一种检测SARS-CoV-2 RNA的探针组、ECL生物传感器及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物
技术领域
，具体涉及一种检测SARS-CoV-2 RNA的探针组、电化学传感器及其制备方法和应用。背景技术
由新型冠状病毒(严重急性呼吸道综合征相关冠状病毒2，SARS-CoV-2)引起的2019年冠状病毒病(COVID-19)已经在世界范围内造成了重大威胁和挑战(Lukas等人，2020)。由于它的高传染性、高发病率和高死亡率，它对全球公共卫生以及世界经济活动造成了巨大的伤害和损失，累计夺去了全球超过一百万人的生命。目前，对这种病毒的早期诊断以及抗病毒疫苗和药物的开发为抑制SARS-CoV-2大流行提供了主要方法。特别是随着病毒突变的出现，对病毒进行早期快速诊断的需求显得持续而迫切。基于反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)的SARS-CoV-2检测方法往往需要通过复杂的步骤从病毒样本中提取RNA。整个实验过程通常需要6个小时，这就无法实现实时诊断的目标，同时也影响了病毒检测的效率。
簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(Cas)系统，即CRISPR/Cas，是一种革命性的强大的基因组编辑工具，只需要一小段RNA序列，通过利用RNA和DNA之间的相互作用来锚定新基因的位置，大大降低了新合成蛋白的工作量和成本。Cas9、Cas12a、Cas13和Cas14等Cas蛋白可以非特异性地水解单链DNA或RNA，这被称为反式裂解特性，在分子诊断中显示出巨大的潜力。当Cas12a/crRNAs复合物识别目标dsDNA时，它们表现出与单链脱氧核糖核酸酶(ssDNase)对周围ssDNA的非特异性水解类似的反式裂解特性。然而，在医疗点诊断下的应用受到大型和昂贵的光学设备的限制。因此，开发不依赖昂贵的光学仪器的其他模式下的检测应用方法已经变得非常重要和相关。
电化学发光(ECL)是传统电化学(EC)和化学发光(EL)的结合，具有反应时间快、低背景信号和高灵敏度等优点，在核酸、蛋白质和小生物分子的分析中具有广泛的应用前景。常见的ECL生物传感系统需要ECL试剂和共反应物，它们共同构成系统的信号输出。然而，由于ECL试剂和共反应物相互分离，增加了电子传递距离，带来了试剂消耗严重和影响ECL强度的问题。基于以上考虑，人们设计了分子内ECL试剂，以改善电子能量损失和试剂消耗的情况。例如，Sun等人通过构建分子间酰胺键将Ru(bpy)3 2+衍生物与共反应物三丙胺连接起来，构成了一种新型的ECL发射器，提高了ECL性能和发射效率。此外，Gui等人提出了一种支链聚合物聚乙稀(BPEI)和Ru(bpy)3 2+通过共价键连接的自强化复合物，改善了传统ECL发射试剂容易扩散到水体中的缺陷和分子间反应的ECL强度的不足。聚乙烯亚胺(PEI)作为活性核心试剂可以提高Ru(bpy)32+的ECL强度，因此构建稳定的ECL发射试剂和PEI的分子内反应体系有利于改善试剂损耗和ECL发射效率。
金属有机框架(MOF)材料，也被称为金属有机配位聚合材料，是由无机金属通过共价键与有机配体结合形成的复合物。它们的结构具有网络状的孔隙，在气体吸附、物质运输、生物催化反应、细胞成像和其他领域有重要的应用。由锌离子和咪唑配体构建的沸石咪唑框架-8(ZIF-8)，由于其简单的合成、大的比表面积以及在光催化中的优异表现，已经被广泛用于生物医学以及催化领域。它在高浓度的H+或GSH下是不稳定的，可以在肿瘤微环境中作为药物载体。此外，它被广泛用于纳米材料的装载，因为它可以防止纳米材料的聚集，改善纳米材料的分布，以提高其光学、电学和催化性能。
催化发夹组装(CHA)作为一种无酶的信号放大技术，已经表现出优异的信号放大效果。最近，它已被广泛用于生物测定，并极大地提高了生物传感系统的灵敏度。在通用CHA反应中，两条发夹结构的DNA链在发夹柄上有互补的序列。在有单链核酸存在的情况下，趾状物介导的链位移(TMSD)被触发，打开两个发夹结构的DNA链，然后迅速形成热力学上稳定的DNA双链。特别是，通过对DNA序列进行编程，第一个CHA反应形成的双链DNA(dsDNA)可以触发另一个CHA反应，形成新的dsDNA，用于信号级联扩增。微RNA(miRNA)是非编码单链DNA，非常适合触发CHA反应和进行miRNAs检测(Si等人，2020)。然而，为了获得更高的灵敏度，使用双链特异性核酸酶(DSN)将miRNAs转化为DNA链，作为触发链来克服miRNAs降解的限制。
发明内容
