具体实施方式

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

参照图1，为实施例1中人工合成序列的测序图谱，其横坐标为测序所用时间，纵坐标为信号强度(信号强度可理解为发生碱基配对的数目)，各立柱表示交替添加三核苷酸和单核苷酸的测序反应，各立柱上均标注有对应核苷酸的碱基种类及相应信号强度。

分析示例：通过图1可以分析出，实施例1中的人工合成序列前六个核苷酸位点上的碱基可与三核苷酸中的碱基(A、T、G)配对；第七个核苷酸位点的碱基可C配对，应该为G；按照这种方法，可对测序图谱进行分析，以对微生物的种群进行鉴定。

参照图2，为实施例1中人工合成序列的比色带，由若干矩形单元组成，一矩形单元表示一核苷酸位点，矩形单元的数目应与对应测序谱图中信号强度的加和相等。各矩形单元通过填充不同的图案或颜色，表征其测序情况。

实施例1

基于核苷酸合成测序图谱的微生物种群鉴定方法测定人工合成序列3’-AAAAAAGGAGTTAGCCGGTGCTTCT-5’，具体测序过程包括以下步骤：

(1)将5’端修饰有生物素的人工合成序列与链霉亲和素修饰的磁珠混合，室温下摇晃1小时；然后，用PBS洗涤五次后，通过磁分离获得外表固定有人工合成序列的磁珠。

(2)将分离得到的磁珠与测序引物在75℃下保温5分钟，自然冷却至室温后，将磁珠与液体分离，此时，磁珠外表固定的人工合成序列已与测序引物结合，备用。

(3)将步骤(2)分离得到的磁珠置于焦测序仪中进行测序：测序过程中，交替循环加入三核苷酸和单核苷酸进行焦磷酸测序；其中，三核苷酸选用dATPαS、dTTP和dGTP，三者含量为1:1:1，单核苷酸选用dCTP；通过测序反应得到如图1所示的测序图谱。

(4)根据上述测序图谱绘制比色带，比色带如图2所示；其中，三核苷酸对应的区域A内填充有横向线条，单核苷酸对应的区域B填充有斜向线条。

(5)结果与分析

为了表征本发明微生物种群鉴定方法在微生物种群鉴定上的效用及具体分析过程，根据已知人工合成序列3’-AAAAAAGGAGTTAGCCGGTGCTTCT-5’，制备如图3所示的预测测序图谱，并绘制预测比色带，预测比色带如图4所示。

设定人工合成序列未知，叠设并比较图2和图4展示的比色带，叠设结果如图5所示；根据叠设情况可知，实施例1绘制的比色带与预测比色带完全重合。由此分析，本发明微生物种群鉴定法，具有应用价值。

除上述叠设比色卡鉴定微生物种群的方法，还可直接分析测序图谱，对微生物的种群进行鉴定，具体鉴定过程如下：

对图1测序图谱上的各个单核苷酸进行定位，比较图1和图3上的多个单核苷酸位点，发现两测序图谱上的单核苷酸位点的数量、所处位置及强度等信息完全相同。由此可知，本发明通过比较测序图谱可以对微生物的种群进行鉴定。

实施例2

本发明还可应用于定向突变位点的测序。

选取人工合成序列3’-AAAGAAGGAGTTAGCCGGTGCTTCT-5’，该人工序列与实施例1中的人工合成序列区别在于：第四个核苷酸位点由A改为G，即定向突变为G的突变类型。本实施例的设置旨在证明本发明的鉴定方法可用于定向突变位点的测定及进一步测序，为此通过本发明微生物种群鉴定方法对上述人工合成序列进行测序分析，测序过程具体包括以下步骤：

(1)将5’端修饰有生物素的人工合成序列与链霉亲和素修饰的磁珠混合，室温下摇晃1小时；然后，用PBS洗涤五次后，通过磁分离获得外表固定有人工合成序列的磁珠；

(2)将外表固定有人工合成序列的磁珠与测序引物在75℃下保温5分钟，自然冷却至室温后，将磁珠与液体分离，此时，固定于磁珠外表的人工合成序列已与测序引物结合，备用；

