香皂中三氯苯酚、五氯苯酚和硫氯酚含量检测分析方法
技术领域
本发明涉及香皂中2,4,6－三氯苯酚、五氯苯酚和硫氯酚含量检测的高效液相分析方法，通过盐析分相萃取-高效液相色谱法测定香皂中2,4,6－三氯苯酚、五氯苯酚和硫氯酚含量。
背景技术
2,4,6－三氯苯酚、五氯苯酚和硫氯酚对革兰氏阳性菌有强杀菌作用,因此有防腐杀菌的作用。2,4,6－三氯苯酚、五氯苯酚属于世界卫生组织国际癌症研究机构发布的二类致癌物。硫氯酚会刺激皮肤引发接触性皮炎，会对皮肤造成损伤。国家食品药品监督管理总局发布化妆品安全技术规范(2015年版)的公告(2015年第268号)规定2,4,6－三氯苯酚、五氯苯酚和硫氯酚在化妆品成分中为禁用组分，不得使用。
国内市场销售的香皂符合《化妆品监督管理条例》关于化妆品的定义，但不纳入化妆品管理。依据(EC)No 1223/2009的规定，香皂在欧盟归类为化妆品，2,4,6－三氯苯酚,五氯苯酚和硫氯酚在香皂中明确为禁用组分，不得使用。因此对外贸易中，为了保障我国出口香皂的质量，开发香皂中2,4,6－三氯苯酚、五氯苯酚和硫氯酚的检测分析方法很有必要。国内目前有适用于膏霜、乳液、液体类化妆品中2,4,6－三氯苯酚、五氯苯酚和硫氯酚检测的国标方法，膏霜、乳液、液体类化妆品中2,4,6－三氯苯酚、五氯苯酚和硫氯酚检测方法有液相色谱法、液相色谱-质谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱法和毛细管电泳法。
如果香皂采用膏霜、乳液、液体类化妆品中2,4,6－三氯苯酚、五氯苯酚和硫氯酚检测的国标方法，直接甲醇溶解定容测定主要存在两个技术问题：1)甲醇不能溶解香皂使其分散以至于不能够使目标物提取完全；2)香皂富含表面活性剂，主要是脂肪酸钠(阴离子表面活性剂)，大量的表面活性剂未经处理进入液相色谱分离柱会对色谱柱及仪器造成损伤，基质干扰大，并容易造成检测结果假阳性。
目前国内外尚未见香皂中2,4,6－三氯苯酚、五氯苯酚和硫氯酚检测方法的文献报道。
发明内容
本发明针对现有技术不足，提出一种液相色谱法测定出口化妆品香皂中2,4,6－三氯苯酚、五氯苯酚和硫氯酚含量的分析方法。该检测分析方法简单、快速、经济、高效。
本发明采用的技术方案：
一种香皂中三氯苯酚、五氯苯酚和硫氯酚含量检测分析方法，其实现步骤如下：
1)制备标准品溶液；2)制备样品，并将样品经过热水溶解，溶剂混合提取，盐析得到提取液；3)采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(5μm,4.6mm×250mm)作为分析柱，甲醇-乙腈-乙酸铵三元流动相，柱温30℃，流速1.0mL/min，检测波长为300nm，用外标法定量。
称取各标准物质适量于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，分别配制成2,4,6- 三氯苯酚、五氯苯酚、硫氯酚质量浓度为1.0mg/mL的标准储备液；将标准储备液配制成混合标准溶液，逐级稀释分别得到2,4,6-三氯苯酚、五氯苯酚的浓度为0.25、0.5、1.0、2.0、 5.0、10.0μg/mL，硫氯酚的浓度为0.125、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0μg/mL系列混合标准溶液。对各样品用60℃热水分散，再加乙腈混合后超声萃取，最后加入氯化钠盐析得到上层萃取液；超声萃取时间18-20min。
所述的香皂中三氯苯酚、五氯苯酚和硫氯酚含量检测分析方法，为了实现更好的分离效果，考察流动相体系甲醇-乙腈-5mmol/L乙酸铵水溶液(乙酸调节溶液pH＝3.5)对2,4,6- 三氯苯酚、五氯苯酚、硫氯酚的HPLC分离效果、峰形的影响，经优化实验，确定如下的梯度洗脱程序：0～3min，30％A，10％B，60％D；3～35min，30％～80％A，10％B，60％～10％D； 35～45min，80％A，10％B，10％D；45～47min，80％～30％A，10％B，10％～60％D；47～50min，30％A，10％B，60％D；其中，流动相：A为甲醇，B为乙腈，D为5mmol/L乙酸铵水溶液(pH3.5)；进样量：10μL。
