 1% Triton X-100的DPBS 溶液洗涤 24 h。
（8）DPBS 洗涤，直至泡沫消失。
（9）冷冻干燥，球磨仪磨成粉末，‒20℃ 保存备用。
2.6 脱细胞基质的表征
2.6.1 组织切片 H&E 染色
(1) 脱蜡和水化：
二甲苯替代物 I
10 min
二甲苯替代物 II
10 min
二甲苯替代物 III
10 min
无水乙醇 I
5 min
无水乙醇 II
5 min
95%乙醇
5 min
85%乙醇
5 min
75%乙醇
5 min
蒸馏水
3 min
(2) 染色:
1) 苏木精染色 4 min，蒸馏水洗去浮色。
2) 在 1% 盐酸乙醇分化液中分化 10 s，蒸馏水冲洗。
3) 在 0.5‒1% 氨水观察返蓝 10秒（s），蒸馏水冲洗。
4) 伊红染色 40 s，蒸馏水洗去浮色。
(3) 脱水透明：
95%乙醇脱水 I
20 s
95%乙醇脱水 II
20 s
无水乙醇脱水 I
20 s
无水乙醇脱水 II
20 s
染色后二甲苯替代物透明I
3 min
染色后二甲苯替代物透明II
3 min
(4) 中性树胶封片，晾干后显微镜下观察并拍照。
2.6.2 组织切片 DAPI 染色
（1）脱蜡和水化：参见 2.6.1。
（2）DAPI 染色：将 DAPI 染色液滴加于标本处，室温下避光孵育 10 min。
（3）PBS 洗涤 3 次，每次 3 min。
（4）封片后使用荧光显微镜拍摄图像。
2.6.3 DNA含量检测
（1）木瓜蛋白酶裂解液配制：木瓜蛋白酶 125 μg/mL，5 mM Na2-EDTA，5 mM L-半胱氨酸盐酸，0.1 M 乙酸钠，调整 pH 到 6.2。
（2）分别取 10 mg 冷冻干燥后的正常软骨、DCM 粉末添加到 1 mL 木瓜蛋白酶裂解液中，置于 60℃ 烘箱中裂解 24 h。
（3）取200 μL Hoechst 33258 工作液（2 μg/ml）加入 96 孔板，随后每孔加入 20uL 样品裂解液或者各浓度的小牛胸腺 DNA 标准品，于 37℃ 孵箱避光孵育 1 h。
（4）取 100 μL 混合液加入 96 孔板，使用多功能酶标仪检测荧光值（激发光为360 nm，发射光为 460 nm）。
（5）绘制 DNA 标准曲线，计算各样本的 DNA 浓度。
2.6.4 GAG 含量检测
（1）将 200 μL 体积的 1,9-二甲基亚甲蓝（DMMB）溶液加入 96 孔板，加入 20 μL体积的上述样品裂解液或者不同浓度的硫酸软骨素标准品，充分混匀。
（2）于室温避光孵育 30 min。
（3）使用多功能酶标仪上检测 525 nm 处的吸光度值。
（4）绘制标准曲线，计算各样本的 GAG 浓度。
2.6.5 羟脯氨酸含量检测
使用南京建成生物工程研究所生产的羟脯氨酸检测试剂盒，通过测定羟脯氨酸含量评估脱细胞前后胶原含量的改变。羟脯氨酸在氧化剂作用下生成的氧化产物可以与二甲氨基苯甲醛反应呈现紫红色，根据其吸光度值推算含量。
（1）按照说明书操作配制试剂一、试剂二和试剂三。
（2）分别取 200 μL 的 ddH2O、标准品和上述各样品裂解液加入含有 100 μL 试剂一的 EP 管中，混匀后静置 10 min。
（3）加入 100 μL 试剂二，混匀后静置 5 min。
（4）加入 100 μL 试剂三，混匀后 60℃ 水浴加热 15 min。
（5）3500 rpm/min，离心 10 min。
（6）取 100 μL 上清加入 96 孔板，使用多功能酶标仪检测波长 550 nm 处的吸光度值。
（7）根据标准品浓度计算样品中羟脯氨酸含量。
2.6.6 成胶能力检测
（1）DCM 墨水配制：