(3)将步骤(2)中分离得到的磁珠置于焦测序仪中进行测序：测序过程中，交替循环加入三核苷酸和单核苷酸进行焦磷酸测序，其中，三核苷酸选用dATPαS、dTTP和dGTP，且三者含量为1:1:1，单核苷酸选用dCTP；通过测序反应得到如图6所示的测序图谱；

(4)根据测序图谱绘制比色带，比色带如图7所示；其中，三核苷酸对应的区域A为填充有横向线条的区域，单核苷酸对应的区域B为填充有斜向线条的区域。

(5)分析比色带和测序图谱

设定实施例1中的人工合成序列为未突变序列；实施例2中的人工合成序列为突变序列。

叠设并比较实施例1和实施例2中得到的比色带，结果如图8所示；未重叠位点为第4个核苷酸位点，该位点为突变位。由两比色带信息得知，突变位为A、T、C中任一种的碱基突变为了G，对突变位的核苷酸信息进行鉴定，具体包括以下操作：

对实施例1中的人工合成序列(3’-AAAAAAGGAGTTAGCCGGTGCTTCT-5’)重复进行焦磷酸测序，将三核苷酸更换为dATPαS、dCTP、dGTP，单核苷酸更改为dTTP，得出测序图谱如图9所示。

结合图7比色带和图9的测序图谱可知，突变位点为由A突变为G。由此可分析，本发明基于核苷酸测序图谱的微生物种群鉴定方法可应用于定向突变位点的测序。

实施例3

本发明微生物种群鉴定方法可对待测微生物的目标片段进行全序列检测，具体测定方法包括以下步骤：

(1)提取微生物的DNA模板，在DNA聚合酶的作用下扩增可变区，扩增产物标记有生物素；

(2)将5’端修饰有生物素的扩增产物与链霉亲和素修饰的磁珠混合，室温下摇晃1小时；然后，用PBS洗涤五次后，通过磁分离获得外表固定有扩增产物(单链DNA)的磁珠；

(3)将外表固定有扩增产物的磁珠与测序引物在75℃下保温5分钟，自然冷却至室温后，将磁珠与液体分离，此时，扩增产物与测序引物结合，备用；

(4)将步骤(2)中分离的磁珠置于焦测序仪中进行三组测序：

第一组测序，过程中交替循环加入三核苷酸和单核苷酸进行焦磷酸测序，其中，三核苷酸选用dATPαS、dTTP和dGTP，且三者含量为1:1:1，单核苷酸选用dCTP；通过测序结果，可得到DNA模板中的碱基G所处位点；

第二组测序，与第一组测序过程相同，区别在于：三核苷酸选用dATPαS、dCTP和dGTP，且三者含量为1:1:1，单核苷酸选用dTTP；通过测序结果，可得到DNA模板中的碱基A所处位点；

第三组测序，与第一、二组测序过程相同，区别在于：三核苷酸选用dATPαS、dCTP和dTTP，且三者含量为1:1:1，单核苷酸选用dGTP；通过测序结果，可得到DNA模板中的碱基C所处位点；

(5)结合上述三组测序结果，可得出DNA模板中碱基G、A、C所占的各个位点，剩余位点则为T，由此可得出DNA模板的序列。

除上述实施例1-3外，本发明微生物种群鉴定方法还可根据特定菌株常见突变类型，选择三核苷酸和单核苷酸的种类，以降低突变对鉴定结果造成的影响。同时，在对目标片段高度相似的微生物进行种群测试时，可进行两次或多次焦磷酸测序，不同焦磷酸测序中，可选用不同的三核苷酸和单核苷酸，通过整合并比较两次或多次的测序结果，对微生物的种群进行分析鉴定。

显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。