具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐明本发明。

实施例1

1.BRCA1基因长片段拷贝数变异的检测：

1)DNA样本的准备

人基因组DNA的提取采用商业化的DNA提取试剂盒。得到的DNA质量，用Nano300检测须符合OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.8-2.0之间，浓度＞10ng/μl。将质量合格的DNA样本稀释至10ng/μl，置于4℃备用。

2)PCR扩增反应

本申请当中优选的扩增引物组合序列见表1-表4，扩增引物为内参基因和BRCA1基因的23个外显子的特异性引物。内参基因扩增引物和延伸引物的目标片段为人源基因RNaseP、EIF2C1和ALB的一段。由于超过30对引物，每个样本分2个孔检测，分别为W1和W2。W1中的16对引物分别按照终浓度0.5μM进行混合，配制成W1的PCR引物Pool；W2中的17对引物分别按照终浓度0.5μM进行混合，配制成W2的PCR引物Pool。

表1.W1的BRCA1基因扩增引物序列

表2.W1的内参基因扩增引物序列

表3.W2的BRCA1基因扩增引物序列

表4.W2的内参基因扩增引物序列

上述用于检测BRCA1基因长片段拷贝数变异的试剂盒设有人工内标(competitor)，人工内标为与目标扩增片段仅有1碱基不同的双链DNA合成片段或含有该片段的质粒。不同的碱基为延伸引物在延伸反应时延伸的3’端碱基(如图5、图6所示)，作为内部对照。具体的人工内标序列见表5-表6。W1的15个人工内标按终浓度相当于3000拷贝/μl人基因组DNA的量混合；W2的15个人工内标也按终浓度相当于3000拷贝/μl人基因组DNA的量混合。分别得到W1人工内标混合物和W2人工内标混合物。

表5.W1的人工内标序列

表6.W2的人工内标序列

上述用于检测BRCA1基因长片段拷贝数变异的试剂盒所使用的多重PCR反应体系中含有PCR Buffer、MgCl₂、dNTPs、UNG酶和PCR酶(购于AgenaBioScience公司，货号21327L)，以及dUTP(购于上海兆维，货号D5331)、PCR引物Pool和人工内标混合物。每个样本分两个孔检测，分别为样品检测孔W1和样品检测孔W2。PCR扩增反应体系见表7，其中W1孔使用W1的PCR引物Pool和人工内标混合物，W2孔使用W2的PCR引物Pool和人工内标混合物。PCR扩增反应程序见表8。

表7.PCR扩增反应体系

表8.PCR扩增反应程序

3)SAP反应

上述SAP反应体系含有SAP酶和SAP Buffer(购于Agena BioScience公司，货号10141)。PCR扩增后，取5ul产物进行SAP反应。SAP反应体系见表9，反应程序见表10。

表9.SAP反应体系

表10.SAP反应程序

4)延伸反应

上述延伸反应体系含有Buffer Plus、Termination Mix和iPLEX Enzyme(购于Agena BioScience公司，货号10141)，以及延伸引物混合物。本申请当中优选的延伸引物组合序列见表12-表15，延伸引物为BRCA1基因和内参基因的特异性引物。W1中的16条延伸引物(UEP)按照表11的规则进行混合，配制成W1的UEP混合物；W2中的17条延伸引物(UEP)按照表11的规则进行混合，配制成W2的UEP混合物。SAP反应结束后，进行延伸反应。延伸反应体系见表16，其中W1孔使用W1的UEP混合物，W2孔使用W2的UEP混合物。反应程序见表17。

表11.延伸引物(UEP)混合物配制表

表12.W1的BRCA1基因延伸引物序列

表13.W1的内参基因延伸引物序列

表14.W2的BRCA1基因延伸引物序列

表15.W2的内参基因延伸引物序列

表16.延伸反应体系

表17.延伸反应程序

5)脱盐

向延伸反应的产物中加入19ul超纯水，放入MassARRAY-CPM机器中，设置机器加入10ul的树脂，进行脱盐纯化，并静置沉降。

6)质谱检测

MassARRAY-CPM自动化地将产物点样在芯片上，并移入真空管中，然后用激光激发，进行飞行时间质谱。一张芯片最多可以同时检测192个样本，增加了通量，减少了成本。

