具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

一、实验方法

1.1 成软骨诱导分化

(1) 当第二代脂肪间充质干细胞（ADSCs）生长至 90% 密度时，加入0.25% 胰蛋白酶消化液2 mL，1‒2分钟（min）通过倒置显微镜下观察细胞形态。当发现细胞回缩、变圆、间隙变大和悬浮后，加入等体积完全培养基终止消化。

(2) 转移细胞悬液至离心管，800 转/min, 离心5 min。

(3) 使用细胞自动计数仪对细胞悬液进行计数，并调整细胞密度至 1.0 × 10⁷个/mL，取 5 μL细胞悬液轻轻滴加于 24 孔细胞培养板，37℃细胞培养箱中静置4小时（h）。

(4) 加入成软骨诱导分化完全培养基后放入37℃细胞培养箱。每3天更换新鲜诱导分化培养基。

(5) 当诱导分化21天后，弃去培养基，使用PBS溶液小心洗涤后，加入10%中性甲醛固定30 min。

(6) PBS溶液小心洗涤2次，室温下阿利辛蓝染液染色30 min。

(7) 吸走染液，PBS冲洗3次。

(8) 显微镜下观察并拍照。

1.2 成骨诱导分化

(1) 当第二代ADSCs生长至 90% 密度时，加入0.25%胰蛋白酶消化液2 mL，1‒2min通过倒置显微镜下观察细胞形态。当发现细胞回缩、变圆、间隙变大和悬浮后，加入等体积完全培养基终止消化。

(2) 转移细胞悬液至离心管，800 转/min, 离心5 min。

(3) 使用细胞自动计数仪对细胞悬液进行计数，并调整细胞密度至 0.5 × 10⁵个/mL，取 2 mL细胞悬滴 6 孔细胞培养板（提前用 0.1% 明胶进行包被处理），在37℃细胞培养箱中孵育 12 h 使细胞充分贴壁。

(4) 吸出培养基后使用 PBS 溶液洗涤 2 次，加入成骨诱导分化完全培养基后放入 37℃ 细胞培养箱。每 3 天换液 1 次。

(5) 当诱导分化 21 天后，弃去培养基，使用PBS溶液小心洗涤后，加入10%中性甲醛固定30 min。

(6) PBS 溶液小心洗涤2次，室温下茜素红染液染色30 min。

(7) 吸去茜素红染液，PBS冲洗3次。

(8) 显微镜下观察并拍照。

1.3 成脂诱导分化

(1) 当第二代ADSCs生长至90%密度时，加入0.25%胰蛋白酶消化液2 mL，1‒2 min通过倒置显微镜下观察细胞形态。当发现细胞回缩、变圆、间隙变大和悬浮后，加入等体积完全培养基终止消化。

(2) 转移细胞悬液至离心管，800 转/min, 离心5 min。

(3) 使用细胞自动计数仪对细胞悬液进行计数，并调整细胞密度至0.5 × 10⁵个/mL，取2 mL细胞悬于 6 孔细胞培养板，在 37℃ 细胞培养箱中孵育12 h使细胞充分贴壁。

(4) 吸出培养基后使用 PBS 溶液洗涤2次，加入成脂肪诱导分化完全培养基 A液诱导分化 3 天后，更换为 B 液诱导分化1天。

(5) 使用 A 液和 B 液交替诱导 4 次，用B液继续培养5天，每3天更换。

(6) 当诱导分化21天后，弃去培养基，使用PBS溶液小心洗涤后，加入 10% 中性甲醛固定 30 min。

(7) PBS溶液小心洗涤2次，室温下油红O染液染色30 min。

(8) 吸走油红 O 染液，PBS 冲洗 3 次。

(9) 显微镜下观察并拍照。

1.4 流式细胞术

(1) 当第二代 ADSCs 生长至 90% 密度时，使用 0.25% 胰蛋白酶消化液 2 mL消化细胞 1‒2 min，观察细胞形态，当发现细胞回缩、变圆、间隙变大和悬浮后，加入等体积完全培养基终止消化。

(2) 转移细胞悬液至离心管，按照 300 g/min 的转速, 离心 5 min。

(3) 加入 5 mL PBS 轻轻吹打细胞，重复步骤 (2)。

(4) 使用 400 μL PBS 重悬细胞，均按照 1：100 的比例分别加入CD29、CD34、CD45、CD90 和 CD105 抗体，避光孵育1 h。

(5) 300 g/min 的转速下离心 5 min，使用 400 μL PBS 重悬细胞。

(6) 使用细胞筛过滤细胞悬液为单细胞悬液，上机检测。

(7) 使用 FlowJo 软件对数据进行分析。

1.5 H&E 染色

(1) 脱蜡和水化：

(2) 染色:

1) 苏木精染色 4 min，蒸馏水洗去浮色。

2) 在 1% 盐酸乙醇分化液中分化 10 s，蒸馏水冲洗。

3) 在 0.5‒1% 氨水观察返蓝 10秒（s），蒸馏水冲洗。

4) 伊红染色 40 s，蒸馏水洗去浮色。

(3) 脱水透明：

(4) 中性树胶封片，晾干后显微镜下观察并拍照。

1.6 统计学分析

采用 SPSS 22.0 软件进行统计学分析，结果以（均数 ± 标准差）表示。两组之间比较采用独立样本 T 检验分析。三组及以上比较时，先进行方差齐性检验，方差齐时采用单因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA）；方差不齐时采用非参数检验。当 P < 0.05 时，认为结果具有统计学差异。

1.7 BMSCs 的原代分离和培养

取80‒100g 的雄性 SD 大鼠，处死后在 75% 酒精中浸泡 30 min。取膝关节处胫骨和股骨并暴露干骺端，使用注射器吸取 PBS 冲洗骨髓腔并收集骨髓抽吸物。采用 800rpm/min 的转速离心 5 min 后，加入MEM-α 完全培养基重悬底部细胞团，放入含有 5%CO₂ 的37℃ 细胞培养箱中静置培养 5 天，随后每 3 天更换一次培养基，1‒2 周可获得BMSCs。当细胞长至 80‒90% 密度后，按照1:3‒1:4的比例传代扩增细胞或者冻存。

本发明遵循美国国立卫生研究院出版的《The Guide for the Care and Use ofLaboratory Animals》（1996 版）进行，动物实验方案经过北京大学医学部动物伦理委员会批准

1.8外泌体的提取

提取 MSCs 来源的外泌体需要扩增足够的细胞，为了保证扩增效率和减少 MSCs的去分化，采用康宁公司的 Falcon 多层细胞培养瓶（875 cm²）扩增三种MSCs。当细胞长至约80% 密度时，弃去培养上清，使用 PBS 洗 2 遍后，更换含5% 无外泌体 FBS 的MEM-α培养基继续培养 48 h, 收集细胞上清即条件培养基。随后条件培养基按以下步骤处理：

(1) 条件培养基在300 × g离心10 min，收集上清。

(2) 2,000 × g 离心10 min，收集上清。

(3) 10,000 × g离心 30 min，收集上清。

(4) 应用切向流技术，采用含有 100 kDa 分子量界限的过滤膜系统（CentriconPlus-70，Millipore），上清在3,500 × g条件下离心浓缩。

(5) 使用 0.22 μm 孔径的滤器过滤上清。

(6) 4℃，100,000 × g离心2 h，小心吸出上清，预冷的 PBS 重悬沉淀。

(7) 4℃，100,000 × g离心2 h，小心吸出 PBS，加入100‒200 μL预冷的 PBS 重悬底部沉淀，分装后冻存于 ‒80℃ 保存。

1.9 外泌体的鉴定

1.9.1透射电子显微镜观察

取 10 μL 新鲜分离的外泌体，PBS 稀释后滴加到铜网上，用 2% 磷钨酸室温负染2 min。采用JEOL -1400透射电子显微镜（JEOL, Tokyo, Japan）进行观察。

1.9.2 纳米粒径分析

使用NanoSight NS300系统（Malvern Instruments）通过纳米颗粒跟踪分析来确定外泌体的大小和浓度。取 2 μL 新鲜分离的外泌体，PBS 稀释到 1 mL 置于注射器中，自动机械泵匀速将样品注入仪器，通过颗粒的布朗运动进行追踪分析计算纳米颗粒的大小及浓度。

1.9.3 蛋白质免疫印迹实验

（1）细胞和外泌体蛋白质样品的制备

细胞蛋白质提取：细胞在直径 10 cm 的细胞培皿生长至 90% 密度时，弃去上清，预冷的 PBS 洗涤 2 遍后，使用移液器将残留的 PBS 充分吸净，在冰上加入含有蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解液，迅速用细胞刮刀收集裂解产物。冰上孵育 30 min 后, 于 4℃、10,000 × g条件下离心15 min，所获上清即细胞的蛋白质提取物。

外泌体蛋白质提取：将外泌体和含有蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解液按照 1:1 的体积比混匀，冰上孵育 30 min 后, 于 4℃、10,000 × g条件下离心15 min，所获上清即外泌体的蛋白质提取物。

（2）蛋白质浓度测定

使用 BAC 法测定蛋白质浓度，按照Thermo公司蛋白定量试剂盒（BCA 法）说明书进行，具体如下：

1）工作液配制：将试剂 A 和试剂 B 按照 50:1 的体积比混匀制备工作液。工作液需要现用现配。

2）标准品溶液配制：使用 PBS 和蛋白质标准品溶液（2000 μg/mL），通过稀释法获得不同浓度（1500、1000、750、500、250、125和0 μg/mL）的标准品溶液。取各浓度标准品25 μL加入96 孔板中。

