具体实施方式

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1

选择在福建省妇幼保健院行植入前遗传学检测(PGT，Preimplantation GeneticTesting)助孕的染色体平衡易位患者，纳入94个PGT周期共计246个囊胚，女性患者的平均年龄为29.27±4.15岁(20-40岁)，同时收集患者囊胚培养信息、临床信息和妊娠结果(移植者)，表1展示了其中10例染色体平衡易位患者及其囊胚的基本情况。

表1 10例染色体平衡易位患者基本信息和囊胚培养检测信息

注：X、Y代表性染色体，t表示平衡易位，rob表示罗氏易位；囊胚编号小数点前面数字代表患者编号，小数点后面数字表示同一患者中的囊胚编号；D5和D6分别表示第5和第6天囊胚，囊胚评分遵循Gardner评分标准，线粒体拷贝数即MCN，NGS表示二代DNA测序，NGS结果显示的是染色体变异情况；诊断结果是根据染色体NGS检测结果判定的，正常表示的是染色体平衡囊胚，异常表示的是染色体非平衡的囊胚。

卵母细胞采集、精液处理、ICSI、囊胚培养、囊胚滋养层细胞活检、囊胚冷冻解冻移植等操作均按照相关规范进行(黄国宁等.辅助生殖实验室技术.人民卫生出版社，2014年.等)，所有活检均在囊胚期行激光法获得。相关研究经患者充分知情同意，并获得了福建省妇幼保健院科学伦理委员会伦理批准(伦理批号：2015066)。采用二代高通量DNA测序技术测定分析活检囊胚的染色体整倍性和线粒体拷贝数，最终将其结合囊胚培养和临床妊娠信息进行同发育潜能的关联分析。主要操作和分析环节信息如下：

(1)囊胚培养、活检和冻存

通过卵胞浆内单精子显微注射即ICSI(Intracytoplasmic sperm injection)技术来完成授精，接着采用桌面台式培养箱(澳大利亚COOK公司K-MINC-1000培养箱)和G1/G2培养体系(瑞典Vitrolife公司)在6％CO₂和37℃条件下进行5-6天胚胎培养至囊胚阶段，采用Gardner评分标准进行囊胚质量评估，选择评分在3BB以上的囊胚；再采用激光对滋养外胚层进行活检，取3-6个囊胚滋养外胚层活检细胞；活检后的囊胚随即进行玻璃化冷冻(采用日本加藤公司冷冻液)，并置于液氮中保存。

(2)单细胞基因组扩增测序

使用MALBAC(multiple annealing and looping-based amplification cycles，即多次退火环状循环扩增技术)方法对活检细胞进行全基因组扩增(WGA，Whole GenomeAmplification)，随后使用HiSeq-2500平台(美国Illumina公司)按照标准流程进行NGS(next-generation sequencing)高通量基因测序，每个样本获得不低于200万个有效reads。单细胞基因组扩增采用的是亿康公司的model YK001B试剂盒，测序文库构建采用的是Next Ultra DNA Library Prep试剂盒(美国NEB公司)，按照说明书方法操作。

(3)囊胚解冻和移植

活检细胞染色体或基因检测为正常后进行对应囊胚的解冻(采用西班牙Valencia公司解冻液)和移植。在染色体整倍性(即染色体平衡)囊胚中优先选择形态学评分高的囊胚进行解冻。解冻的囊胚在自然或人工排卵后的第5或第6天进行移植。选择恰当方案准备患者的子宫内膜，其厚度不低于6mm，每个患者每次只移植一枚囊胚。囊胚移植40天后经超声观察到有心跳的宫内妊娠囊即判定为临床妊娠，所有妊娠患者均需采用羊膜穿刺产检确定胎儿染色体核型。

(4)mtDNA拷贝数测定

利用NGS数据分析计算每例测序样本的mtDNA含量，采用单位核基因组对应的mtDNA拷贝数来表征和分析，即mtDNA映射reads数与映射到常染色体reads数的比值。单位核基因组对应的mtDNA拷贝数(The mtDNA copy number per nuclear genome，MCN)的计算公式为MCN＝(常染色体映射区域×2×线粒体映射reads数)/(常染色体映射reads数×线粒体映射区域)。举例来说，假设测序得到了100个reads数，其中90个reads片段对应的到常染色体，平常reads长度为100单位长度，5个reads片段对应到线粒体，平均reads长度为1单位长度，则MCN＝(100×2×5)/(90×1)＝11.1，即代表每个核基因组对应的线粒体拷贝数为11.1，每个细胞只含1个核基因组，因此可以代表细胞中的线粒体平均拷贝数。

(5)统计学分析

相关参数采用均值±标准差进行表示，采用独立t检验比较女性患者年龄、染色体整倍性(即平衡性)、囊胚整体形态学质量、ICM评分和TE评分的差异，采用卡方检验分析妊娠结局差异。P值<0.05表示差异有统计学显著性意义，P<0.01表示差异十分显著。ROC曲线采用社会科学统计软件包(SPSS 23.0)绘制。

(6)结果分析

对于行PGT的染色体平衡易位患者而言，在目前已知的囊胚线粒体拷贝数的主要影响因素中，由于不同的患者其年龄、囊胚染色体整倍性和囊胚质量存在差异，这些会不会对线粒体拷贝数造成较大影响值得首先进行探究，因为这决定了线粒体拷贝数能否单独做为囊胚发育潜能评估指标，否则就要结合其它因素进行综合评估。