2.数据分析

用Typer软件打开实验结果，可以对散点图进行分析。外显子缺失或者重复的样本，其结果会散落在正常样本的聚堆之外(如图1和图2圈出的部分)。我们需要对数据进行进一步的分析，在Typer软件中点击View--Plate Data Pane导出数据表，得到FREQ值(表18)。以BRCA1基因片段Exon15为例。

表18.FREQ值

根据数据表中的每个BRCA1基因片段的人基因组DNA(gDNA)的FREQ参数和人工内标的FREQ参数，按照以下公式计算拷贝数。

由于本实施例中有3个内参基因，每个待测样本与每个阴性样本拷贝数比值有3个数值，取中位数。由于有3个阴性样本，所以得到了3个中位数，取平均值，得到最终的拷贝数变异系数(TR值)。

以Well1的Exon15片段为例，其中本实施例中添加的目标检测基因片段和内参基因片段的人工内标拷贝数为6000。

1)阴性样本1拷贝数比值

2)阴性样本2拷贝数比值

3)阴性样本3拷贝数比值

4)待测样本1拷贝数比值

5)待测样本2拷贝数比值

6)待测样本1拷贝数变异系数

由于有3个内参基因，每个待测样本与每个阴性样本拷贝数比值有3个数值，取中位数，为0.99。

由于有3个内参基因，每个待测样本与每个阴性样本拷贝数比值有3个数值，取中位数，为0.97。

由于有3个内参基因，每个待测样本与每个阴性样本拷贝数比值有3个数值，取中位数，为1.05。

由于有3个阴性样本，所以得到了3个中位数，再将3个中位数取平均值，得到最终的拷贝数变异系数(TR值)。

7)待测样本2拷贝数变异系数

由于有3个内参基因，每个待测样本与每个阴性样本拷贝数比值有3个数值，取中位数，为0.65。

由于有3个内参基因，每个待测样本与每个阴性样本拷贝数比值有3个数值，取中位数，为0.58。

由于有3个内参基因，每个待测样本与每个阴性样本拷贝数比值有3个数值，取中位数，为0.65。

由于有3个阴性样本，所以得到了3个中位数，再将3个中位数取平均值，得到最终的拷贝数变异系数(TR值)。

根据TR值，判断如下：

根据上述算法，用RStudio编辑器编写代码后，可直接上传实验数据，得到最终的TR值。用同样的方法计算待测样本1和待测样本2的其他外显子拷贝数，待测样本1的Exon13拷贝数变异系数(TR值)为1.9，结果判断为Exon13重复；待测样本2的Exon16拷贝数变异系数(TR值)为0.56，结果判断为Exon16缺失。根据TR值做柱状图，待测样本1的Exon13柱形图明显高于其他柱形图(如图4所示)。待测样本2的Exon15和Exon16的柱形图明显低于其他柱形图(如图3所示)。

3.质控标准

质量控制，每次试验需做2个阳性对照、3个阴性对照和3个空白对照。缺失阳性对照的TR≤0.65，重复阳性对照TR≥1.5，空白对照的TR＝0。

4.产品性能指标：

本方法能特异检测BRCA1的23个外显子的1个或多个缺失和重复。

检测2份阳性参考品、10份阴性参考品，符合率为100％；企业重复性参考品重复检测10次，10次结果相同。检测未知样本，其符合率为98.6％。

本发明开发了一种用于检测基因长片段拷贝数变异的新方法，开创性的添加人工内标(competitor)，采用特异的PCR引物和延伸引物，基于MassARRAY飞行时间质谱的多重PCR反应，可以大通量、准确性高、成本低地检测基因长片段拷贝数变异。弥补大多数基因测序检测的漏洞，有助于更全面的提供基因检测信息辅助医生进行诊断。

上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围，即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 申友基因组研究院(南京)有限公司

<120> 一种用于检测基因长片段拷贝数变异的方法

<150> 2020113518391

<151> 2020-11-26

<160> 129

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctgaaactt ctcaacc 17

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgggagctc ctctcactc 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gagttgatca aggaacctg 19

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cacagcagaa acctacaact c 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaaggcatct ggctgcacaa cc 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gggtgagagg atagccctga gc 22