3）取各样品 2.5 μL 加入96 孔板中，加入 PBS 补充样品体积至25 μL。

4）将 200 μL 工作液加入 96 孔板中，轻轻混匀，避免气泡。

5）37℃ 恒温箱内避光孵育 30 min。

6）通过多功能酶标仪检测 562 nm 波长处的吸光度值。

7）根据各标准品溶液的浓度和所测得的吸光度值建立标准曲线，通过标准曲线计算各样品的蛋白质浓度。

（3）蛋白质免疫印迹实验

1）制作 10% 分离胶，各成分比例如下：

混合均匀后将分离胶灌入干净的玻璃板之间中，加入的ddH₂O使分离胶水平。室温静置 30 min 后，水和分离胶之间可见明显的分界线。

2）制作 5% 浓缩胶，各成分比例如下：

小心弃去分离胶上层的ddH₂O，加入浓缩胶至玻璃板顶部，插入梳子，室温静置 30min 后拔去梳子。

3）上样：在电泳槽中加入 1 × 电泳缓冲液后，根据所测的蛋白质浓度将等量的蛋白样品加入到浓缩胶各孔中，预染蛋白质 marker上样 6 μL。

4）电泳：使用 80 V 恒压电泳，待样品进入分离胶以后，调整至 120 V 电压继续电泳，溴酚蓝到达分离胶底部时候结束电泳。

5）拆胶：取下并小心去除一侧玻璃板，切除浓缩胶和分离胶无样品部分，切角标记。

6）转膜：测量剩余胶的大小，按照相应尺寸剪裁一张 PVDF 膜，并在甲醇中浸泡 3min 平衡PVDF 膜，按照“黑胶白膜”顺序放置在电转槽中。接通电源，设置电流大小为250mA 恒流，冰浴或者 4℃ 转膜 2 h。

7）封闭和一抗孵育：将膜在 TBST 中漂洗 3 次，用 5% 脱脂奶粉或 5% BSA 室温条件下封闭 1 h后加入一抗，放于摇床4℃ 过夜。

8）二抗孵育：室温下 TBST 漂洗 3 次，每次 10 min，加入二抗，室温孵育 1 h。

9）发光：室温下 TBST 漂洗 3 次，每次 10 min，滴加适量发光液进行化学显色，采集图像。

二、实施例：使用3D打印制备含有外泌体的支架及其性能检测方法

2.1 MSCs 的分离和培养

2.1.1 大鼠 BMSCs 的分离和鉴定

使用 前文描述的方法分离和鉴定的大鼠 BMSCs。

2.1.2 人 ADSCs 分离、培养和鉴定

人脂肪组织标本的取材及实验方案通过北京大学第三医院医学伦理委员会批准。患者签署知情同意书。人脂肪组织标本来自关节镜下行膝关节交叉韧带重建术中废弃的髌下脂肪垫组织。获得组织后立即放入无菌生理盐水中，使用临床标本专用低温冰盒送至实验室进行原代细胞培养。对第 2 代 ADSCs 细胞进行三系分化（参见 1.1-1.3）和流式细胞术（参见1.4）鉴定。

外泌体的提取和鉴定

参见 1.8 和 1.9。

材料制备和表征

2.4.1 明胶-甲基丙烯酸酐制备

（1）称量 6 g 的明胶加入 60 mL 体积的 PBS 中，置于 50℃ 水浴中搅拌溶解。

（2）使用移液器逐滴滴加甲基丙烯酸酐 300 μL。

（3）50℃ 水浴中避光持续搅拌 1 h。

（4）加入200 mL 37℃的 PBS 终止反应，快速搅拌 10 min。

（5）转移到透析袋后封口，放入含有 ddH₂O 的大烧杯 37℃ 烘箱中透析 3 天，每间隔 12 h 更换 ddH₂O。

（6）冷冻干燥后于 ‒20℃ 保存备用。

2.4.2 氧化透明质酸制备

（1）称量 1 g 的透明质酸，加入到 100 mL 体积的 ddH₂O 中，室温磁力搅拌溶解。

（2）称量 550 mg 的高碘酸钠，溶于5 mL体积的 ddH₂O 中。

（3）使用移液器将高碘酸钠溶液逐滴加入透明质酸溶液中，室温搅拌 2 h。

（4）转移到透析袋后封口，放入含有 ddH₂O 的大烧杯透析 3 天，每间隔 12 h 更换ddH₂O。

（5）冷冻干燥后于 ‒20℃ 保存备用。

2.4.3 透明质酸-多巴胺制备

（1）称量 1 g 的透明质酸，加入到 100 mL 体积的 ddH₂O 中，室温磁力搅拌溶解。

（2）加入 575 mg 的EDC，345 mg 的NHS，室温搅拌 20 min。

（3）加入 569 mg 的盐酸多巴胺，避光搅拌 3 h，在此期间需维持 pH在 5‒6 范围内，随后继续反应 21 h。

（4）装入透析袋并封口，使用 pH 为 3‒4的 ddH₂O 透析 2 天后，继续用 ddH₂O 透析 1 天，期间每间隔 12 h 更换ddH₂O。

（5）冷冻干燥后于 ‒20℃ 保存备用。

2.4.4 核磁共振波谱检测

使用重水分别配制 1% 明胶、1% GelMA、0.8% HA、0.8% OHA和 0.8% HA-DA的水凝胶，充分搅拌均匀后，移入圆柱形核磁共振波谱（nuclear magnetic resonance，NMR）玻璃样品管中，注意避免气泡，上机检测。