发明有益效果：
1、本发明建立了盐析分相萃取-高效液相色谱法测定出口化妆品香皂中2,4,6－三氯苯酚,五氯苯酚和硫氯酚的分析方法。该方法简单，快速，经济，准确，适用于出口化妆品香皂中2,4,6－三氯苯酚,五氯苯酚和硫氯酚快速筛查和定量分析。填补了出口化妆品香皂该三种物质检测方法的空白，为出口香皂质量提供了检测技术支撑。
2、本发明香皂中三氯苯酚、五氯苯酚和硫氯酚含量检测分析方法，通过选择各标准物质的最大吸收波长为检测波长；比较溶剂甲醇、2,4,6-三氯苯酚、五氯苯酚、硫氯酚的190nm-500nm的波长全扫描，选择300nm为该三种物质的高效液相色谱仪的最佳检测波长。有效的排除了杂质干扰，增加了检测分析的灵敏度。
3、本发明香皂中三氯苯酚、五氯苯酚和硫氯酚含量检测分析方法，通过考察流动相体系甲醇-乙腈-5mmol/L乙酸铵水溶液(乙酸调节溶液pH＝3.5)对2,4,6-三氯苯酚、五氯苯酚、硫氯酚的HPLC分离效果、峰形的影响，经优化实验，确定了最佳的梯度洗脱程序，实现了更好的分离效果。
附图说明
图1为实验超声时间效果与回收率曲线图；
图2A-图2D为空白溶剂及标准溶液的紫外光谱扫描曲线图；其中A(甲醇)，B(2,4,6- 三氯苯酚)，C(五氯苯酚)，D(硫氯酚)；
图3A-图3C为混合标准溶液(A)、阴性样品加标(B)与阴性样品(C)色谱图；
图4A-图4C为不同色谱柱标准物质色谱图，出峰顺序为2,4,6-三氯苯酚、五氯苯酚、硫氯酚。其中图4A：Agilent ZORBAX SB-C18图4B：ZORBAX Eclipse XDB-C18图4C：WatersSymmetry C18。
具体实施方式
下面通过具体实施方式，结合附图对本发明技术方案做进一步的详细描述。
实施例1
本发明香皂中三氯苯酚、五氯苯酚和硫氯酚含量检测分析方法，其实现步骤如下：
1)制备标准品溶液；
2)制备样品，并将样品经过热水溶解，溶剂混合提取，盐析得到提取液；
3)采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(5μm,4.6mm×250mm)作为分析柱，甲醇-乙腈-乙酸铵三元流动相，柱温30℃，流速1.0mL/min，检测波长为300nm，用外标法定量。
实验结果表明，三种物质的线性相关系数均大于0.999，三个水平加标平均回收率71.0～ 103.0％，相对标准偏差(RSD)为3.88～8.57％(n＝6)。
实施例2
本实施例的香皂中三氯苯酚、五氯苯酚和硫氯酚含量检测分析方法，和实施例1的不同之处在于：进一步的，制备标准品溶液的过程及步骤：
称取各标准物质适量于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，分别配制成2,4,6- 三氯苯酚、五氯苯酚、硫氯酚质量浓度为1.0mg/mL的标准储备液；将标准储备液配制成混合标准溶液，逐级稀释分别得到2,4,6-三氯苯酚、五氯苯酚的浓度为0.25、0.5、1.0、2.0、 5.0、10.0μg/mL，硫氯酚的浓度为0.125、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0μg/mL系列混合标准溶液。
所述的香皂中三氯苯酚、五氯苯酚和硫氯酚含量检测分析方法，制备样品时，对各样品用60℃热水分散，再加乙腈混合后超声萃取，最后加入氯化钠盐析得到上层萃取液；超声萃取时间18-20min。
实施例3
