一种黄氏响声含片中贝母素甲与贝母素乙含量测定方法
技术领域
本发明涉及药物有效成分的检测方法，具体涉及黄氏响声含片中贝母素甲与贝母素乙含量测定的方法。
背景技术
黄氏响声含片为复方制剂，由薄荷、浙贝母、胖大海、蝉蜕、大黄、连翘、桔梗、方儿茶、诃子肉、川芎、甘草、薄荷脑等药材组方。具有利咽开音，清热化痰，消肿止痛的功效。用于风热犯肺，肺热壅盛所致的喉暗，症见:声音嘶哑、发声疼痛、咽喉干燥；急性喉炎、慢性喉炎急性发作见上述证候者。
方中浙贝母为君药，可解毒散结消痈，其主要成分为贝母素甲(浙贝母碱)和贝母素乙(去氢浙贝母碱)，由于贝母素甲无紫外吸收，贝母素乙仅有末端吸收，不宜用紫外检测器检测，同时考虑到灵敏度及操作的简便性，因此采用HPLC－ELSD法分析，效果较佳。
现贝母素甲与贝母素乙的含量检测方法已有报道，如：中国药典2020版中载明了“黄氏响声丸中贝母素甲和贝母素乙的含量测定方法”，中国专利ZL202110444762.0也报道了黄氏响声茶中贝母素甲与贝母素乙含量测定的方法。
现有技术中的黄氏响声丸中贝母素甲和贝母素乙的测定方法，其基本步骤如下：
现有技术的缺点：
提取时间较长，浸润以及超声时间共达到了1.5小时；提取效率较低；检测时间较长。
现有技术缺少黄氏响声含片贝母素甲和贝母素乙含量测定的方法。
本发明开发一种黄氏响声含片中贝母素甲和贝母素乙含量测定的方法。本发明在现有技术的基础上，优化了提取时间，检测时间，大大提高了工作效率。
发明内容
本发明提供一种黄氏响声含片中贝母素甲和贝母素乙含量测定的方法，所述方法，步骤如下：
1)对照品溶液：取贝母素甲对照品和贝母素乙对照品，精密称定，加甲醇制成混合溶液，即得；
2)供试品溶液：取黄氏响声含片加浓氨试液-乙醇(1：2)混合溶液，加乙醚：三氯甲烷：乙醇(50：16：5)混合溶液溶解，滤过，滤渣用乙醚：三氯甲烷：乙醇(50：16：5)混合溶液洗涤，合并滤液及洗液，挥干，残渣用甲醇溶解，过滤即得；
3)测定：精密吸取对照品溶液，供试品溶液，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图峰面积，用外标两点法对数方程分别计算贝母素甲、贝母素乙的含量。
优选的，所述方法，步骤如下：
1)对照品溶液：取贝母素甲对照品和贝母素乙对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含贝母素甲0.2-0.3mg和贝母素乙0.1-0.2mg的混合溶液，即得；
2)供试品溶液：取黄氏响声含片7-9g，精密称定，滴加浓氨试液-乙醇(1：2)混合溶液10ml使湿润，密塞，放置，加乙醚：三氯甲烷：乙醇(50：16：5)混合溶液，超声处理25-35min，滤过，滤渣用乙醚：三氯甲烷：乙醇(50：16：5)混合溶液洗涤，合并滤液及洗液，水浴上挥干，残渣用甲醇溶解，转移至量瓶稀释至刻度，摇匀，过滤即得；
3)测定：精密吸取对照品溶液，供试品溶液各10-20μl，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图峰面积，用外标两点法对数方程分别计算贝母素甲、贝母素乙的含量；
最优选的，所述方法，步骤如下：
1)对照品溶液：取贝母素甲对照品和贝母素乙对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含贝母素甲0.25mg和贝母素乙0.15mg的混合溶液，即得；
2)供试品溶液：取黄氏响声含片8g，精密称定，滴加浓氨试液-乙醇(1：2)混合溶液10ml使湿润，密塞，放置20min，加乙醚：三氯甲烷：乙醇(50：16：5)混合溶液25ml，超声处理(功率250W，频率50Hz，水浴温度为30℃以下)30min，滤过，滤渣用乙醚：三氯甲烷：乙醇(50：16：5)混合溶液适量洗涤，合并滤液及洗液，60℃水浴上挥干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤即得；
3)测定：精密吸取对照品溶液20μl，供试品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图峰面积，用外标两点法对数方程分别计算贝母素甲、贝母素乙的含量；
其中，色谱条件如下：
仪器：高效液相色谱仪，ELSD检测器
色谱柱：Phenomenex Gemini-NX C18(4.6mm×150mm×5μm)
流动相：乙腈：水：二乙胺＝65：35：0.035