脱细胞基质制备

使用 6 月龄大的猪股骨的新鲜标本，剔除周围的脂肪、肌肉、筋膜等软组织。按照如下方法分别制备软骨脱细胞基质（decellular cartilage matrix, DCM）和骨脱细胞基质（decellular bone matrix, DBM）。

2.5.1 骨组织脱细胞基质制备

（1）使用骨刀和骨锯收集股骨远端关节软骨下的松质骨标本，切成厚度不超过1cm的方块骨组织。

（2）高压水冲洗骨髓后，采用 0.5 M 的盐酸溶液室温下脱钙 24 h, 每 12 h 更换一次盐酸溶液。

（3）按照 1：1 体积比混合的三氯甲烷和甲醇混合物冲洗 6 h，随后甲醇冲洗 6h，DPBS洗涤 2 h，目的是充分去除骨组织中的脂肪。

（4）37℃ 条件下，0.25% 胰蛋白酶溶液（含 EDTA）洗涤 4 次，每次 6 h。

（5）37℃ 条件下，含 0.1% EDTA 、10 mM Trizma base、DNase（50 U/mL）和RNaseA（1 U/ mL）的 DPBS 洗涤 4 h。

（6）10 mM Trizma base 的 DPBS 洗涤 24 h。

（7）含 0.5% SDS和 10 mM Trizma base 的 DPBS 洗涤 24 h。

（8）DPBS 洗涤，直至泡沫消失。

（9）冷冻干燥，球磨仪磨成粉末，‒20℃ 保存备用。

脱细胞基质的表征

2.6.1 组织切片 H&E 染色

参见前文实验方法。

2.6.2 组织切片 DAPI 染色

（1）脱蜡和水化：参见前文实验方法 。

（2）DAPI 染色：将 DAPI 染色液滴加于标本处，室温下避光孵育 10 min。

（3）PBS 洗涤 3 次，每次 3 min。

（4）封片后使用荧光显微镜拍摄图像。

2.6.3 DNA含量检测

（1）木瓜蛋白酶裂解液配制：木瓜蛋白酶 125 μg/mL，5 mM Na2-EDTA，5 mM L-半胱氨酸盐酸，0.1 M 乙酸钠，调整 pH 到 6.2。

（2）分别取 10 mg 冷冻干燥后的正常软骨、正常骨、DCM 和 DBM粉末添加到 1 mL木瓜蛋白酶裂解液中，置于 60℃ 烘箱中裂解 24 h。

（3）取200 μL Hoechst 33258 工作液（2 μg/ml）加入 96 孔板，随后每孔加入 20uL 样品裂解液或者各浓度的小牛胸腺 DNA 标准品，于 37℃ 孵箱避光孵育 1 h。

（4）取 100 μL 混合液加入 96 孔板，使用多功能酶标仪检测荧光值（激发光为360 nm，发射光为 460 nm）。

（5）绘制 DNA 标准曲线，计算各样本的 DNA 浓度。

2.6.4 GAG 含量检测

（1）将 200 μL 体积的 1,9-二甲基亚甲蓝（DMMB）溶液加入 96 孔板，加入 20 μL体积的上述样品裂解液或者不同浓度的硫酸软骨素标准品，充分混匀。

（2）于室温避光孵育 30 min。

（3）使用多功能酶标仪上检测 525 nm 处的吸光度值。

（4）绘制标准曲线，计算各样本的 GAG 浓度。

2.6.5 羟脯氨酸含量检测

使用南京建成生物工程研究所生产的羟脯氨酸检测试剂盒，通过测定羟脯氨酸含量评估脱细胞前后胶原含量的改变。羟脯氨酸在氧化剂作用下生成的氧化产物可以与二甲氨基苯甲醛反应呈现紫红色，根据其吸光度值推算含量。