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acaagaaagt acgagattta gtc 23

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

attcagcatt tttctttctt taat 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

attagattag ttaaagtgat gtgg 24

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tggagatcaa gaattgttac aaatc 25

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggatgttctc atttcccatt tctctt 26

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccctctgaag ataccgttaa taaggc 26

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgagatgggt agtttctatt ctgaag 26

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cacccttcca tcataagtga c 21

<210> 15

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tcaacattga tggtg 15

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gggaaacaaa ggacaccgtt a 21

<210> 17

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

actgagaagc gtgcagc 17

<210> 18

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cgaccttggt ggtttc 16

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cctcaaactt gtcagcagaa 20

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ctccggagtc ctagcccttt c 21

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggttcactct gtagaagtct tt 22

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ccatgttcta acacagcttc tag 23

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ggagtctgct ccgtttggtt agt 23

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

aacacttacc tggaatctgg aatc 24

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ggatggtgaa tgatgaaagc tcct 24

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ggggagatgc tgagtttgtg tgtg 24

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

taagaagtac aaaatgtc 18

<210> 28

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cctgtccctt tcccggg 17

<210> 29

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tgttggcatg ttggtgaagg gcccat 26

<210> 30

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

cgggtccaac tctctaacct tggaactg 28

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

tgataacaaa ggacaccgtt a 21

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gggaggctca acattgatgg tg 22

<210> 33

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ttactacatt tttctacatc ctttgttt 28

<210> 34

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gatgtttgcc ttttgagtat tctttctaca 30

