驻景圆多成分分析方法
技术领域
本发明涉及中药领域，尤其涉及中药复方的成分分析，具体地说，涉及一种驻景圆的多成分分析方法。
背景技术
驻景圆，又名驻景丸，由菟丝子、熟地黄、车前子三味药物组成，最早记载于《太平圣惠方》第三十三卷，曰：“车前子熟干地黄(净洗，酒蒸，焙，各三两)菟丝子(酒浸，别研为末，五两)，上为末，炼蜜为丸，如梧桐子大。每服三十丸，温酒下，空心、晚食前，日二服。治肝肾俱虚，眼常昏暗，多见黑花，或生障翳，视物不明，迎风有泪。久服补目力”。方中菟丝子滋阴补肾，益精明目；熟地黄补益气血；车前子清热利尿，明目。目为肝之外候，目得肝血而能视，肾精上注则目明。服用本方可使肝肾得充，目翳消除，从而使得外界之美景能够常驻于目，故名“驻景圆”。
《太平圣惠方》描述了驻景圆治疗眼疾的作用，《太平惠民和剂局方》对其功用有了更细致的描述：“治肝肾俱虚，眼常昏暗，多见黑花，或生障翳，视物不明，迎风有泪。久服补目力”，现代研究亦表明，驻景圆能缓解萎缩性年龄相关性黄斑变性(Age-related maculardegeneration，AMD)模型小鼠的视网膜病变，提高视网膜的抗氧化能力，减轻小鼠视网膜的氧化损伤，而这种作用主要是通过启动抗氧化应激的Nrf2信号通路发挥作用的，同时，驻景圆还能上调p62蛋白的表达，激活自噬，从而实现视网膜上皮细胞的自我保护能力，为视网膜提供双重保护。
鉴于驻景圆较好的疗效，对驻景圆进行多成分分析，将有助于进一步明确驻景圆的药效物质基础，为方剂提取纯化提供筛选指标，为质量标准建立提供依据，更重要的是为新药开发提供前期研究基础，但目前并未见对驻景圆的多成分分析方法的深入报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种驻景圆多成分分析方法。
本发明的再一的目的是，提供一种驻景圆的质量控制方法。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种驻景圆多成分分析方法，所述驻景圆多成分分析方法用于同时测定驻景圆中地黄苷D、异类叶升麻苷、槲皮素、黄芩素、益母草苷、山柰酚、金丝桃苷、大车前苷、京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、芦丁、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、异槲皮苷、异鼠李素、野漆树苷、芹菜素、绿原酸和异绿原酸C18种成分的含量；采用UHPLC-QQQ MS，其中：
液相条件为：
色谱柱：C18柱；流动相：A：乙腈；B：0.1％甲酸水溶液，采用梯度进行洗脱，流动相梯度如下：0.00-0.5min：A:8％，B:92％；0.05-8.00min：A:50％，B:50％；8.00-10.00min：A:70％，B:30％；10.00-10.50min：A:8％，B:92％；10.5-13.00min，A:8％，B:92％；
质谱条件为：
离子源：ESI源；扫描模式：芹菜素-7-O-葡萄糖苷﹑芹菜素﹑异槲皮苷﹑野漆树苷、异鼠李素采用正离子模式，其余成分采用负离子模式；脱溶剂管线温度：250℃；加热块温度：400℃；雾化气流速：3L·min-1；干燥气流速：15L·min-1；正离子模式检测电压：+4.5kV；负离子模式检测电压-3.5kV。
作为本发明的一个优选例，所述液相条件还包括：流速为0.4mL/min。
作为本发明的另一优选例，所述液相条件还包括：进样体积为2μL。