本实施例的香皂中三氯苯酚、五氯苯酚和硫氯酚含量检测分析方法，与实施例1、实施例2不同的是：为了实现更好的分离效果，考察流动相体系甲醇-乙腈-5mmol/L乙酸铵水溶液对2,4,6-三氯苯酚、五氯苯酚、硫氯酚的HPLC分离效果、峰形的影响，经优化实验，确定如下的梯度洗脱程序：0～3min，30％A，10％B，60％D；3～35min，30％～80％A，10％B，60％～10％D；35～45min，80％A，10％B，10％D；45～47min，80％～30％A，10％B，10％～60％D；47～50min，30％A，10％B，60％D；其中，流动相：A为甲醇，B为乙腈，D为5mmol/L 乙酸铵水溶液；进样量：10μL。
实施例4
下面通过实验，对本发明香皂中三氯苯酚、五氯苯酚和硫氯酚含量检测分析方法进行更为具体的说明。
1、实验采用的主要试剂与仪器
2,4,6-三氯苯酚(ω＝99.5％)、硫氯酚(ω＝97.9％)，标准品，Dr.Ehrenstorfer公司；五氯苯酚(ω＝98.0％),标准品，坛墨质检科技股份有限公司；甲醇、乙腈，色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司；氯化钠、乙酸(冰醋酸)，分析纯，西陇科学股份有限公司；乙酸铵，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；0.22μm有机微孔滤膜，上海安谱实验科技股份有限公司；实验室用水为Millipore Milli-Q超纯水。
Agilent 1260高效液相色谱仪，配四元梯度泵，自动进样器，柱温箱，紫外检测器，美国安捷伦科技有限公司；超纯水机，美国Millipore公司；EL204电子天平(精度0.0001g)、AE204-S电子天平(精度0.00001g)、PH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；1-14小型台式离心机，德国Sigma公司；SB25-12DT超声清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；VORTEX-GENIE2漩涡混合器，美国Scientific Industries公司。
2、实验方法
2.1色谱条件
Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(5μm,4.6mm×250mm)；流动相：A为甲醇，B为乙腈，D为5mmol/L乙酸铵水溶液(pH3.5)。进样量：10μL。流速：1.0mL/min；柱温：30℃。检测波长：300nm。梯度洗脱程序：0～3min，30％A，10％B，60％D；3～35min， 30％～80％A，10％B，60％～10％D；35～45min，80％A，10％B，10％D；45～47min，80％～ 30％A，10％B，10％～60％D；47～50min，30％A，10％B，60％D。
2.2标准品溶液的制备
称取各标准物质(2,4,6-三氯苯酚，五氯苯酚，硫氯酚)适量于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，分别配制成2,4,6-三氯苯酚，五氯苯酚，硫氯酚质量浓度为1.0mg/mL的标准储备液。将标准储备液配制成混合标准溶液，逐级稀释分别得到2,4,6-三氯苯酚，五氯苯酚的浓度为0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0μg/mL，硫氯酚的浓度为0.125、0.25、 0.5、1.0、2.5、5.0μg/mL系列混合标准溶液。
2.3样品制备
称取香皂试样(均匀碎屑)0.5g于10mL具塞比色管中，加入5mL 60℃水涡旋1min分散，加入5mL乙腈后涡旋1min，超声20min，再加入1g氯化钠涡旋分层。静置1min。移取上清液12 000r/min离心，过0.22μm有机微孔滤膜后，上机测定。
3、实验结果与讨论
3.1萃取方式选择