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

acgttggatg actctaccag tgccaggagc 30

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

acgttggatg ttctttttct ccccccctac 30

<210> 37

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

acgttggatg gttgttctag cagtgaagag 30

<210> 38

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

ggatggatga agtgacagtt ccagtagtcc 30

<210> 39

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

acgttggatg cacgcttttt acctgagtgg 30

<210> 40

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

gttggatgca cttgctgagt gtgtttctca 30

<210> 41

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

cgttggatga aagagcacgt tcttctgctg 30

<210> 42

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

cgttggatgt tctgagctgt gtgctagagg 30

<210> 43

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

gttggatgtg gtcagctttc tgtaatcgaa 30

<210> 44

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

acgttggatg acggctaatt gtgctcactg 30

<210> 45

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

gttggatgag gatctgattc ttctgaagat ac 32

<210> 46

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

acgttggatg atgagctcct cttgagatgg 30

<210> 47

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

acgttggatg cagagggata ccatgcaaca 30

<210> 48

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

acgttggatg cctactgtgg ttgcttccaa 30

<210> 49

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

acgttggatg ataattttgt gctcatggca ga 32

<210> 50

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

acgttggatg tggagccaca taacacattc 30

<210> 51

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

acgttggatg actcttcttg gctccagttg 30

<210> 52

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

acgttggatg tacatgcagg caccttacca 30

<210> 53

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

acgttggatg taaggtgaag cagcatctgg 30

<210> 54

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

acgttggatg tccaaacctg tgtcaagctg 30

<210> 55

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

acgttggatg ggtgcattga tggaaggaag 30

<210> 56

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

acgttggatg tttatgcagc agatgcaagg 30

<210> 57

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

cgttggatgt ttttgcagaa tccaaactga 30

<210> 58

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

acgttggatg gctagaggaa aactttgagg 30

<210> 59

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

acgttggatg gttctctttg actcacctgc aa 32

<210> 60

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

acgttggatg gtcatcccct tctaaatgcc 30

<210> 61

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

acgttggatg tttggccaac aatacacacc 30

<210> 62

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

acgttggatg gtggttcggc tttcaccagt ctg 33

<210> 63

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

acgttggatg ggtcagctct tcccttcatc 30

<210> 64

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

acgttggatg ggtgtggtca ctggacttgg g 31

<210> 65

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

acgttggatg cctcccacat gtaatgtgtt g 31

<210> 66

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

gttggatgtg tgaattttct gagacggatg 30

<210> 67

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

acgttggatg tgacgtgtct gctccacttc 30

<210> 68

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

ggatgtttgt tttctcattc catttaaagc 30

<210> 69

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

cgttggatgt ttttagcaaa agcgtccaga 30

<210> 70

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

tggatgtctc ctgaacatct aaaagatgaa 30

<210> 71

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

acgttggatg cagagggata ccatgcaaca 30

<210> 72

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 72

cgttggatga aagcagattt ggcagttcaa 30

<210> 73

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 73

gttggatgaa cttctcccat tcctttcaga 30

<210> 74

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 74

acgttggatg ggtagagggc ctgggttaag 30

<210> 75