（1）按照说明书操作配制试剂一、试剂二和试剂三。

（2）分别取 200 μL 的 ddH₂O、标准品和上述各样品裂解液加入含有 100 μL 试剂一的 EP 管中，混匀后静置 10 min。

（3）加入 100 μL 试剂二，混匀后静置 5 min。

（4）加入 100 μL 试剂三，混匀后 60℃ 水浴加热 15 min。

（5）3500 rpm/min，离心 10 min。

（6）取 100 μL 上清加入 96 孔板，使用多功能酶标仪检测波长 550 nm 处的吸光度值。

（7）根据标准品浓度计算样品中羟脯氨酸含量。

2.6.6 成胶能力检测

（1）DBM 墨水配制：

1）称取 15 mg 的胃蛋白酶加入 5 mL 的 0.1 M盐酸溶液中，室温搅拌 30 min。

2）称取 150 mg 的 DBM 粉末，加入上述含有胃蛋白酶的盐酸溶液，室温密封搅拌72 h 获得 DBM 墨水。

3）将 DBM 墨水置于冰上，使用氢氧化钠溶液小心调整 pH 至 7.4，需要注意少量多次添加，避免 pH 至 7.4 以上。

（2）将适量的 DBM 墨水加入到玻璃管中，放入37℃ 孵箱孵育 30 min 后，倒置观察是否成胶并拍照。

（3）使用流变仪检测DBM 墨水随着温度改变弹性模量 G’和粘性模量 G”的动态变化。

支架的打印和表征

2.7.1 水凝胶生物墨水制备

（1）Hydrogel 生物墨水的配制：

1）称取 0.9 g GelMA 加入 5 mL的 ddH₂O 中, 37℃ 搅拌溶解后加入 0.2 gOHA，继续搅拌溶解。

2）称取 0.2 g HA-DA 和 0.04 g 光引发剂，加入 5 mL的 ddH₂O 中，室温搅拌溶解。

3）将上述两种溶液混合均匀获得 Hydrogel 生物墨水。

（2）Hydrogel-DBM 和 Hydrogel-DBM 生物墨水的配制：

1）称取 0.9 g GelMA 加入 5 mL 的 ddH2O 中, 37℃ 搅拌溶解后加入 0.2 gOHA，继续搅拌溶解。

2）按2.6.6所述方法配制 4% 的 DBM 墨水5 mL，调整 pH 至 7.4后，加入 0.2 gHA-DA 和 0.04 g 光引发剂，室温搅拌溶解。

3）将上述两种溶液混合均匀获得 Hydrogel-DBM 墨水生物墨水，上述两种溶液的配置没有先后顺序，HA-DA 和 光引发剂还可以与OHA一同加入，本领域技术人员理解，除了脱细胞基质墨水需要单独配制然后调节PH之外，其他成分的添加时机没有必然顺序，能够获得本发明生物墨水的步骤均包含在本发明之内；

（3）Hydrogel-DBM-Exos 生物墨水的配制： Hydrogel-DBM 生物墨水的配制好后加入 ADSCs 外泌体，终浓度为 100 μg/mL。

为了研究不同变量浓度对生物墨水的影响，发明人在这个实例的基础上进行了若干组对照试验，试验变量的具体变化如下表所示：

每个变量选择一个具体数值，作为一个实验组，例如：

GelMA（6%）、OHA（0.5%）、HA-DA(0.5%)、 DBM(0.5%)、光引发剂(0.1%)、以及终浓度为 10 μg/mL的间充质干细胞外泌体作为一个实验组，以此类推，共计729个具体实验方案，实验结果表明，这些实验方案均可以获得用于3D打印的生物墨水，使用这些生物墨水可以得到支架，各项性能结果与前述实例类似，实验结果重复较多，不再赘述。

2.7.2 支架的打印

使用 3D-Bioplotter（EnvisionTEC）生物打印机进行支架打印。设置层高、线宽和线间距均为 320 μm，打印压力为 2.5‒3.5，打印速度为8‒15 mm/s，平台温度10℃，墨水舱温度18‒22℃。将打印好的支架置于冰上，UV 照射 20 min 以充分交联。

2.7.3 支架的表征

（1）扫描电子显微镜观察

1）对 Hydeogel和 Hydeogel-DBM 支架进行冷冻干燥。

2）将三种支架置于黑色导电胶上，对表面进行喷金处理。

3）使用扫描电子显微镜（JSM-7900F，JEOL，日本）对支架的微观结构进行观察和拍摄。

（2）傅里叶红外光谱分析

1）将明胶、GelMA、HA、OHA、HA-DA、DBM 和 Hydeogel、Hydeogel-DBM 三种支架冷冻干燥后研碎成粉末。

2）按照 1:100 的质量比与溴化钾固体混合，充分研磨后压制成薄片。

3）采用 4000-400 cm^-1 范围的扫描波数和 4 cm^-1 的扫描精度，通过傅里叶红外光谱分析蛋白质的二级结构。

（3）支架的降解速率检测

1）打印同样尺寸的各种支架，冷冻干燥后，称量各个支架的干重为Wi。

2）将支架分别放入含有 1 mL PBS 的圆底离心管中，置于 37℃ 和 30 rpm/min转速的孵育摇床内。

3）每间隔 3 天更换 PBS，在预定时间取出支架，ddH₂O 洗涤 2 次，冷冻干燥后测量支架称重为 Wt。

4）降解率 = (Wt- Wi)/Wi × 100%。

（4）支架的溶胀率检测

打印同样尺寸的各种支架，滤纸吸去表面水分称重为 Wi。放入含有 1 mL PBS的圆底离心管中，置于 37℃ 培养箱中孵育。在预定时间取出支架，ddH₂O 洗涤 2 次，滤纸吸去表面水分后称重为 Wt。溶胀率 = (Wt- Wi)/Wi × 100%。