因此，为了克服现有技术血清中的SARS-CoV-2抗体检测可用于诊断症状出现后的冠状病毒感染，但由于在感染后期才有足够的可检测抗体量而受到限制的缺陷。本发明提供一种快速、敏感检测SARS-CoV-2的方法、探针组、检测SARS-CoV-2 RNA的系统、ECL生物传感器。
本发明提供一种探针组，包括核苷酸序列如SEQ ID：NO.1所示的发夹探针；核苷酸序列如SEQ ID：NO.2所示的发夹探针；核苷酸序列如SEQ ID：NO.3所示的发夹探针。
试剂盒，包括上述探针组，各条探针独立包装。
一种检测SARS-CoV-2 RNA的系统，包括探针组和CRISPR/Cas12a系统。
可选的，还包括ECL(电致化学发光)生物传感器。
可选的，所述CRISPR/Cas12a系统包括CRISPR-Cas12a蛋白和核苷酸序列如SEQID：NO.4所示的gRNA。
可选的，ECL生物传感器的制备方法包括如下步骤：
1)将Nafion通过静电吸附修饰GCE，得到Nafion/GCE；
2)将金属-有机框架材料通过静电吸附作用修饰到Nafion/GCE上，得到Ru-PEI/[email protected]/Nafion/GCE；
3)将C3N4滴加到Ru-PEI/[email protected]/Nafion/GCE上，得到ECL生物传感器。
可选的，所述金属-有机框架材料为zif-8；所述金属-有机框架材料为金掺杂、修饰了自增强钌复合物的ZIF-8
一种检测SARS-CoV-2的方法，包括使用上述的检测SARS-CoV-2 RNA的系统检测SARS-CoV-2的步骤。
可选的，具体包括如下步骤：
1)含有Mg2+、DSN和H1发夹探针的溶液(溶液A)与不同浓度的SARS-CoV-2 RNA溶液(溶液B)在60±5℃下反应75分钟以上，得到反应液1；H1发夹探针的核苷酸序列如SEQ ID：NO.1所示；
可选的，溶液A中Mg2+的浓度为10mM、DSN的浓度为0.05Uμ/L、H1发夹探针的浓度为5μM；
溶液A与溶液B的体积份均为6；
2)使DSN酶失活，得到反应液2；3)将含有等摩尔的H2发夹探针和H3发夹探针的溶液(溶液C)依次加入反应液2中；在4℃下保持16小时以上，得到含有H2/H3双链的反应液3；H2发夹探针的核苷酸序列如SEQ ID：NO.2所示；H3发夹探针的核苷酸序列如SEQ ID：NO.3所示；可选的，溶液C体积份为3；
4)将Cas12a蛋白、gRNA和反应液3混合，室温孵育，得到反应液4；gRNA的核苷酸序列如SEQ ID：NO.4所示；具体为将含有50nM Cas12a、50nM gRNA、10U RNase抑制剂的混合物25体积份与25体积份反应液3混合；
5)将Fc标记的DNA探针加入反应液4中；
6)将反应液4滴加到的ECL生物传感器表面。
可选的，步骤2)还包括抑制DSN的酶活性的步骤。
H1发夹探针的第9-29位为环状区，其余为茎秆区；
H2发夹探针的第31-51位为环状区，其余为茎秆区；
H3发夹探针的第16-35位为环状区，其余为茎秆区；
探针组、试剂盒、系统在检测SARS-CoV-2 RNA中的应用。所述方法或应用为非疾病诊断治疗方法或应用。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明提供一种探针组，能够用于检测SARS-CoV-2 RNA。
2、本发明提供一种检测SARS-CoV-2 RNA的系统，在ZIF-8的表面链接了自增强的钌复合物，在不添加共反应物的情况下获得了高的分子内电子转移效率，从而获得了强而稳定的ECL信号。DSN参与的目标循环和CHA信号放大，既实现了信号的级联放大，又将不稳定的目标RNA转变成稳定的dsDNA进行输出。该策略中的dsDNA可以激活Cas12a的反式裂解特性，裂解与C3N4表现出亲和力的Fc标记的DNA探针。因此，目标RNA的浓度可以决定吸附在C3N4表面的Fc标记的DNA探针的数量，从而直接影响ECL强度。本发明提出的SARS-CoV-2RNA检测策略具有很好的特异性和可重复性，并且能够快速检测人血清稀释液中的目标RNA，对临床和生化分析很有希望。
3、本发明合成了ZIF-8，，然后对其表面的氨基进行修饰，并与自强化的Ru-PEI复合物耦合，得到Ru-PEI/ZIF-8，其中PEI是一种活性物质，具有增强Ru ECL强度的特性，有利于提高ECL的发射强度和效率。同时，为了提高电极上的电荷转移效率，增强ECL发射体的导电性，在[email protected]的表面修饰了金纳米粒子，从而在电极表面形成了优良的Ru-PEI/[email protected]发射材料，用于生物感应。