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 75

acgttggatg gctctttagc ttcttaggac 30

<210> 76

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 76

tggtttttct aatgtgttaa agttcattgg 30

<210> 77

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 77

acgttggatg tttctcagat aactgggccc ctg 33

<210> 78

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 78

acgttggatg ttcccctgtc cctctctctt 30

<210> 79

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 79

cgttggatgt tcaggaggaa aagcacagaa 30

<210> 80

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 80

acgttggatg gctgtaatga gctggcatga 30

<210> 81

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 81

acgttggatg tgtcctggga ttctcttgct 30

<210> 82

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 82

cgttggatgc ctttccactc ctggttcttt 30

<210> 83

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 83

acgttggatg aagtgttgga agcagggaag 30

<210> 84

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 84

acgttggatg gccacagagc aagactccat 30

<210> 85

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 85

acgttggatg tttggccaac aatacacacc 30

<210> 86

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 86

gttggatggc tttcgttttg aaagcagatt 30

<210> 87

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 87

acgttggatg tgactctggg gctctgtctt 30

<210> 88

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 88

acgttggatg tgtgtcctcc ctctctgaca 30

<210> 89

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 89

acgttggatg cattttcctc ccgcaattcc 30

<210> 90

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 90

acgttggatg cagagtggat ggagaacaag g 31

<210> 91

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 91

acgttggatg cctctcaggt tccgcccc 28

<210> 92

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 92

acgttggatg ggttctccca ggctcttacc 30

<210> 93

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 93

cgttggatgc ctgagaccct tacccaattc 30

<210> 94

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 94

acgttggatg ggtcagctct tcccttcatc 30

<210> 95

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 95

acgttggatg gtggttcggc tttcaccagt ctg 33

<210> 96

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 96

acgttggatg agcaacctgt tacatattaa agtt 34

<210> 97

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 97

acgttggatg cctcccacat gtaatgtgtt g 31

<210> 98

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 98

acgttggatg ggtgtggtca ctggacttgg g 31

<210> 99

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 99

acgttggatg atactgagca aaggcaatca ac 32

<210> 100

<211> 287

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 100

ttctttttct ccccccctac cctgctagtc tggagttgat caaggaacct gactccacaa 60

agtgtgacca catattttgc aagtaagttt gaatgtgtta tgtggctcca ttttcaaaac 120

tgaaaaactc atatattcag tattttactc ccacagcacc tccccccaat ttgacccaca 180

gggaccccca tccaggtgca gggtcctcgc ctgtgtacag ggcacacctt tggtcactcc 240

aaattcccag agctcccagg gtccttctca gggtctccac ctggatg 287

<210> 101

<211> 372

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 101

tttgcctttt gagtattctt tctacaaaag gaagtaaatt aaattgttct ttctttcttt 60

ataatttata gattttgcat gctgaaactt ctcaacctga agaaagggcc ttcacagtgt 120

cctttatgta agaatgatat aaccaaaagg tatataattt ggtaatgatg ctaggttgga 180

agcaaccaca gtaggttttc aaaactgaaa aactcatata ttcagtattt tactcccaca 240

gcacctcccc ccaatttgac ccacagggac ccccatccag gtgcagggtc ctcgcctgtg 300

tacagggcac acctttggtc actccaaatt cccagagctc ccagggtcct tctcagggtc 360

tccacctgga tg 372

<210> 102

<211> 302

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 102

cacttgctga gtgtgtttct caaacaattt aatttcagga gcctacaaga aagtacgaga 60

tttagtctac ttgttgaaga gctattgaaa atcatttgtg cttttcagct tgacacaggt 120

ttggattttc aaaactgaaa aactcatata ttcagtattt tactcccaca gcacctcccc 180

ccaatttgac ccacagggac ccccatccag gtgcagggtc ctcgcctgtg tacagggcac 240

acctttggtc actccaaatt cccagagctc ccagggtcct tctcagggtc tccacctgga 300

tg 302

<210> 103

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 103

ctcagtaaat atttctagtt gaatatctgt ttttcaacaa gtacattttt ttaacccttt 60