(i)囊胚MCN和女性患者年龄无关

线粒体与人体的生理状态息息相关，由于94例PGT患者年龄存在差异，这会不会影响其囊胚的线粒体拷贝数值得明晰，因此首先评估了囊胚MCN与女性患者年龄的关系。246个囊胚中的203个来自较年轻女性患者(平均年龄27.78岁，年龄段：20-33岁)，剩余的43个囊胚来源于医学上的高龄产妇(平均年龄35.63岁，年龄段：34-40岁)，对比分析这两组患者囊胚的MCN，图1结果显示没有统计学显著差异(p＝0.77)。246个囊胚中有96个整倍体囊胚，进一步地，针对分析低龄组和高龄组之间整倍体囊胚(79枚和17枚)MCN的差异，图1结果显示没有统计学显著差异(p＝0.83)。因此囊胚MCN和女性患者年龄无关。

(ii)囊胚MCN和其染色体倍性无关

接着分析囊胚MCN和其染色体倍性之间的关联性。246个囊胚中的96个经NGS检测为染色体整倍体囊胚，另外150个囊胚为染色体非整倍体胚胎，对比分析这两组之间囊胚MCN的差异，图2结果显示不存在统计学显著差异(p＝0.75)。因此囊胚MCN和其染色体整倍性无关。

(iii)囊胚MCN和其形态质量无关

进一步地分析囊胚MCN与其形态学质量评分之间的关联性。移植囊胚的选择主要依据形态学标准，囊胚形态学分级的标准是根据囊胚腔的大小和孵化程度，主要依据的是Gardner评分体系。其中ICM(inner cell mass，内细胞团)质量分为A级(细胞密集)、B级(细胞松散聚集)、C级(细胞少)；TE(Trophectoderm，滋养外胚层)质量分为A级(多细胞形成粘聚层)，B级(少数细胞形成疏松上皮)，C级(大细胞较少)。高于3BB级(包括3BB级)的囊胚为优质囊胚，未达到3BB级的囊胚为非优质囊胚。

分别在所有囊胚中对比分析优质囊胚和非优质囊胚这两组之间MCN的差异(图3A，P＝0.22)、在整倍体囊胚中对比分析优质囊胚和非优质囊胚这两组之间MCN的差异(图3B，P＝0.90)、在所有囊胚中对比分析高ICM质量和低ICM质量这两组之间MCN的差异(图3C，P＝0.60)、以及在所有囊胚中对比分析高TE质量和低TE质量这两组之间MCN的差异(图3D，P＝0.08)，结果显示各组之间均不存在统计学显著差异(图3)。综上可知，囊胚MCN与其形态质量无关。

(iv)MCN可用于预测囊胚发育潜能

由前述分析可知，囊胚MCN和女性患者年龄、染色体整倍性以及胚胎形态学质量无关。在此基础上，进一步分析囊胚MCN与临床妊娠率之间的关联。临床上目前一般只对染色体整倍性(即染色体平衡)囊胚才进行移植。在246枚囊胚中总共有57枚染色体整倍性囊胚在研究周期内进行了移植，其中有36枚成功妊娠，有21枚未成功妊娠。

对比分析临床妊娠组和非妊娠组这两组之间囊胚MCN之间的差异，结果显示(图4)两组之间MCN存在着十分显著的统计学差异(p＝0.01)。临床妊娠组囊胚的MCN低于非临床妊娠组的(199.6vs 322.4，p<0.05)，两者之间存在显著性统计学差异。结果表明临床妊娠与移植囊胚的MCN有关。为了探究囊胚MCN对于临床妊娠率的预测效果，使用受试者工作特征曲线(ROC，receiver operating characteristic curve)分析囊胚妊娠评分。以假阳性率(特异度)为横坐标，真阳性率(灵敏度)为纵坐标绘制ROC曲线，ROC曲线下面积(the areaunder the ROC curve即AUC)为0.63，特异性为92％(图4)；进一步分析得到MCN对于临床妊娠和非临床妊娠的最佳cut-off值为320.5。以MCN的cut-off值320.5为阈值进行移植囊胚的辅助选择，cut-off值以下的囊胚其临床妊娠率高达70％，显著高于只依赖于形态学质量评分的60％(本中心近年来囊胚平均妊娠数据)。

实施例2

为了验证实施例1构建的基于线粒体DNA拷贝数的染色体平衡易位患者囊胚发育潜能评估方法的可靠性和准确性，进一步纳入行辅助生殖基因检测的染色体平衡易位患者6例(编号#1-#6)，进行囊胚培养、TE活检、活检细胞基因组扩增和测序分析，选择染色体平衡(即染色体整倍性)的囊胚。按照采用的囊胚发育潜能评估方法的不同将这6例患者随机分成两组，实验组是基于本发明的MCN方法，对照组是基于传统形态学的评估方法，依据各自方法选择最佳囊胚进行移植并随访临床妊娠结果，结果详见表2。

表2两种囊胚发育潜能评估方法的对比分析

其中#1-#3号患者依据本发明提供的MCN方法，选择MCN低于320.5的囊胚(然而并非都是形态学评分最高的囊胚)进行移植，均成功实现临床妊娠。#4-#6号患者基于传统形态学方法选择最佳的囊胚进行移植，只有MCN小于320.5的#5号患者成功实现了临床妊娠，虽然该患者移植的囊胚形态学评估一般，只有5CB为非优质囊胚。其余两位患者(#4号和#6号)虽然移植的是优质囊胚，然而MCN分别为572和469，大于320.5，并未实现临床妊娠。由此可知，本发明提供的基于线粒体DNA拷贝数的染色体平衡易位患者囊胚发育潜能评估方法优于传统基于形态学的囊胚评估方法，可以准确有效筛选出高发育潜能的囊胚进行移植，使得行PGT的染色体平衡易位患者最大限度和最快实现妊娠，并且不增加患者的花费，还可以有效节约临床资源和成本。