（5）外泌体的释放

将同样尺寸称重后的Hydrogel-DBM、Hydrogel-DBM-Exos 支架置于不同的Transwell 上室（8μm），在下室加入 150 μL 的PBS，放入 37 ℃的培养箱中孵育。在预定时间从下室取出 15 μL PBS并加入等体积 PBS。使用 micro BCA 试剂盒测量各时间点取出的 PBS 的蛋白质含量，进而计算外泌体的释放百分比。

支架的生物相容性

2.8.1 细胞种植于支架上

（1）将经过 UV 照射后的支架放入含 10% 无外泌体 FBS 的 MEM-α 完全培养基中于 37℃ 细胞培养箱孵育 24 h。

（2）取第 3 代大鼠 BMSCs, 0.25% 胰蛋白酶溶液消化约 2 min，在800 rpm/min条件下离心 3 min，使用含 10% 无外泌体 FBS 的 MEM-α 完全培养基重悬细胞。

（3）调整细胞悬液密度为 1 × 10⁷/mL，取 100 μL 滴加到支架上，置于 37℃ 细胞培养箱孵育 4 h，更换培养基，继续培养或者诱导分化。

2.8.2 细胞在支架上的活性

（1）按照上述 2.8.1 描述将细胞种植在支架后，继续培养 24 h。

（2）配制 Live/Dead 细胞活性检测工作液：取 1 μL 体积的 Live 试剂混入 499ul 的 PBS 中，取 1 μL 体积的 Dead 试剂混入 499 ul的另一份 PBS 中，混合均匀后即Live/Dead 工作液。Live/Dead 工作液现用现配。

（3）用 PBS 洗涤支架 2 次，转移支架到共聚焦培养皿，加入 1 mL Live/Dead 工作液，置于 37℃ 细胞培养箱孵育 15 min。

（4）弃去工作液，用 PBS 洗涤支架 2 次，使用激光共聚焦显微镜观察支架上活细胞（绿色荧光）和死细胞（红色荧光）分布。

2.8.3 细胞在支架上的形态

（1）按照上述 2.8.1 描述将细胞种植在支架后，继续培养 72 h。

（2）弃去上清，用 4% 多聚甲醛固定细胞 15 min，PBS 冲洗 3 次，每次 5 min。

（3）用罗丹明‒鬼笔环肽（红色荧光）对细胞骨架染色15 min，PBS 冲洗 3 次，每次5 min。

（4）使用 Hoechst 33342（蓝色荧光）对细胞核染色15 min，PBS 冲洗 3 次，每次5 min。

（5）通过激光共聚焦显微镜观察并拍照。

2.8.4 细胞在支架上的增殖能力检测

（1）按照上述 2.8.1 描述将细胞种植在支架后，更换含 10% 无外泌体 FBS的MEM-α 完全培养基继续培养。

（2）于1 d、3 d、5 d 和 7 d后分别取出支架，PBS 冲洗 3 次，置于新的 24 孔细胞培养板中。

（3）每孔加入 1 mL含 10% 的 CCK-8 试剂的 MEM-α 培养基（现用现配），于 37℃细胞培养箱孵育 2 h。

（4）取 100 μL 体积的孵育液置于 96 孔细胞培养板，使用酶标仪测定 450 nm波长处的吸光度值。

2.9 细胞在支架上的成骨诱导分化

将 BMSCs 种植于支架后培养 3 d后，PBS 洗涤 2 遍，更换成骨诱导分化完全培养基（使用无外泌体的 FBS）分别诱导 7 d 和 14 d。随后进行下一步相关检测。

2.9.1 qRT-PCR 检测

采用 qRT-PCR 检测成软骨和成软骨相关基因 mRNA 表达。在成软骨或者成骨诱导 7 d 和 14 d 后，取出支架用 PBS 洗涤 2 次，放入 EP 中并加入 0.5 mL 体积的TRIzol 试剂，充分剪碎后置冰上 30 min，每间隔 10 分钟震荡，进行后续操作，或者保存于 ‒80℃ 备用。