1）称取 15 mg 的胃蛋白酶加入 5 mL 的 0.1 M盐酸溶液中，室温搅拌 30 min。
2）称取 150 mg 的 DCM 粉末，加入上述含有胃蛋白酶的盐酸溶液，室温密封搅拌72 h 获得 DCM 墨水。
3）将 DCM墨水置于冰上，使用氢氧化钠溶液小心调整 pH 至 7.4，需要注意少量多次添加，避免 pH 至 7.4 以上。
（2）将适量的 DCM墨水加入到玻璃管中，放入37℃ 孵箱孵育 30 min 后，倒置观察是否成胶并拍照。
（3）使用流变仪检测 DCM 墨水随着温度改变弹性模量 G’ 和粘性模量 G”的动态变化。
2.7 支架的打印和表征
2.7.1 水凝胶生物墨水制备
（1）Hydrogel 生物墨水的配制：
1）称取 0.9 g GelMA 加入 5 mL的 ddH2O 中, 37℃ 搅拌溶解后加入 0.2 gOHA，继续搅拌溶解。
2）称取0.2 g HA-DA 和 0.04 g 光引发剂，加入5 mL的双蒸水（ddH2O）中，室温搅拌溶解。
3）将上述两种溶液混合均匀获得 Hydrogel 生物墨水。
（2）Hydrogel-DCM 生物墨水的配制：
1）称取 0.9 g GelMA 加入 5 mL 的 ddH2O 中, 37℃ 搅拌溶解后加入 0.2 gOHA，继续搅拌溶解。
2）按2.6.6所述方法配制 4% 的 DCM墨水5 mL，调整 pH 至 7.4后，加入 0.2 gHA-DA 和 0.04 g 光引发剂，室温搅拌溶解。
3）将上述两种溶液混合均匀获得 Hydrogel-DCM 墨水生物墨水，上述两种溶液的配置没有先后顺序。
（3）Hydrogel-DCM-Exos 生物墨水的配制：Hydrogel-DCM 生物墨水的配制好后加入 ADSCs 外泌体，终浓度为 100 μg/mL。
为了研究不同变量浓度对生物墨水的影响，发明人在这个实例的基础上进行了若干组对照试验，试验变量的具体变化如下表所示：
变量名称
第一组
第二组
第三组
单位
GelMA
6%
9%
12%
质量百分比
OHA
0.50%
2%
4%
质量百分比
HA-DA
0.50%
2%
4%
质量百分比
DCM
0.50%
2%
4%
质量百分比
光引发剂
0.10%
0.20%
0.40%
质量百分比
外泌体终浓度
10
100
1000
μg/mL
每个变量选择一个具体数值，作为一个实验组，例如：
GelMA（6%）、OHA（0.5%）、HA-DA(0.5%)、 DCM(0.5%)、光引发剂(0.1%)、以及终浓度为 10 μg/mL的间充质干细胞外泌体作为一个实验组，以此类推，共计729个具体实验方案，实验结果表明，这些实验方案均可以获得用于3D打印的生物墨水，使用这些生物墨水可以得到用于骨损伤的支架，性能测试结果与前述实例类似，实验结果重复较多，不再赘述。
2.7.2 支架的打印
使用 3D-Bioplotter（EnvisionTEC）生物打印机进行支架打印。设置层高、线宽和线间距均为 320 μm，打印压力为 2.5‒3.5，打印速度为8‒15 mm/s，平台温度10℃，墨水舱温度18‒22℃。体外实验各支架打印 6 层。将打印好的支架置于冰上，UV 照射 20 min 以充分交联。
2.7.3 支架的表征
（1）扫描电子显微镜观察
1）对 Hydeogel、Hydeogel-DCM支架进行冷冻干燥。
2）将三种支架置于黑色导电胶上，对表面进行喷金处理。
3）使用扫描电子显微镜（JSM-7900F，JEOL，日本）对支架的微观结构进行观察和拍摄。
（2）傅里叶红外光谱分析
1）将明胶、GelMA、HA、OHA、HA-DA、DCM和 Hydeogel、Hydeogel-DCM两种支架冷冻干燥后研碎成粉末。