4、DSN酶和CHA反应的结合大大提高生物样品中miRNAs检测的灵敏度，并避免CHA反应的DNA序列重编程。
附图说明
为了更清楚地说明本发明
具体实施方式
或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1(A)是实施例1中的ZIF-8的TEM图像；
图1(B)是实施例1中的Ru-PEI/[email protected]的TEM图像；
图1(C)是实施例1中的Ru-PEI/[email protected]的元素图谱(Ru,Zn,N,和Au,)
图2(A)是实施例1中的Ru-PEI/[email protected]的XPS光谱，插图是图2A中放大的金4f；
图2(B)是实施例1中的Ru-PEI/[email protected]的EDS光谱；
图3(A)实施例2中的EIS光谱表征ECL生物传感器的组装过程及SARS-CoV-2 RNA检测；横坐标实部阻抗(Ω)，纵坐标虚部阻抗(Ω)；图3A中的插图是改性GCE(ECL生物传感器)的模拟电路；
图3(A)中的：
(a)Nafion/bare GCE,
(b)Ru-PEI/[email protected]/Nafion/bareGCE,
(c)C3N4/Ru-PEI/[email protected]/Nafion/bare GCE,
(d)Fc标记DNA探针/Ru-PEI/[email protected]/Nafion/bare GCE；
(e)目标(100fM)反应溶液/Ru-PEI/[email protected]/Nafion/bare GCE,
(f)目标(1pM)反应溶液/Ru-PEI/[email protected]/Nafion/bare GCE；
图3(B)ECL反应表征生物传感器的组装过程及SARS-CoV-2 RNA检测；ECLintensity表示ECL强度；图3(B)中的：
(a)Nafion/bare GCE,
(b)Ru-PEI/[email protected]/Nafion/bareGCE,
(c)C3N4/Ru-PEI/[email protected]/Nafion/bare GCE,
(d)Fc标记DNA探针/Ru-PEI/[email protected]/Nafion/bare GCE；
(e)目标(100fM)反应溶液/Ru-PEI/[email protected]/Nafion/bare GCE,
(f)目标(1pM)反应溶液/Ru-PEI/[email protected]/Nafion/bare GCE；
图3B中的插图是与图3B中ECL-时间曲线对应的ECL-电位曲线；potential表示电位；
图4(A)实施例3中一系列浓度(1fM,10fM,20fM,100fM,200fM,1pM,2pM,10pM,20pM,和100pM,从a到j)的SARS-CoV-2 RNA检测的ECL-时间曲线；ECL intensity表示ECL强度；
图4(B)是实施例3中ECL强度与SARS-CoV-2 RNA浓度的对数值之间的数学关系；ECL intensity表示ECL强度；
图4B的插图是ECL强度和图4B中框起来的目标(SARS-CoV-2 RNA浓度)的对数值之间的线性关系；
图5实施例4的ECL生物传感器在以下情况下的ECL性能：
(A)检测目标RNA(1pM)或其他非特异性RNA(100pM)，用于验证ECL生物传感器的特异性；ECL intensity表示ECL强度；
(B)用带有突变位点的gRNA(gRNA1、gRNA2和gRNA3)替换实施例2中的gRNA，用于验证ECL生物传感器的特异性；ECL intensity表示ECL强度；
(C)在25个周期的恒定电位扫描中检测1pM的目标RNA以表征ECL生物传感器的稳定性；ECL intensity表示ECL强度；
图6为使用CRISPR-Cas 12a反式切割特性及ECL生物传感器检测SARS-CoV-2 RNA的示意图。
具体实施方式
材料与试剂
检测SARS-CoV-2 RNA的相关核酸通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化，均购自Genscript生物技术有限公司(中国南京)，其序列列于表1。