2.9.2 细胞免疫荧光检测

在成软骨或者成骨诱导分化 14 d 后，采用细胞免疫荧光检测成软骨和成软骨相关基因蛋白质表达。

三、3D打印制备的含有外泌体的支架的实验结果

3.1 1H NMR 波谱分析

在明胶衍生物 GelMA 和透明质酸衍生物 OHA、HA-DA 合成后，通过 1H NMR 波谱分析各中材料的波普变化。由图1A可见，GelMA 在5.3 和5.5 ppm 位置出现新信号，代表丙烯酸成功与明胶结合；在 2.9 ppm 处峰值降低和1.8 ppm位置出现的新信号代表了甲基的结合，证明本发明中 GelMA 的成功合成。如图1 B 所示，OHA 中 4.9 和 5.0 ppm 处出现的新信号代表醛基结合到 HA，说明 OHA 合成成功；HA-DA 在 6.7 ppm 位置出现的新信号代表苯环的信号，2.76 ppm出现新信号表示临近苯环的 -CH2 基团，证明了多巴胺与 HA成功结合形成 HA-DA 。

3.2 骨脱细胞基质的表征

收集软骨下的松质骨，经过脱细胞处理，获得骨组织脱细胞基质（DBM），大体积观察发现，骨组织脱细胞之后，原有的残留血液消失，整体颜色呈淡黄色，质地柔韧有弹性，可见疏松多孔样结构（图2）。通过 H&E 染色可见DBM中无细胞和细胞碎片残留，而 DAPI 染色证明了 DBM中的细胞核均消失不见（图2），说明脱细胞过程有效去除了骨组织的细胞成分。DNA 含量检测结果显示，DBM 中DNA 含量为22.0 ± 3.6 ng/mg （图3A），低于脱细胞基质生物材料 50 ng/mg 的标准。为了进一步评估脱细胞过程对骨组织成分的影响，本课题分别检测了 GAG 和胶原蛋白在两种组织脱细胞前后的含量。结果显示， DBM 中 GAG 含量分别是正常骨组织中 GAG 含量的44.5%（图3B），而 DBM 中胶原含量分别是正常骨组织中胶原含量的 70.6%（图3C）。

脱细胞基质材料生物墨水在 37℃ 可以发生自组装形成胶状物并维持形状。随后，本发明在冰上调节 DBM 生物墨水预凝胶的 pH 至中性，随后放入 37℃ 孵箱 30 min后，观察到 DBM 脱细胞基质均形成胶状物，倒置后基本可以维持形态（图4A）。随后，本发明采用流变仪进一步检测两种脱细胞基质生物墨水预凝胶的弹性模量 G’和粘性模量 G” 随着温度改变的动态变化。结果显示，在 15℃ 以下时，DBM 预凝胶表现得更像液态物质，15℃ 后弹性模量 G’开始明显升高，而 37℃ 孵育一段时间后，流变性能表现为类似交联凝胶，弹性模量 G’显著高于粘性模量 G”（图4B）。

3.3 支架的表征

3.3.1支架的微观结构

各种生物墨水体系中 GelMA 占主要比例，因此均具有良好的可打印性能。打印的支架经过冷冻干燥后，通过扫描电子显微镜观察脱细胞基质对生物支架微观形貌的影响（图5）。由 GelMA、HA-DA 和 OHA 三种成分生物墨水打印出的 Hydrogel 支架线条表面比较光滑，可见凹凸起伏状形貌，而加入脱细胞基质后，支架线条内可见明显的孔隙结构。说明 DBM 的添加可以显著改善支架线条的内部孔径，实现 3D 打印支架的“框架大孔”和“线条小孔”相结合。

3.3.2 支架的降解速率、溶胀检测和红外光谱分析

如图6A所示，Hydrogel水凝胶支架、Hydrogel-DBM水凝胶支架的72 h 达到吸水量的平衡状态，吸水率分别为 221.0%和193.5% ，表明 DBM 的添加可以而降低水凝胶的溶胀率。Hydrogel、Hydrogel-DBM 水凝胶支架在 28 天的降解率分别为 77.9%和660.0% （图6B），表明脱细胞基质的添加可以延缓支架的降解。采用傅里叶变换红外光谱对本发明各种组分及打印的水凝胶支架进行了表征（图6C），以确定支架的化学成分及结构变化。其中，1652 cm-1 处峰代表酰胺（Amide）I 区间的 C=O，1534 cm-1处峰代表 Amide II 区间的N-H，1230 cm-1 处峰代表 Amide III 区间的 C-N。在 OHA 中可见 1735 cm-1 处出现信号峰，代表 -CHO 的引入，而在 Hydrogel、Hydrogel-DCM 中该处信号峰均消失，提示 -CHO和 -NH2 发生席夫碱反应，形成动态共价键网络。

3.4 支架的生物相容性

将 BMSCs 种植于 Hydrogel支架和Hydrogel-DBM 支架上，孵育 24 h后，对各组支架进行 Live/Dead 染色（图7A）。通过激光共聚焦显微镜观察发现，两种支架上的 BMSCs绝大多数表现为绿色荧光标记的活细胞，仅仅可见个别被红色荧光标记的死细胞。个别死细胞的出现符合细胞的正常生长周期。由此可见，两种支架均未发现明显的细胞毒性。