2）按照 1:100 的质量比与溴化钾固体混合，充分研磨后压制成薄片。
3）采用 4000-400 cm-1 范围的扫描波数和 4 cm-1 的扫描精度，通过傅里叶红外光谱分析蛋白质的二级结构。
（3）支架的降解速率检测
1）打印同样尺寸的各种支架，冷冻干燥后，称量各个支架的干重为Wi。
2）将支架分别放入含有 1 mL PBS 的圆底离心管中，置于 37℃ 和 30 rpm/min转速的孵育摇床内。
3）每间隔 3 天更换 PBS，在预定时间取出支架，ddH2O 洗涤 2 次，冷冻干燥后测量支架称重为 Wt。
4）降解率 = (Wt- Wi)/Wi × 100%。
（4）支架的溶胀率检测
打印同样尺寸的各种支架，滤纸吸去表面水分称重为 Wi。放入含有 1 mL PBS的圆底离心管中，置于 37℃ 培养箱中孵育。在预定时间取出支架，ddH2O 洗涤 2 次，滤纸吸去表面水分后称重为 Wt。溶胀率 = (Wt- Wi)/Wi × 100%。
（5）外泌体的释放
将同样尺寸称重后的 Hydeogel-DCM、Hydrogel-DCM-Exos、支架置于不同的Transwell 上室（8 μm），在下室加入 150 μL 的PBS，放入 37 ℃的培养箱中孵育。在预定时间从下室取出 15 μL PBS并加入等体积 PBS。使用 micro BCA 试剂盒测量各时间点取出的 PBS 的蛋白质含量，进而计算外泌体的释放百分比。
2.8 支架的生物相容性
2.8.1 细胞种植于支架上
（1）将经过 UV 照射后的支架放入含 10% 无外泌体 FBS 的 MEM-α 完全培养基中于 37℃ 细胞培养箱孵育 24 h。
（2）取第 3 代大鼠 BMSCs, 0.25% 胰蛋白酶溶液消化约 2 min，在800 rpm/min条件下离心 3 min，使用含 10% 无外泌体 FBS 的 MEM-α 完全培养基重悬细胞。
（3）调整细胞悬液密度为 1 × 107/mL，取 100 μL 滴加到支架上，置于 37℃ 细胞培养箱孵育 4 h，更换培养基，继续培养或者诱导分化。
2.8.2 细胞在支架上的活性
（1）按照上述 2.8.1 描述将细胞种植在支架后，继续培养 24 h。
（2）配制 Live/Dead 细胞活性检测工作液：取 1 μL 体积的 Live 试剂混入 499ul 的 PBS 中，取 1 μL 体积的 Dead 试剂混入 499 ul的另一份 PBS 中，混合均匀后即Live/Dead 工作液。Live/Dead 工作液现用现配。
（3）用 PBS 洗涤支架 2 次，转移支架到共聚焦培养皿，加入 1 mL Live/Dead 工作液，置于 37℃ 细胞培养箱孵育 15 min。
（4）弃去工作液，用 PBS 洗涤支架 2 次，使用激光共聚焦显微镜观察支架上活细胞（绿色荧光）和死细胞（红色荧光）分布。
2.8.3 细胞在支架上的形态
（1）按照上述 2.8.1 描述将细胞种植在支架后，继续培养 72 h。
（2）弃去上清，用 4% 多聚甲醛固定细胞 15 min，PBS 冲洗 3 次，每次 5 min。
（3）用罗丹明‒鬼笔环肽对细胞骨架染色15 min，PBS 冲洗 3 次，每次 5 min。
（4）使用 Hoechst 33342对细胞核染色15 min，PBS 冲洗 3 次，每次 5 min。
（5）通过激光共聚焦显微镜观察并拍照。
2.8.4 细胞在支架上的增殖能力检测
（1）按照上述 2.8.1 描述将细胞种植在支架后，更换含 10% 无外泌体 FBS的MEM-α 完全培养基继续培养。