检测器：漂移管温度：70℃；气体流速：1.4ml/min；增益参数：1。
柱温：30℃；流速：1.0ml/min；进样量：20μl；运行时间：20min。
本发明是经过筛选得到的，筛选过程如下：
考察浸润时间，分别考察10、20、30、40min
浸润时间min
贝母素甲μg/片
贝母素乙μg/片
10
4.9
5.2
20
8.7
8.9
30
9.0
8.8
40
8.9
9.0
结果表明，浸润20min贝母素甲和贝母素乙含量结果与浸润40min相当，考虑时间成本优选20min。
浓氨试液-乙醇混合溶液比例
比例
贝母素甲μg/片
贝母素乙μg/片
1:0.5
7.0
7.4
1:1
8.7
8.9
1:2
10.5
10.6
结果表明，在浓氨试液-乙醇混合溶液比例为1:2时，提取效率相对高一些。
考察超声时间，分别考察20、30、60min
超声时间min
贝母素甲μg/片
贝母素乙μg/片
20
9.1
9.0
30
10.3
10.2
60
10.5
10.6
结果表明，超声30min贝母素甲和贝母素乙含量结果与超声60min相当，考虑时间成本优选30min。
3、考察不同色谱柱对贝母素甲和贝母素乙的含量影响
结果表明，不同色谱柱测得贝母素甲和贝母素乙含量结果相差不大，PhenomenexGemini-NX C18(4.6mm×150mm×5μm)色谱柱用20min，即可完成分析工作，且系统适用性满足要求。
本发明没有采用现有技术的方法，如以下文献中的方法:
高效液相色谱法测定浙贝母配方颗粒中贝母素甲和贝母素乙的含量，瓦布贝母与松贝母中贝母素甲和贝母素乙的含量对比研究，HPLC-ELSD法检测浙贝母中贝母素甲、贝母素乙的含量。
而是对上述现有技术的方法进行了大的改进，主要改进点在于：
①色谱柱由Agilent ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm×5μm)更换成柱长更短的Phenomenex Gemini-NX C18(4.6mm×150mm×5μm)，运行时间由40min减少到20min，大大缩短了分析的时间。
②样品超声处理时间由1小时降低到30min，缩短了样品制备的时间黄氏响声含片虽与黄氏响声丸组分相同，但处方各比例与工艺都不一致，本发明是专门测定黄氏响声含片中贝母素甲和贝母素乙含量的方法。
1、本发明可以测定黄氏响声含片中贝母素甲和贝母素乙含量的含量。
2、降低了样品提取的时间，降低了分析检测时间，提高了检测效率。
附图说明
图1对照品高效液相色谱图，对照品(保留时间5.893min为贝母素甲，保留时间7.068min为贝母素乙)
图2供试品高效液相色谱图
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
黄氏响声含片中贝母素甲和贝母素乙含量测定
1)对照品溶液：取贝母素甲对照品和贝母素乙对照品，精密称定，加甲醇制成每1ml含贝母素甲0.25mg和贝母素乙0.15mg的混合溶液，即得；
2)供试品溶液：取黄氏响声含片8g，精密称定，滴加浓氨试液-乙醇(1：2)混合溶液10ml使湿润，密塞，放置20min，加乙醚：三氯甲烷：乙醇(50：16：5)混合溶液25ml，超声处理(功率250W，频率50Hz，水浴温度为30℃以下)30min，滤过，滤渣用乙醚：三氯甲烷：乙醇(50：16：5)混合溶液适量洗涤，合并滤液及洗液，60℃水浴上挥干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤即得；
3)测定：精密吸取对照品溶液20μl，供试品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图峰面积，用外标两点法对数方程分别计算贝母素甲、贝母素乙的含量；
其中，色谱条件如下：
仪器：高效液相色谱仪，ELSD检测器
色谱柱：Phenomenex Gemini-NX C18(4.6mm×150mm×5μm)
流动相：乙腈：水：二乙胺＝65：35：0.035
检测器：漂移管温度：70℃；气体流速：1.4ml/min；增益参数：1。
柱温：30℃；流速：1.0ml/min；进样量：20μl；运行时间：20min。
检测结果：
样品
贝母素甲μg/片
贝母素乙μg/片
1
10.6
10.9
2
10.4
10.5
3
11.0
11.2
4
10.7
10.9
5
10.6
10.7