作为本发明的另一优选例，供试品为驻景圆方，所述驻景圆方是由车前子、熟干地黄、菟丝子按照1:(1-2):(1.5-2.5)的重量份配比制成的药物。
更优选地，所述驻景圆方为药材粉末、提取物、蜜丸、浓缩丸、滴丸、颗粒剂、片剂、胶囊剂、合剂或汤剂。
作为本发明的另一优选例，所述供试品被制成供试品溶液以进行各成分含量的测定，所述供试品溶液的制备方法为：向供试品加入甲醇，超声提取，过滤，收集滤液，蒸干定容，即得。
更优选地，所述供试品为驻景圆方的药材粉末，所述供试品溶液的制备方法为：取驻景圆方的药材粉末，加入75％甲醇，在50Hz频率下超声提取40min，过滤，收集滤液，蒸干定容，即得；其中，所述驻景圆方的药材粉末与加入的75％甲醇的比例为1g:(80-120)mL。
作为本发明的另一优选例，对照品溶液为：异鼠李素20μg/mL，芹菜素25μg/mL，槲皮素、芹菜素-7-O-葡萄糖苷各50μg/mL，其余成分各100μg/mL，溶剂为甲醇。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
一种驻景圆的质量控制方法，所述驻景圆的质量控制方法包含对驻景圆中18种活性成分的定量分析步骤，所述驻景圆中18种活性成分的定量分析步骤如上任一所述。
本发明优点在于：
本发明以《太平圣惠方》记载的经典名方驻景圆为研究对象，采用UHPLC-QQQ MS，基于发明人丰富的研究经验，选择了合适的液相和质谱条件，辅以最优色谱和质谱条件，在合理的检测通道内对其中所含的20种化合物含量进行测定，并通过线性回归考察、仪器稳定性考察、精密度考察、准确性考察和加样回收实验的系统方法学研究验证测定方法的准确性。线性考察结果发现：选定的20种化合物线性良好，R2均大于0.99；对驻景圆及其单味药供试样品进行测定得出驻景圆中能测试到18种化合物的含量；菟丝子、熟地黄和车前子供试样品分别可检测到各自化合物，且经多次进样发现含量测试稳定。同时准确性、稳定性、精密度等方法学考察结果揭示其RSD均在2％-6％之间，加样回收结果发现其加样回收率在99％-102％之间，RSD在2％-5％之间。方法稳定、可靠。本发明有助于进一步明确驻景圆的药效物质基础，为方剂提取纯化提供筛选指标，为质量标准建立提供依据，更重要的是为新药开发提供前期研究基础。
附图说明
图1：太平圣惠方与驻景圆药物组成。
图2：21种化合物总离子流(TIC)图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
第一节 驻景圆基本信息
1驻景圆文献考证与方解
1.1驻景圆文献考证
驻景圆，又名驻景丸，由菟丝子、熟地黄、车前子三味药物组成，最早记载于《太平圣惠方》第三十三卷，曰：“车前子熟干地黄(净洗，酒蒸，焙，各三两)菟丝子(酒浸，别研为末，五两)，上为末，炼蜜为丸，如梧桐子大。每服三十丸，温酒下，空心、晚食前，日二服。治肝肾俱虚，眼常昏暗，多见黑花，或生障翳，视物不明，迎风有泪。久服补目力”。
1.2驻景圆方解
方中菟丝子味辛、甘，性平；归肾、肝、脾经。滋阴补肾，益精明目，该品辛以润燥，甘以补虚，为平补阴阳之品，功能补肾阳，益肾精以固精缩尿，善滋补肝肾、益精养血而明目，故能用于肝肾不足，目暗不明，《神农本草经》言：菟丝子“久服明目”。方中熟地黄味甘，性微温；归肝、肾经，功能补血养阴，填精益髓；车前子味甘，性微寒；归肝、肾、肺、小肠经；善清肝热而明目，利尿通淋而“不走精气”(《本草择要纲目》)。《本草详节》说：“盖男女阴中各有二窍，一窍通精，一窍通水，二窍不并开，水窍开则湿热外泄，相火常宁，精窍常闭，久久精足”。《名医别录》言车前子能“养肺强阴益精”。目为肝之外候，目得肝血而能视，肾精上注则目明。全方合用，故具补益肝肾、清热明目之效，补而不腻，泄而不散。服用本方可使肝肾得充，目翳消除，从而使得外界之美景能够常驻于目，故名“驻景圆”。