（2）于1 d、3 d、5 d 和 7 d后分别取出支架，PBS 冲洗 3 次，置于新的 24 孔细胞培养板中。
（3）每孔加入 1 mL含 10% 的 CCK-8 试剂的 MEM-α 培养基（现用现配），于 37℃细胞培养箱孵育 2 h。
（4）取 100 μL 体积的孵育液置于 96 孔细胞培养板，使用酶标仪测定 450 nm波长处的吸光度值。
2.9 细胞在支架上的成软骨和成骨诱导分化
将 BMSCs 种植于支架后培养 3 d后，PBS 洗涤 2 遍，更换成软骨诱导分化完全培养基或者成骨诱导分化完全培养基（使用无外泌体的 FBS）分别诱导 7 d 和 14 d。随后进行下一步相关检测。
2.9.1 qRT-PCR 检测
采用 qRT-PCR 检测成软骨和成软骨相关基因 mRNA 表达。在成软骨或者成骨诱导 7 d 和 14 d 后，取出支架用 PBS 洗涤 2 次，放入 EP 中并加入 0.5 mL 体积的TRIzol 试剂，充分剪碎后置冰上 30 min，每间隔 10 分钟震荡，进行后续操作，或者保存于 ‒80℃ 备用。详细方法其他参见 3.2.11。
2.9.2 细胞免疫荧光检测
在成软骨或者成骨诱导分化 14 d 后，采用细胞免疫荧光检测成软骨和成软骨相关基因蛋白质表达。
三、3D打印制备的含有外泌体的支架的实验结果
3.1 1H NMR 波谱分析
在明胶衍生物 GelMA 和透明质酸衍生物 OHA、HA-DA 合成后，通过 1H NMR 波谱分析各中材料的波普变化。由图1A可见， GelMA 在 5.3 和 5.5 ppm 位置出现新信号，代表丙烯酸成功与明胶结合；在 2.9 ppm 处峰值降低和1.8 ppm位置出现的新信号代表了甲基的结合，证明本发明中 GelMA 的成功合成。如图1B 所示，OHA 中 4.9 和 5.0 ppm 处出现的新信号代表醛基结合到 HA，说明 OHA 合成成功；HA-DA 在 6.7 ppm 位置出现的新信号代表苯环的信号，2.76 ppm出现新信号表示临近苯环的 -CH2 基团，证明了多巴胺与 HA成功结合形成 HA-DA 。
3.2 脱细胞基质的表征
收集关节软骨，经过脱细胞处理，获得软骨脱细胞基质 DCM 。大体积观察发现，DCM 相比脱细胞之前的正常软骨而言，整体较薄、较透亮（图2）。通过 H&E 染色可见DCM 无细胞和细胞碎片残留，而 DAPI 染色证明了 DCM 中的细胞核均消失不见（图2），说明脱细胞过程有效去除了软骨的细胞成分。DNA 含量检测结果显示，DCM 中DNA 含量分别为 14.2± 1.7 ng/mg （图3A），均低于脱细胞基质生物材料 50 ng/mg 的标准。为了进一步评估脱细胞过程对软骨和骨组织成分的影响，本课题分别检测了 GAG 和胶原蛋白在两种组织脱细胞前后的含量。结果显示，DCM中 GAG 含量分别是正常软骨组织中 GAG 含量的 28.7%（图3B），而 DCM中胶原含量分别是正常软骨组织中胶原含量的 77.7% （图3C）。
脱细胞基质材料生物墨水在 37℃ 可以发生自组装形成胶状物并维持形状。随后，本发明在冰上调节 DCM 生物墨水预凝胶的 pH 至中性，随后放入 37℃ 孵箱 30 min后，观察到 DCM 脱细胞基质均形成胶状物，倒置后基本可以维持形态（图4A）。随后，本发明采用流变仪进一步检测两种脱细胞基质生物墨水预凝胶的弹性模量 G’和粘性模量 G” 随着温度改变的动态变化。结果显示，在 15℃ 以下时，DCM 预凝胶表现得更像液态物质，15℃ 后弹性模量 G’ 开始明显升高，而 37℃ 孵育一段时间后，流变性能表现为类似交联凝胶，弹性模量 G’显著高于粘性模量 G”（图4B）。