为了进一步观察 BMSCs 在支架上的分布情况和形态特征，本发明采用罗丹明‒鬼笔环肽和 DAPI 分别对细胞骨架（呈红色荧光）和细胞核（呈蓝色荧光）进行染色。激光共聚焦显微镜下观察发现，BMSCs 种植于支架培养 3 d 后，含有脱细胞基质的 Hydrogel-DBM支架上细胞沿支架线条分布均匀，细胞骨架（红色荧光）呈现出方向一致的走形；而在Hydrogel 支架，细胞沿支架分布出现聚集情况，细胞骨架形态相对杂乱（图7B）。以上结果提示脱细胞基质成分可以明显改善细胞在支架上的延展性能，促进细胞在立体微环境的均匀分布。

3.5 人 ADSCs 的鉴定

为了验证本发明中所提取的人髌下脂肪垫来源的 ADSCs 是否为 MSCs，本发明进行了三系诱导分化试验和流式细胞术。如图8 所示，油红O、茜素红和阿利新蓝染色阳性分别说明 ADSCs 具有成脂、成骨和成软骨分化能力，提示具备 MSCs 的多向分化潜能。流式细胞术检测细胞表面标志物发现 CD34、CD45 和 HLA-DR 阳性率分别为 2.3%、2.1% 和1.8%，均为阴性表达；而 CD29、CD73、CD90 和 CD105 阳性率分别为 99.9%、100%、99.8% 和99.9%，呈强阳性表达（图9）。以上结果说明本发明提取的人髌下脂肪垫来源的 ADSCs 符合MSCs 特征。

3.6 人 ADSCs 来源的外泌体的鉴定

收集人 ADSCs 的细胞培养上清，通过差异离心法分离获得其外泌体。透射电子显微镜检测显示具有外泌体典型的“杯口状”或“圆盘状”结构（图10A）。纳米粒径分析检测发现提取的外泌体直径主要分布在 160 nm 以下，平均直径为 140.3 nm （图10B），蛋白质免疫印迹实验结果显示分离的人 ADSCs 外泌体高表达外泌体特异性蛋白质标志物 CD81、TSG101 和 ALIX，而内质网特异性蛋白质标志物 Calnexin 表达量很低（图10C）。

3.7 外泌体在脱细胞基质支架中的缓释

通过缓释曲线可见，Hydrogel-DBM-Exos 外泌体支架可以稳定释放外泌体长达24 天以上（图11）。

3.8 外泌体脱细胞基质支架对 BMSCs 活力的影响

将 BMSCs 种植于支架上 1、3、5、7 天后，采用 CCK-8 检测各组支架对细胞活力的影响，以第 1 天细胞活力作为参考。结果显示，各组支架均未见细胞毒性。第 7 天时，加入脱细胞基质的支架 Hydrogel-DBM上 BMSCs 的细胞活力显著高于 Hydrogel 组（P <0.01），而含外泌体的 Hydrogel-DBM-Exos 支架上BMSCs的细胞活力显著高于其他组（P <0.001）（图12）。证明了脱细胞基质和外泌体的添加产生了协同效应，增加了支架的生物相容性。

3.9 不同支架上 BMSCs 的体外诱导分化

3.9.1 支架上 BMSCs 的成骨分化

为了评估 Hydrogel、Hydrogel-DBM 和 Hydrogel-DBM-Exos 三种支架体外对BMSCs 成骨分化的效果，本发明将 BMSCs 种植在支架培养 3 天后，进行成骨诱导分化。通过 qRT-PCR 检测骨组织相关基因的 mRNA 在各组支架的表达情况（图13A、图13B、图13C和图13D）。诱导 7 天和 14 天后，结果显示 Hydrogel-DBM 和 Hydrogel-DBM-Exos 两组中ALP、OCN、COL I 和 RUNX2 的 mRNA 表达水平均高于 Hydrogel 组。其中，对于ALP 和 OCN而言，Hydrogel-DBM-Exos 组中的高表达相对 Hydrogel-DBM 具有统计学意义（图13A和图13B）；而对于 COL I 和 RUNX 2 而言，虽然 Hydrogel- DBM-Exos 组的表达较 Hydrogel-DBM 组中高，但是两组之间未见统计学差异（图13C和图13D）。细胞免疫荧光结果显示，体外成骨诱导 14 天后，COL I 蛋白质在 Hydrogel-DBM-Exos 组中表达最高，Hydrogel-DBM组中次之，而 Hydrogel 组中表达最低（图13E）。此外，Hydrogel-DBM-Exos 组中 OCN 蛋白质在的表达也明显高于其他两组，与mRNA 表达结果相一致（图13E）。综上所述，Hydrogel-DBM 支架效果好于 Hydrogel 支架，而Hydrogel-DBM-Exos支架效果好于Hydrogel-DBM 支架 。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。