2驻景圆化学成分确定
通过查阅文献，并结合菟丝子、熟地黄和车前子的研究现状，最终确定21种化合物作为待测驻景圆的目标定量物质。
表1对照品信息表
第二节 供试样品的信息
1供试品
驻景圆药材粉末(批号：20201228-1,20201228-2、2104091、2104092、2104093、2104094、2104095、2104096、2104097)，棕黄色至棕褐色，具体制备方法为：按处方量(菟丝子250g、熟地黄150g、车前子150g)称取各药材，粉碎，过4号筛(65目)，即得。驻景圆对照药材(批号：20210410-1)，具体制备方法为：按处方量(菟丝子标准品250g、熟地黄标准品150g、车前子标准品150g)称取各药材，粉碎，过4号筛(65目)，即得。熟地黄提取物(批号：SD20201228)、菟丝子提取物(批号：TS20201228)和车前子提取物(批号：CQ20201228)，熟地黄药材(批号：121196-202007)，菟丝子药材(批号：121232-201403)，车前子药材(批号：121628-201001)。
第三节UHPLC-QQQ MS条件确定
1实验仪器、耗材与试剂
1.1实验仪器
Triple Quad 4500四极杆质谱仪(SCIEX，美国)；CBX-20A型高效液相色谱仪(Waters，美国)；DHXⅡ型超声振荡仪(昆山，中国)；十万分之一电子天平(梅特勒，瑞士)；DHG型鼓风式干燥箱(上海，中国)。
1.2耗材与试剂
1000μL、500μL和100μL移液枪(艾本德，德国)；10mL、50mL和100mL容量瓶；1mL和100μL一次性枪头；滤纸、漏斗、蒸发皿等；甲酸、乙腈、甲醇等均为质谱级。
2对照品溶液配制
分别称取以上21种对照品适量，各加入甲醇制成每1mL含1.0mg的标准品母液(其中异鼠李素0.2mg/mL，芹菜素0.25mg/mL，槲皮素、芹菜素-7-O-葡萄糖苷0.5mg/mL)。
分别精密量取以上标准品母液100μL，加入900μL甲醇，配制成适宜浓度的对照品溶液。
3质谱方法的确定
离子源：ESI源；脱溶剂管线温度：250℃；加热块温度：400℃；雾化气流速：3L·min-1；干燥气流速：15L·min-1；正离子模式检测电压：+4.5kV；负离子模式检测电压：-3.5kV。
采用正负两种离子模式，测定21种目标化学成分的含量。经试验考察，其中芹菜素-7-O-葡萄糖苷、芹菜素、异槲皮苷、野漆树苷、异鼠李素在正离子模式下具有更好的稳定性，且具有较高的响应值和更好的峰形。其他化学成分在负离子模式下更为稳定，峰形及响应值较好。
表2优化的质谱条件参数
4液相方法的确定
4.1流动相梯度确定
依据系统适应性实验要求，并保证分离度，对流动相梯度进行考察(表3)，以京尼平苷酸和毛蕊花糖苷、异类叶升麻素等成分的分离度为指标考察不同流动相条件下的差异，并优选最佳流动相梯度。
表3流动相梯度设置表
注：进样体积均为2μL；流动相A：乙腈；流动相B：0.1％甲酸水溶液；柱温：40℃。
经3批重复性进样，并计算指标成分平均值的方法优选最佳流动相梯度，实验结果表明在流动相方法1下，异类叶升麻苷和毛蕊花糖苷分离度较差，而流动相方法2下，两者的分离度更好。因此综合考虑选择流动相方法2。
4.2色谱柱选择