3.3 支架的表征
3.3.1支架的微观结构
各种生物墨水体系中 GelMA 占主要比例，因此均具有良好的可打印性能。打印的支架经过冷冻干燥后，通过扫描电子显微镜观察脱细胞基质对生物支架微观形貌的影响（图5）。由 GelMA、HA-DA 和 OHA 三种成分生物墨水打印出的 Hydrogel 支架线条表面比较光滑，可见凹凸起伏状形貌，而加入脱细胞基质后，支架线条内可见明显的孔隙结构。说明DCM 的添加可以显著改善支架线条的内部孔径，实现 3D 打印支架的“框架大孔”和“线条小孔”相结合。
3.3.2 支架的降解速率、溶胀检测和红外光谱
如图6A所示，Hydrogel水凝胶支架、Hydrogel-DCM水凝胶支架的72 h 达到吸水量的平衡状态，吸水率分别为 221.0%和187.8% ，表明 DCM 的添加可以而降低水凝胶的溶胀率。Hydrogel、Hydrogel-DCM 水凝胶支架在 28 天的降解率分别为 77.9%和64.1%（图6B），表明脱细胞基质的添加可以延缓支架的降解。采用傅里叶变换红外光谱对本发明各种组分及打印的水凝胶支架进行了表征（图 6C），以确定支架的化学成分及结构变化。其中，1652cm-1 处峰代表酰胺（Amide）I 区间的 C=O，1534 cm-1处峰代表 Amide II 区间的 N-H，1230 cm-1 处峰代表 Amide III 区间的 C-N。在 OHA 中可见 1735 cm-1 处出现信号峰，代表 -CHO 的引入，而在 Hydrogel、Hydrogel-DCM 中该处信号峰均消失，提示 -CHO 和 -NH2 发生席夫碱反应，形成动态共价键网络。
3.4 支架的生物相容性
将 BMSCs 种植于 Hydrogel支架和Hydrogel-DCM 支架上，孵育 24 h后，对各组支架进行 Live/Dead 染色（图7A）。通过激光共聚焦显微镜观察发现，两种支架上的 BMSCs绝大多数表现活细胞，仅仅可见个别死细胞。个别死细胞的出现符合细胞的正常生长周期。由此可见，两种支架均未发现明显的细胞毒性。
为了进一步观察 BMSCs 在支架上的分布情况和形态特征，本发明采用罗丹明‒鬼笔环肽和 DAPI 分别对细胞骨架和细胞核进行染色。激光共聚焦显微镜下观察发现，BMSCs种植于支架培养 3 d 后，含有脱细胞基质的 Hydrogel-DCM支架上细胞沿支架线条分布均匀，细胞骨架呈现出方向一致的走形；而在 Hydrogel 支架，细胞沿支架分布出现聚集情况，细胞骨架形态相对杂乱（图7B）。以上结果提示脱细胞基质成分可以明显改善细胞在支架上的延展性能，促进细胞在立体微环境的均匀分布。
3.5 人 ADSCs 的鉴定
为了验证本发明中所提取的人髌下脂肪垫来源的 ADSCs 是否为 MSCs，本发明进行了三系诱导分化试验和流式细胞术。如图8所示，油红O、茜素红和阿利新蓝染色阳性分别说明 ADSCs 具有成脂、成骨和成软骨分化能力，提示具备 MSCs 的多向分化潜能。流式细胞术检测细胞表面标志物发现 CD34、CD45 和 HLA-DR 阳性率分别为 2.3%、2.1% 和1.8%，均为阴性表达；而 CD29、CD73、CD90 和 CD105 阳性率分别为 99.9%、100%、99.8% 和99.9%，呈强阳性表达（图9）。以上结果说明本发明提取的人髌下脂肪垫来源的 ADSCs 符合MSCs 特征。
3.6 人 ADSCs 来源的外泌体的鉴定