2,4,6-三氯苯酚、五氯苯酚、硫氯酚在机溶剂甲醇和乙腈中都有较好的溶解性。采用溶剂直接提取过膜上机，基质干扰大，污染色谱柱并对色谱柱寿命有所损害。若先采用饱和氯化钠溶液分散，因甲醇和水无盐析效应，则只能使用乙腈提取分层。由于两相萃取不充分，因此实验最终选择用60℃热水分散，再加乙腈混合后超声萃取，最后加入氯化钠盐析得到上层萃取液。
3.2超声时间选择
选择超声10min、20min、30min、40min进行萃取，随着萃取时间增加，回收率有所变化。结果表明10min萃取效果不如20min、30min、40min，且20min、30min、40min 的萃取效果没有明显差异。综合考虑，为了缩短实验所需时间和提高回收率，因此选择超声 20min进行萃取。实验超声时间效果与回收率见图1。
3.3色谱条件的选择
3.3.1检测波长的选择
为排除杂质干扰增加灵敏度，一般选择各标准物质的最大吸收波长为检测波长。比较了溶剂甲醇、2,4,6-三氯苯酚、五氯苯酚、硫氯酚的190nm-500nm的波长全扫描，见图2。2,4,6- 三氯苯酚最大吸收波长为210nm-220nm，五氯苯酚最大吸收波长为210-250nm，硫氯酚最大吸收波长为210-270nm，190nm-260nm附近有甲醇的溶剂效应，300nm附近溶剂甲醇无吸收值， 2,4,6-三氯苯酚、五氯苯酚、硫氯酚在300nm有强吸收并无其它干扰。因此选择300nm为该三种物质的高效液相色谱仪的最佳检测波长。
3.3.2流动相选择
为了实现更好的分离效果，考察了三种不同的流动相体系:甲醇-乙腈-水，甲醇-乙腈 -0.1％甲酸水溶液，甲醇-乙腈-5mmol/L乙酸铵水溶液(乙酸调节溶液pH＝3.5)对2,4,6- 三氯苯酚、五氯苯酚、硫氯酚的HPLC分离效果、峰形的影响，经优化实验，最终确定了“1.2.1”中的梯度洗脱程序,能够有效分离，峰形尖锐，灵敏度高。2,4,6-三氯苯酚、五氯苯酚、硫氯酚混合标准溶液的高效液相色谱图，阴性样品加标的液相色谱图和阴性样品的液相色谱图见图3A-图3C。
3.3.3色谱柱的选择
在“1.2.1”中的梯度洗脱程序条件下，比较了Agilent ZORBAX SB-C18、ZORBAXEclipse XDB-C18和Waters Symmetry C18三种液相色谱柱，规格皆为5μm,4.6mm×250mm。查看图 4，出峰顺序为2,4,6-三氯苯酚、五氯苯酚、硫氯酚，比较塔板数和峰形，结果表明图4(A) 三个峰皆有一定程度拖尾，图4(C)硫氯酚的峰拖尾严重，导致峰高降低。因此选用ZORBAX Eclipse XDB-C18为本方法检测的色谱柱。
3.4线性关系及定量限
本试验配置系列混合标准工作溶液进行色谱测定，以外标法定量。2,4,6－三氯苯酚、五氯苯酚和硫氯酚CAS号、线性范围、线性方程、相关系数、定量限见表1。
表1三种物质的CAS号、线性范围、线性方程、相关系数、定量限
3.5回收率、精密度
按上述色谱条件和前处理方法检测，阴性样品中添加水平为定量限，二倍定量限，四倍定量限3个水平的混合标准溶液进行加标回收实验，每一加标浓度水平均制备6份平行样，阴性样品添加回收率及相对标准偏差见表2。结果表明方法平均回收率71.0％～103.0％，相对标准偏差3.88％～8.57％,该方法测定结果准确，能够用于出口化妆品香皂2,4,6－三氯苯酚,五氯苯酚和硫氯酚的定量分析。
表2阴性样品添加回收率及相对标准偏差(n＝6)
3.6实际样品的测定
采用建立的方法对出口化妆品香皂共8批次进行检测，结果均未检出禁用组分2,4,6－三氯苯酚,五氯苯酚和硫氯酚，也没有发现其他成分的干扰。
结论：本研究建立了盐析分相萃取-高效液相色谱法测定出口化妆品香皂中2,4,6－三氯苯酚,五氯苯酚和硫氯酚的分析方法。该方法简单，快速，经济，准确，适用于出口化妆品香皂中2,4,6－三氯苯酚,五氯苯酚和硫氯酚快速筛查和定量分析。填补了出口化妆品香皂该三种物质检测方法的空白，为出口香皂质量提供了检测技术支持。