taattaagaa aacttttatt gatttatttt ttggggggaa attttttagg atctgattct 120

tctgaagata ccgttaataa ggctacttat tgcaggtgag tcaaagagaa cctttgtcta 180

tgaagctggt tttcaaaact gaaaaactca tatattcagt attttactcc cacagcacct 240

ccccccaatt tgacccacag ggacccccat ccaggtgcag ggtcctcgcc tgtgtacagg 300

gcacaccttt ggtcactcca aattcccaga gctcccaggg tccttctcag ggtctccacc 360

tggatg 366

<210> 104

<211> 361

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 104

tggtcagctt tctgtaatcg aaagagctaa aatgtttgat cttggtcatt tgacagttct 60

gcatacatgt aactagtgtt tcttattagg actctgtctt ttccctatag tgtgggagat 120

caagaattgt tacaaatctc ccctcaagga accagggatg aaatcagttt ggattctgca 180

aaaattttca aaactgaaaa actcatatat tcagtatttt actcccacag cacctccccc 240

caatttgacc cacagggacc cccatccagg tgcagggtcc tcgcctgtgt acagggcaca 300

cctttggtca ctccaaattc ccagagctcc cagggtcctt ctcagggtct ccacctggat 360

g 361

<210> 105

<211> 293

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 105

gttgttctag cagtgaagag ataaagaaaa aaaagtacaa ccaaatgcca gtcaggcaca 60

gcagaaacct acaactcttg gaaggtaaag aacctgcaac tggagccaag aagagttttt 120

caaaactgaa aaactcatat attcagtatt ttactcccac agcacctccc cccaatttga 180

cccacaggga cccccatcca ggtgcagggt cctcgcctgt gtacagggca cacctttggt 240

cactccaaat tcccagagct cccagggtcc ttctcagggt ctccacctgg atg 293

<210> 106

<211> 268

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 106

gctagaggaa aactttgagg aacattcaat gtcacctgta agagaaatgg gaaatgagaa 60

cattccaagt acagtgagca caattagccg tttttcaaaa ctgaaaaact catatattca 120

gtattttact cccacagcac ctccccccaa tttgacccac agggaccccc atccaggtgc 180

agggtcctcg cctgtgtaca gggcacacct ttggtcactc caaattccca gagctcccag 240

ggtccttctc agggtctcca cctggatg 268

<210> 107

<211> 282

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 107

taaggtgaag cagcatctgg gtgtgagagt gaaacaagcg tctctgaaga cagctcaggg 60

ctatcctctc agagtgacat tttaaccact caggtaaaaa gcgtgttttc aaaactgaaa 120

aactcatata ttcagtattt tactcccaca gcacctcccc ccaatttgac ccacagggac 180

ccccatccag gtgcagggtc ctcgcctgtg tacagggcac acctttggtc actccaaatt 240

cccagagctc ccagggtcct tctcagggtc tccacctgga tg 282

<210> 108

<211> 279

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 108

gtcatcccct tctaaatgcc catcattaga tgataggtgg tacatgcaca gttgctctgg 60

gagacttcag aatagaaact acccatctca agaggagctc atttttcaaa actgaaaaac 120

tcatatattc agtattttac tcccacagca cctcccccca atttgaccca cagggacccc 180

catccaggtg cagggtcctc gcctgtgtac agggcacacc tttggtcact ccaaattccc 240

agagctccca gggtccttct cagggtctcc acctggatg 279

<210> 109

<211> 367

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 109

ttctgagctg tgtgctagag gtaactcatg ataatggaat atttgattta atttcagatg 60

ctcgtgtaca agtttgccag aaaactccac atcactttaa ctaatctaat tactgaagag 120

actactcatg ttgttatgaa aacaggtata ccaagaacct ttacagaata ccttgcatct 180

gctgcataaa ttttcaaaac tgaaaaactc atatattcag tattttactc ccacagcacc 240

tccccccaat ttgacccaca gggaccccca tccaggtgca gggtcctcgc ctgtgtacag 300

ggcacacctt tggtcactcc aaattcccag agctcccagg gtccttctca gggtctccac 360

ctggatg 367

<210> 110

<211> 357

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 110

aaagagcacg ttcttctgct gtatgtaacc tgtcttttct atgatctctt taggggtgac 60

ccagtcaatt aaagaaagaa aaatgctgaa tgaggtaagt acttgatgtt acaaactaac 120

cagagatatt cattcagtca tatagttaaa aatgtatttg cttccttcca tcaatgcacc 180

ttttcaaaac tgaaaaactc atatattcag tattttactc ccacagcacc tccccccaat 240

ttgacccaca gggaccccca tccaggtgca gggtcctcgc ctgtgtacag ggcacacctt 300

tggtcactcc aaattcccag agctcccagg gtccttctca gggtctccac ctggatg 357

<210> 111

<211> 319

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 111

aagtgacagt tccagtagtc ctactttgac actttgaatg ctctttcctt cctggggatc 60

cagggtgtcc acccaattga ggttgtgcag ccagatgcct ggacagagga caatggcttc 120

catggtaagg tgcctgcatg tattttcaaa actgaaaaac tcatatattc agtattttac 180

tcccacagca cctcccccca atttgaccca cagggacccc catccaggtg cagggtcctc 240

gcctgtgtac agggcacacc tttggtcact ccaaattccc agagctccca gggtccttct 300

cagggtctcc acctggatg 319

<210> 112

<211> 292

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 112