收集人 ADSCs 的细胞培养上清，通过差异离心法分离获得其外泌体。透射电子显微镜检测显示具有外泌体典型的“杯口状”或“圆盘状”结构（图10A）。纳米粒径分析检测发现提取的外泌体直径主要分布在 160 nm 以下，平均直径为 140.3 nm （图10B），蛋白质免疫印迹实验结果显示分离的人 ADSCs 外泌体高表达外泌体特异性蛋白质标志物 CD81、TSG101 和 ALIX，而内质网特异性蛋白质标志物 Calnexin 表达量很低（图10C）。
3.7 外泌体在脱细胞基质支架中的分布和缓释
随后，本发明将人 ADSCs 的外泌体添加到含有脱细胞基质的生物墨水中，旨在通过外泌体进一步增强含有脱细胞基质支架的生物学功能。通过激光共聚焦显微镜观察发现，被 PKH67荧光染料标记的外泌体沿着支架线条均匀分布，而线条之间的黑色孔隙间接证明了所观察到支架线条为外泌体发出的荧光（图11A和图11B）。通过缓释曲线可见，Hydrogel-DCM-Exos 和 Hydrogel-DCM-Exos 两种外泌体支架均可以稳定释放外泌体长达24天以上（图11 C）。
3.8 外泌体脱细胞基质支架对 BMSCs 活力的影响
将 BMSCs 种植于支架上 1、3、5、7 天后，采用 CCK-8 检测各组支架对细胞活力的影响，以第 1 天细胞活力作为参考。结果显示，各组支架均未见细胞毒性。第 7 天时，加入脱细胞基质的支架 Hydrogel-DCM上 BMSCs 的细胞活力显著高于 Hydrogel 组（P <0.01），而含外泌体的 Hydrogel-DCM-Exos 支架上BMSCs的细胞活力显著高于其他组（P <0.001）（图12）。证明了脱细胞基质和外泌体的添加产生了协同效应，增加了支架的生物相容性。
3.9 不同支架上 BMSCs 的体外诱导分化
3.9.1 支架上 BMSCs 的成软骨分化
为了评估 Hydrogel、Hydrogel-DCM 和 Hydrogel-DCM-Exos 三种支架体外促进BMSCs 成软骨分化的效果，将BMSCs种植在支架培养 3 天后，进行成软骨诱导分化。通过qRT-PCR 检测软骨相关基因的 mRNA 在各种支架的表达情况（图13A、图13B、图13C、图13D）。诱导 7 天后，Hydrogel-DCM-Exos 组中 ACAN、COL II 和 SOX9 的表达在三组中均最高，但仅与 Hydrogel 组之间的差异具有统计学意义（P < 0.01）。诱导 14 天后，ACAN、COL II 和 SOX9 的表达在三组中进一步升高，且在 Hydrogel-DCM-Exos 组和 Hydrogel-DCM 组表达明显高于 Hydrogel 组，三组间差异均具有统计学意义。对于肥大软骨细胞标志物 COL X，诱导 14 天后可见 Hydrogel-DCM-Exos 组和 Hydrogel-DCM 组中表达均显著低于Hydrogel 组（P < 0.01）（图13D）。细胞免疫荧光结果显示，诱导 14 天后COL II蛋白质的表达在 Hydrogel-DCM-Exos 组最高， Hydrogel-DCM 组次之，而 Hydrogel 组最低（图13E），与 mRNA 的表达结果相一致。对于 SOX9 而言，虽然 Hydrogel-DCM-Exos组和Hydrogel-DCM 组之间未见明显的表达差异，但是均高于 Hydrogel 组中 SOX9 的表达（图13E）。以上结果表明，在 MSCs 成软骨诱导分化方面，添加了软骨脱细胞基质的 Hydrogel-DCM 支架效果好于 Hydrogel 支架，而外泌体的添加进一步提升了支架的促进软骨再生的功能。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
- 上一篇：石墨接头机器人自动装卡簧、装栓机
- 下一篇：一种脂肪源性干细胞的培养方法