以最佳流动相梯度为前提，对色谱柱进行考察，以ACQUITY UHPLC BEH C18硅胶键合相色谱柱(150*1.7μm，)和ACQUITY UHPLC BEH C18硅胶键合相色谱柱(150*3.5μm，)两种色谱柱，以京尼平苷酸和毛蕊花糖苷、异类叶升麻素等成分的分离度为指标考察不同色谱柱的分离效果。
两种色谱柱的检测结果显示，ACQUITY UPLC BEH C18硅胶键合相色谱柱(150*3.5μm，)因粒径过大对物质的分离效果较ACQUITY UPLC BEH C18硅胶键合相色谱柱(150*1.7μm，)差(图2)。考虑到分离效率和分离度，选择ACQUITY UPLC BEH C18硅胶键合相色谱柱(150*1.7μm，)作为下一步分离的色谱柱。
第四节 驻景圆成分提取方法单因素考察及方法学考察
1实验仪器、耗材与试剂
1.1实验仪器
Triple Quad 4500四极杆液相质谱仪(SCIEX，美国)；CBX-20A型高效液相色谱仪(SCIEX，美国)；DHXⅡ型超声振荡仪(昆山、中国)；十万分之一电子天平(梅特勒，瑞士)；DHG型鼓风式干燥箱(上海，中国)。
1.2耗材与试剂
1000μL、500μL和100μL移液枪(艾本德，德国)；10mL、50mL和100mL容量瓶；1mL和100μL一次性枪头；滤纸、漏斗、蒸发皿等，无水乙醇、甲醇；以上均为分析级，乙腈、甲酸、甲醇等；以上均为质谱级。
1.3对照品溶液配制
分别精密量取以上21种对照品适量，加入甲醇制成每1mL含1.0mg的标准品母液(其中异鼠李素0.2mg/mL，芹菜素0.25mg/mL，槲皮素、芹菜素-7-O-葡萄糖苷0.5mg/mL)。分别取以上标准母液100μL，加入900μL甲醇配制成浓度适宜的对照品溶液。
2实验方法
2.1液相与质谱方法
2.1.1质谱方法
离子源：ESI源；脱溶剂管线温度：250℃；加热块温度：400℃；雾化气流速：3L·min-1；干燥气流速：15L·min-1；正离子模式检测电压：+4.5kV；负离子模式检测电压：-3.5kV。
2.1.2液相方法
色谱柱：ACQUITY UPLCTM BEH C18硅胶键合相色谱柱(150*1.7μm，)；进样体积：2μL；流速：0.4mL/min；流动相：A：乙腈；B：0.1％甲酸水溶液；采用梯度进行洗脱，流动相梯度如下：0.00-0.5min：A:8％，B:92％；0.05-8.00min：A:50％，B:50％；8.00-10.00min：A:70％，B:30％；10.00-10.50min：A:8％，B:92％；10.5-13.00min，A:8％，B:92％。
2.2供试样品溶液制备条件优化单因素考察实验
2.2.1提取时间考察
按照《中国药典》2020年版与驻景圆相似方剂中的有效成分提取方法，并充分考虑超声时间对有效成分溶出效率的影响，特设置30min、40min、45min和75min的超声时间进行单因素考察。供试品样品处理方法如下：
取驻景圆样品1g，精密称定，4份，置于250mL锥形瓶内；加入100mL甲醇，放入超声震荡提取器内，在50Hz频率下分别超声30min、40min、45min和75min；放冷，滤过，滤液蒸干，加入5mL甲醇溶解并定容至10mL，分别标记为样品1、样品2、样品3和样品4，备用。
2.2.2提取溶剂考察
取驻景圆样品1g，精密称定，2份，置于250mL锥形瓶内；分别加入100mL甲醇和75％甲醇，放入超声震荡提取器内，在50Hz频率下按照最优提取时间进行提取；放冷，滤过，滤液蒸干，加入5mL甲醇溶解并定容至10mL，分别标记为样品1和样品2，备用。
2.3方法学考察
