发明内容

本发明提供一种利脑心片中二苯乙烯苷含量的测定方法，所述方法，步骤如下：

步骤1，对照品溶液的制备：取二苯乙烯苷对照品，加稀乙醇制成对照品的溶液；

步骤2，供试品溶液的制备：取利脑心片，加入稀乙醇溶液适量超声30min，滤过，滤液为供试品溶液；

步骤3，阴性对照溶液的制备：按处方称取除制首乌以外的其他药材，按照处方、提取工艺、制剂工艺，在相同处方量比例下所称取不含制首乌的其余药材及辅料，配制成为缺制首乌的压片前的最终颗粒，再按照步骤2中供试品溶液的制备方法，配制得到缺制首乌阴性样品溶液；

步骤4，将对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，注入高效液相色谱仪,记录色谱图，根据色谱图峰面积，按外标法计算供试品溶液中二苯乙烯苷的含量。

上述方法中，阴性对照溶液是任选的，即测定过程中，可以使用阴性对照溶液，也可以不使用。

优选的，本发明所述方法，步骤如下：

步骤1，对照品溶液的制备：取二苯乙烯苷对照品适量，精密称定，加稀乙醇制成每1ml含20-60μg的溶液；

步骤2，供试品溶液的制备：取利脑心片，研细，称取1-3g，加入适量稀乙醇，超声处理，定容，定量后摇匀，滤过，即得；

步骤3，将对照品溶液和供试品溶液5-20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，根据色谱图峰面积，按外标法计算供试品溶液二苯乙烯苷含量。

最优选的，本发明所述方法，步骤如下：

步骤1，对照品溶液的制备：取二苯乙烯苷对照品适量，精密称定，加稀乙醇制成每1ml含40μg的溶液，即得；

步骤2，供试品溶液的制备：取本品10片，除去包衣，研细，称取1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇30～50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过(过0.22μm滤膜)，即得；

步骤3，将对照品溶液和供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，根据色谱图峰面积，按外标法计算供试品溶液二苯乙烯苷的含量；

1、色谱条件如下：

仪器：Agilent 1200

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6×250mm,5μm)

检测器：DAD检测器

流动相：乙腈-水＝15:85

检测波长：320nm。

流速：1.0ml/min

进样量：10μl

理论板数按二苯乙烯苷峰计算应不低于2000。

本发明的色谱条件(流动相的比例、流速)是经过筛选得到的，筛选过程如下：

1.1流动相比例的选择

分别考察不同流动相比例(13％乙腈、15％乙腈、17％乙腈)对二苯乙烯苷色谱峰的影响。由图2可以看出用流动相17％乙腈出峰靠前，与杂质分离不佳，而13％乙腈出峰时间靠后，且峰形不好；15％乙腈峰形较好，与杂质分离较好，故可以选择15％乙腈。

1.2不同流速的选择

分别考察不同流速(0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min)对二苯乙烯苷色谱峰的影响。由图3可见，流速对二苯乙烯苷的出峰时间较大影响，其中0.8mL/min流速出峰时间较靠后。同时杂志对目标峰影响较大。而1.0mL/min～1.2mL/min范围内峰变化较小。因此可选择1.0mL/min流速。

1.3不同进样量的选择

分别考察不同进样量(10μL、20μL)对二苯乙烯苷色谱峰的影响。由图4可见，随着进样量的加大至20μL时，杂质峰面积也随之增大，但对二苯乙烯苷的分离度影响不大，因此可选择进样量小的10μL作为条件。

本发明的方法经过核验证明效果良好。

2方法学考察

2.1专属性

分别精密吸取供试品溶液、阴性样品溶液、对照品溶液和空白溶液各10ul，注入色谱仪，记录图谱，见图1，结果表明：二苯乙烯苷峰形较好，目标成分峰与杂质峰分离情况良好，而且无阴性干扰。

2.2进样紧密度

取二苯乙烯苷对照品适量，加稀乙醇适量制成450.8μg/ml的对照品母液。精密量取对照品母液1.0mL，置于10mL容量瓶中，分别进样6针，各10μL，记录待测成分保留时间、峰面积。对照品溶液中二苯乙烯苷保留时间、峰面积RSD值分别为0.46％、0.32％，见表1，结果表明，仪器进样精密度良好。

表1进样精密度结果

2.2线性

取二苯乙烯苷对照品适量，加稀乙醇适量制成450.8μg/ml的对照品母液。精密量取对照品母液0.1、0.2、0.5、1.0、1.2、1.5mL，分置于10mL容量瓶中，分别加乙醇稀释至刻度线，摇匀，分别精密进样10μL，记录待测成分峰面积。

通过统计实验数据绘制标准曲线图，得到线性回归方程为：y＝0.5904x+0.0425，R²＝0.9990，说明二苯乙烯苷在4.058～60.88μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.3重复性

取利脑心片，除去薄膜包衣，研碎，过100目筛。称取1.0g，精密称定，平行称取6份，制得供试品溶液，分别进样，各10μL，记录待测成分峰面积，并计算含量及RSD值。

6次重复测定二苯乙烯苷含量均值为0.6600mg/g，RSD为0.34％(n＝6)(RSD＜2％)，符合2015版中国药典规定。结果表明，本方法重复性良好。见下表。

表2重复性结果

2.4稳定性

取重复性项下的供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、16、20、24h取样分析，各10μL，记录待测成分峰面积。

二苯乙烯苷24小时内峰面积RSD值为1.30％，见下表。结果表明，供试品溶液在室温放置24h内稳定。

表3稳定性结果

2.5准确度

精密称取二苯乙烯苷对照适量，配制取浓度为0.01342mg/mL的二苯乙烯苷对照品溶液。

取已知含量的利脑心片，除去薄膜包衣，研碎，过100目筛。取约0.5g，精密称定，平行称取6份，精密移取25mL上述配制对照品加入液，按本节2.2.1项下方法，制得供试品溶液，分别进样10μL，记录待测成分峰面积，并计算加样回收率。

结果表明(见下表)，本方法平均加样回收率为103.6％，RSD％值为1.10％(RSD＜2％)，符合要求。说明该方法准确度良好。

表4准确度结果

2.6样品测定

取批号1、批号2和批号3的3批样品，分别按制得供试品溶液，分别精密进样10μL，记录峰面积，并计算二苯乙烯苷的含量，结果见下表。

表5样品含量测定结果

结果表明，采用该液相方法测定的三个批次样品中二苯乙烯苷的含量结果良好。本发明没有采用现有心脑心片中二苯乙烯苷的检测方法，而是开发了新的高效液相色谱法，改进后的本发明方法能够精确测定出利脑心片中二苯乙烯苷的含量，更能有效控制利脑心片的质量，更有利于用药的有效性及安全性。