gtggttcggc tttcaccagt ctgtgcgccc tgccatgtgg aagatgatgc tcaacattga 60

tggtgtgtgg ggagagctat ggagccaggg gcaccccaag tccagtgacc acaccttttc 120

aaaactgaaa aactcatata ttcagtattt tactcccaca gcacctcccc ccaatttgac 180

ccacagggac ccccatccag gtgcagggtc ctcgcctgtg tacagggcac acctttggtc 240

actccaaatt cccagagctc ccagggtcct tctcagggtc tccacctgga tg 292

<210> 113

<211> 259

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 113

ggtcagctct tcccttcatc acatacttgg agaacaaagg acaccgttat ccatgctttt 60

tcaacacatt acatgtggga ggttttcaaa actgaaaaac tcatatattc agtattttac 120

tcccacagca cctcccccca atttgaccca cagggacccc catccaggtg cagggtcctc 180

gcctgtgtac agggcacacc tttggtcact ccaaattccc agagctccca gggtccttct 240

cagggtctcc acctggatg 259

<210> 114

<211> 368

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 114

cagagggata ccatgcaaca taacctgata aagctccagc aggaaatggc tgatctagaa 60

gctgtgttag aacagcatgg gagccagcct tctaacagct acccttccat cataagtgac 120

acttctgccc ttgaggacct gcgaaatcca gaacaaagca catcagaaaa aggtgtgtat 180

tgttggccaa attttcaaaa ctgaaaaact catatattca gtattttact cccacagcac 240

ctccccccaa tttgacccac agggaccccc atccaggtgc agggtcctcg cctgtgtaca 300

gggcacacct ttggtcactc caaattccca gagctcccag ggtccttctc agggtctcca 360

cctggatg 368

<210> 115

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 115

tctcctgaac atctaaaaga tgaagtttct atcatccaaa gtatgggcta cagaaaccgt 60

gcctaaagac ttctacagag tgaacccgaa aatccttcct tggtaaaacc atttgttttc 120

ttcttcttct tcttcttctt ttcttttttt tttctttttt ttttttgaga tggagtcttg 180

ctctgtggct tttcaaaact gaaaaactca tatattcagt attttactcc cacagcacct 240

ccccccaatt tgacccacag ggacccccat ccaggtgcag ggtcctcgcc tgtgtacagg 300

gcacaccttt ggtcactcca aattcccaga gctcccaggg tccttctcag ggtctccacc 360

tggatg 366

<210> 116

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 116

ttcaggagga aaagcacaga actggccaac aattgcttga ctgttcttta ccatactgtt 60

tagcaggaaa ccagtctcag tgtccaactc tctaaccttg gaactgagag aactctgagg 120

acaaagcagc ggatacaacc tcaaaagacg tctgtctaca ttgaattggg taagggtctc 180

aggttttcaa aactgaaaaa ctcatatatt cagtatttta ctcccacagc acctcccccc 240

aatttgaccc acagggaccc ccatccaggt gcagggtcct cgcctgtgta cagggcacac 300

ctttggtcac tccaaattcc cagagctccc agggtccttc tcagggtctc cacctggatg 360

<210> 117

<211> 355

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 117

tgtgaatttt ctgagacgga tgtaacaaat actgaacatc atcaacccag taataatgat 60

ttgaacacca ctgagaagcg tgcagcagag aggcatccag aaaagtatca gggtagttct 120

gtttcaaact tgcatgtgga gccatgtggc acaaatactc atgccagctc attacagctt 180

ttcaaaactg aaaaactcat atattcagta ttttactccc acagcacctc cccccaattt 240

gacccacagg gacccccatc caggtgcagg gtcctcgcct gtgtacaggg cacacctttg 300

gtcactccaa attcccagag ctcccagggt ccttctcagg gtctccacct ggatg 355

<210> 118

<211> 371

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 118

aaagcagatt tggcagttca aaagactcct gaaatgataa atcagggtac taaccaaacg 60

gagcagaatg gtcaagtgat gaatattact aatagtggtc atgagaataa aacaaaaggt 120

gattctattc agaatgagaa aaatcctaac ccaatagaat cactcgaaaa agaatctgct 180

ttcaaaacga aagcttttca aaactgaaaa actcatatat tcagtatttt actcccacag 240

cacctccccc caatttgacc cacagggacc cccatccagg tgcagggtcc tcgcctgtgt 300

acagggcaca cctttggtca ctccaaattc ccagagctcc cagggtcctt ctcagggtct 360

ccacctggat g 371

<210> 119

<211> 337

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 119

tttttagcaa aagcgtccag aaaggagagc ttagcaggag tcctagccct ttctcccata 60

cacatttggc tcagggttac cgaagagggg ccaagaaatt agagtcctca gaagagaact 120

tatctagtga ggatgaagag cttccctgct tccaacactt ttttcaaaac tgaaaaactc 180

atatattcag tattttactc ccacagcacc tccccccaat ttgacccaca gggaccccca 240

tccaggtgca gggtcctcgc ctgtgtacag ggcacacctt tggtcactcc aaattcccag 300

agctcccagg gtccttctca gggtctccac ctggatg 337

<210> 120

<211> 368

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 120

cagagggata ccatgcaaca taacctgata aagctccagc aggaaatggc tgatctagaa 60

gctgtgttag aacagcatgg gagccagcct tctaacagct acccttccat cataagtgac 120

acttctgccc ttgaggacct gcgaaatcca gaacaaagca catcagaaaa aggtgtgtat 180

tgttggccaa attttcaaaa ctgaaaaact catatattca gtattttact cccacagcac 240