2.3.1线性关系考察
将不同浓度的对照品溶液注入UHPLC-QQQ-MS/MS进行分析，采用线性回归分析法对各成分的数据进行分析，得出线性方程。
2.3.2对照品溶液配制
分别精密量取以上21种对照品适量，各加入甲醇(色谱)制成每1mL含1.0mg的标准品母液(其中异鼠李素0.2mg/mL，芹菜素0.25mg/mL，槲皮素、芹菜素-7-O-葡萄糖苷0.5mg/mL)。
分别取以上标准母液100μL，加入900μL甲醇，配制成浓度适宜的对照品溶液。
2.3.3供试样品制备
取驻景圆样品1g，精密称定，6份，置于250mL锥形瓶内，加75％甲醇100mL，放入超声提取仪内在50Hz频率下超声提取40min；后采用漏斗过滤，收集滤液置于蒸发皿内，于水浴锅上蒸干；然后加75％甲醇5mL复溶，转移至10mL容量瓶内，定容至刻度，备用。
4实验结果
4.1单因素考察实验
4.1.1提取时间考察
采用Triple Quad 4500四极杆液相质谱联用仪对不同超声提取时间下的样品进行测定，以驻景圆中金丝桃苷含量、京尼平苷酸含量、毛蕊花糖苷和地黄苷D的含量为考察指标，实验结果表明较其他三个样品，样品1中的四种物质含量较低，说明30min提取时间不能完全将成分溶出；而其他三个样品中四种物质含量不存在较大的差异，综合实验结果选定40min为最优提取时间。(表4)
表4提取时间考察结果(n＝2，ng/mg)
4.1.2提取溶剂考察
采用Triple Quad 4500四极杆液相质谱联用仪对不同提取溶剂下的样品进行测定，以驻景圆中金丝桃苷含量、京尼平苷酸含量、毛蕊花糖苷和地黄苷D的含量为考察指标。最终得出采用75％甲醇提取后的样品1中四种物质含量较高。由此选定75％甲醇为提取溶剂。
表5提取溶剂考察结果
4.2方法学考察结果
4.2.1线性考察结果
结果显示，除京尼平苷酸、野漆树苷的线性相关系数R2大于0.999外，其他各物质线性相关系数R2均大于0.990；线性范围地黄苷D为2.5-1000ng/mL，槲皮素、黄芩素、山柰酚、高车前苷、儿茶素、大车前苷、芦丁、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、异鼠李素、野漆树苷、芹菜素、异绿原酸C为2.5-2500ng/mL，异类叶升麻苷、益母草苷、金丝桃苷、异槲皮苷、毛蕊花糖苷为10-10000ng/mL，京尼平苷酸与绿原酸为20-20000ng/mL。以上结果说明20种化合物在各自通道内的检测结果良好，方法可靠。
表6标准曲线结果
4.2.2精密度考察
将在驻景圆中检测到的18种物质的对照品溶液(浓度：1000ng/mL)在不同时间点注入质谱仪9次，统计其积分平均值，实验结果显示18种化合物的RSD值在2％-6％之间，说明多次进样后的浮动变化小，仪器精密度可靠。
表7仪器精密度测定结果(n＝9)
4.2.3重复性考察
按照上述供试品溶液制备方法，取同一样品平行制备6份供试品溶液，进样分析，测定结果表明，18种化合物含量的RSD在2％-6％，说明样品均一性好，供试样品制备方法稳定可靠。
表8重复性考察结果
4.2.4稳定性考察
取重复性试验中的同一份供试品溶液，按上述色谱条件分别于0，2，4，8，12，24h进样分析，分别计算各成分含量的RSD在1.3％-5.0％，结果表明供试品溶液室温下在24h内稳定。
表9稳定性考察结果
4.2.5加样回收实验
依据驻景圆18种物质的含量，精密称取相同质量的标准品，加入至供试品溶液，采用供试品溶液相同制备方法进行操作，得到加样回收供试样品，并采用最优色谱条件进行检测，计算18个成分的平均加样回收率在99％-102％之间，其RSD在2％-5％之间，表明方法回收率良好。