ctccccccaa tttgacccac agggaccccc atccaggtgc agggtcctcg cctgtgtaca 300

gggcacacct ttggtcactc caaattccca gagctcccag ggtccttctc agggtctcca 360

cctggatg 368

<210> 121

<211> 329

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 121

tttgttttct cattccattt aaagcagtat taacttcaca gaaaagtagt gaatacccta 60

taagccagaa tccagaaggc cattctgctg acaagtttga ggtgtctgca gatagttcta 120

ccagtaaaaa taaagaacca ggagtggaaa ggttttcaaa actgaaaaac tcatatattc 180

agtattttac tcccacagca cctcccccca atttgaccca cagggacccc catccaggtg 240

cagggtcctc gcctgtgtac agggcacacc tttggtcact ccaaattccc agagctccca 300

gggtccttct cagggtctcc acctggatg 329

<210> 122

<211> 284

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 122

aacttctccc attcctttca gagggaaccc cttacctgga atctggaatc tgcctcttct 60

ctgatgaccc tgaatctgat ccttctgaag acagagcccc agagtcattt tcaaaactga 120

aaaactcata tattcagtat tttactccca cagcacctcc ccccaatttg acccacaggg 180

acccccatcc aggtgcaggg tcctcgcctg tgtacagggc acacctttgg tcactccaaa 240

ttcccagagc tcccagggtc cttctcaggg tctccacctg gatg 284

<210> 123

<211> 315

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 123

gctctttagc ttcttaggac agcacttcct gattttgttt tcaacttcta atcctttgag 60

tgtttttcat tctgcagatg ctgagtttgt gtgtgtacgg acactgaaat attttctagg 120

aattgcggga ggaaaatgtt ttcaaaactg aaaaactcat atattcagta ttttactccc 180

acagcacctc cccccaattt gacccacagg gacccccatc caggtgcagg gtcctcgcct 240

gtgtacaggg cacacctttg gtcactccaa attcccagag ctcccagggt ccttctcagg 300

gtctccacct ggatg 315

<210> 124

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 124

tgacgtgtct gctccacttc cattgaagga agcttctctt tctcttatcc tgatgggttg 60

tgtttggttt ctttcagcat gattttgaag tcagaggaga tgtggtcaat ggatgaaacc 120

accaaggtcc aaagcgagca agagaatccc aggacatttt caaaactgaa aaactcatat 180

attcagtatt ttactcccac agcacctccc cccaatttga cccacaggga cccccatcca 240

ggtgcagggt cctcgcctgt gtacagggca cacctttggt cactccaaat tcccagagct 300

cccagggtcc ttctcagggt ctccacctgg atg 333

<210> 125

<211> 286

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 125

ttcccctgtc cctctctctt cctctcttct tccagatctt cagggggcta gaaatctgtt 60

gcaatgggcc cttcaccaac atgcccacag gtaagagcct gggagaacct tttcaaaact 120

gaaaaactca tatattcagt attttactcc cacagcacct ccccccaatt tgacccacag 180

ggacccccat ccaggtgcag ggtcctcgcc tgtgtacagg gcacaccttt ggtcactcca 240

aattcccaga gctcccaggg tccttctcag ggtctccacc tggatg 286

<210> 126

<211> 353

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 126

ggtagagggc ctgggttaag tatgcagatt actgcagtga ttttacatct aaatgtccat 60

tttagatcaa ctggaatgga tggtacagct gtgtggtgct tctgtggtgt aggagctttc 120

atcattcacc cttggcacag taagtattgg gtgccctgtc agagagggag gacacatttt 180

caaaactgaa aaactcatat attcagtatt ttactcccac agcacctccc cccaatttga 240

cccacaggga cccccatcca ggtgcagggt cctcgcctgt gtacagggca cacctttggt 300

cactccaaat tcccagagct cccagggtcc ttctcagggt ctccacctgg atg 353

<210> 127

<211> 292

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 127

gtggttcggc tttcaccagt ctgtgcgccc tgccatgtgg aagatgatgc tcaacattga 60

tggtgtgtgg ggagagctat ggagccaggg gcaccccaag tccagtgacc acaccttttc 120

aaaactgaaa aactcatata ttcagtattt tactcccaca gcacctcccc ccaatttgac 180

ccacagggac ccccatccag gtgcagggtc ctcgcctgtg tacagggcac acctttggtc 240

actccaaatt cccagagctc ccagggtcct tctcagggtc tccacctgga tg 292

<210> 128

<211> 259

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 128

ggtcagctct tcccttcatc acatacttgg agaacaaagg acaccgttat ccatgctttt 60

tcaacacatt acatgtggga ggttttcaaa actgaaaaac tcatatattc agtattttac 120

tcccacagca cctcccccca atttgaccca cagggacccc catccaggtg cagggtcctc 180

gcctgtgtac agggcacacc tttggtcact ccaaattccc agagctccca gggtccttct 240

cagggtctcc acctggatg 259

<210> 129

<211> 262

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 129

agcaacctgt tacatattaa agttttatta tactacattt ttctacatcc tttgttttag 60

ggtgttgatt gcctttgctc agtatttttc aaaactgaaa aactcatata ttcagtattt 120

tactcccaca gcacctcccc ccaatttgac ccacagggac ccccatccag gtgcagggtc 180

ctcgcctgtg tacagggcac acctttggtc actccaaatt cccagagctc ccagggtcct 240

tctcagggtc tccacctgga tg 262