表10加样回收实验结果
第五节 驻景圆中主要化学成分的含量测定
按照上述所建立的测定方法对9个批次驻景圆和以对照药材配制的驻景圆进行了测定。实验结果表明，选定的21种化合物中仅能检测到18种物质，其中高车前苷、儿茶素和桃叶珊瑚苷因含量极低未检出。在检测到的18种化合物中，金丝桃苷、毛蕊花糖苷和京尼平苷酸含量较高，而芦丁的含量最少，仅为0.15ng/mg。以上试验结果充分说明，驻景圆中的三味药材中含有芦丁较少，金丝桃苷为菟丝子的主要有效成分，且菟丝子为驻景圆之君药，其含量高也在一定程度上说明了驻景圆药味配伍的合理性。
同时，分析菟丝子、熟地黄和车前子三味药材有效成分的含量测定结果，得出菟丝子中的金丝桃苷为0.124％，熟地黄中的地黄苷D为0.061％，车前子中的京尼平苷酸为0.712％、毛蕊花糖苷为0.538％，三者含量均高于《中国药典》2020年版所规定的限度。
表11驻景圆含量测定结果
表12三味药物有效成分含量测定结果
依据《中国药典》2020年版车前子、菟丝子和熟地黄药材项下含量测定限度，并对所得数据进行分析。结果，车前子中京尼平苷酸含量为7116.90μg/g，毛蕊花糖苷含量为5378.03μg/g，分别占比0.71169％和0.537803％，远远高于药典规定的0.5％和0.4％的限度；菟丝子中金丝桃苷含量为1240.30μg/g，占比0.12403％，符合不得低于0.1％的规定；同时熟地黄中的地黄苷D含量达到了609.53μg/g，占到药材质量的0.060953％，远远高于0.02％的限度。
第六节 讨论与总结
本项目采用UHPLC-QQQ MSMS对驻景圆及其单味药中的特定成分进行准确定量分析，并结合系统的方法学考察，最终测定了驻景圆中18种成分的含量。针对以上实验结果，并结合驻景圆的配伍原则，现做以下讨论与总结：
1.菟丝子、熟地黄和车前子三味药材中均含有多种化合物，其中药典规定含量测定的成分，其中菟丝子中的金丝桃苷、熟地黄中的毛蕊花糖苷和车前子中的京尼平苷酸均高于药典规定的限度，表明本研究所用的药材质量较好。
2.方法学考察结果表明驻景圆样品制备方法科学，测试方法可靠，测定结果可信。线性考察结果揭示除京尼平苷酸、野漆树苷的线性相关系数R2大于0.999外，其他各物质线性相关系数R2均大于0.990；线性范围地黄苷D为2.5-1000ng/mL，槲皮素、黄芩素、山柰酚、高车前苷、儿茶素、大车前苷、芦丁、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、异鼠李素、野漆树苷、芹菜素、异绿原酸C为2.5-2500ng/mL，异类叶升麻苷、益母草苷、金丝桃苷、异槲皮苷、毛蕊花糖苷为10-10000ng/mL，京尼平苷酸与绿原酸为20-20000ng/mL。而不同浓度的桃叶珊瑚苷对照品经多次检测均不能呈现出良好的线性，因此并未将其列入，也并未将其作为驻景丸的有效成分进行下一步实验。
3.驻景圆样品经75％甲醇提取后，所得样品采用UHPLC-QQQ MS进行分析，得出18种化合物的含量。
4.结合驻景圆18种化合物含量结果，菟丝子、熟地黄和车前子中的主要成分在含量上也呈现出较明显的优势，同时菟丝子中的成分含量要高于其他两味药物有效成分的含量，这也与三味药材在方剂中的配伍比例存在直接相关性。由此说明成分含量的差异性与驻景圆药味配伍有关。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