分析级化学品有乙酸锌脱水剂(Zn(AC)2-2H2O)、2-甲基咪唑、乙二胺四乙酸(EDTA)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、N-(3-(二甲胺)丙基)-N-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、硼氢化钠(HAuCl4)和有机溶剂如甲醇、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)均购自阿拉丁生化科技有限公司。双链特异性核酸酶(DSN)和C3N4分别来自EVROGEN(北京，中国)和XFNANO(南京，中国)。CRISPR-Cas12a蛋白和三(4,4'-二羧酸-2,2'-联吡啶)二氯化钌(Ru(dcbpy)3 2+)分别来自新英格兰生物实验室(NEB，中国上海)和Suna Tech Inc.(Suzhou,China)，三硼酸盐-EDTA(TBE)缓冲液和磷酸盐缓冲盐水(PBS)，均购自Sangon生物技术有限公司。所有实验中的水都是由Milli-Q纯化系统(Branstead)纯化，并保持在5MΩ的电阻。
表1.下列实施例中用到的序列。
表2
miRNA 133a
agc ugg uaa aau gga acc aaa u(SEQ ID：NO.10)
miRNA 499
uua aga cuu gca gug aug uuu(SEQ ID：NO.11)
miRNA 208b
aag cuu uuu gcu cga auu aug u(SEQ ID：NO.12)
miRNA 328
cug gcc cuc ucu gcc cuu ccg u(SEQ ID：NO.13)
仪器与测试方法
用阻抗光谱(EIS)和循环伏安法(CV)来说明描述电极修饰过程中能量和物质转移的电化学活动，这些测量是由CHI 660E(上海晨华仪器有限公司)进行。
EIS实验是通过设置参数，在含有5mM[Fe(CN)6]3-/4-的PBS溶液(0.1M，pH＝7.4)中，保持5mV的振幅，频率为0.1-10kHz，以扫描不同修饰状态的电极。
整个ECL测试使用了由生命科学分析化学国家重点实验室(南京大学)提供的三电极系统，其中工作电极为(玻璃碳)电极(GCE)，参比电极为Ag/AgCl电极，反电极为铂电极。透射电子显微镜(TEM)的特性是用1400PLUS(日本电子)完成的。
紫外-可见光谱用于描述Ru-PEI/[email protected]的合成，使用Spectra Max M5e(Molecular Devices Co.Ltd)。
X射线光电子能谱(XPS)表征是由Thermo Fisher K-Alpha得到的。
实施例1
1.1 Ru-PEI/[email protected]的合成
1.1.1合成ZIF-8
1)将乙酸锌脱水剂(Zn(AC)2-2H2O)加热到55℃，并保持45分钟以除去晶体中的水分，得到Zn(AC)2粉末；
2)将Zn(AC)2粉末(200mg)和2-甲基咪唑(295mg)溶于甲醇(22毫升)。然后在连续搅拌下用水稀释该混合物，得到最终浓度分别为1mmol的Zn(AC)2和3.3mmol的2-甲基咪唑的混合物。当混合物变成乳白色时，在室温下搅拌老化一天。
3)将混合物离心，用甲醇和水反复洗涤，然后在恒温箱中干燥，得到白色粉末即ZIF-8，用于下一步改性。
对ZIF-8表面进行氨基改性，包括以下步骤：
1)将1.5mg的ZIF-8超声处理到20毫升的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，得到均匀分散的悬浮液；
2)在连续搅拌下向悬浮液中加入150μL的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)，并在125℃下保持加热20分钟以形成氨基改性的ZIF-8；
3)将悬浮液以12000rpm离心，用DMF洗涤三次，得到NH2-ZIF-8。
1.12自增强的Ru-PEI复合物的合成方法如下：
1)将10mg的Ru(dcbpy)3 2+溶解在2mL的超纯水中，得到5mg/mL的Ru(dcbpy)3 2+水溶液。
2)在Ru(dcbpy)3 2+水溶液加入最终浓度分别为15mg/mL和3mg/mL的EDC和NHS来激活Ru(dcbpy)3 2+的羧基。
3)在被激活30分钟后，被激活的Ru(dbbpy)3 2+与2mL质量分数为1％的PEI溶液反应2.5小时，形成自增强的Ru-PEI复合物溶液。
1.1.3 Ru-PEI/[email protected]的合成方法如下：
1)将4.5mL1.1.2中形成的自增强的Ru-PEI复合物溶液、30mg EDC和5mg NHS加入到10mL准备好的NH2-ZIF-8(30mM)中，并在室温下搅拌反应4小时，然后向混合物中加入最终浓度为0.01％(质量百分含量)的氯尿酸和柠檬酸钠(与氯尿酸等摩尔)。
2)步骤1)的混合物中，在搅拌下加入100mM HAuCl4以还原Au3+，并在搅拌下反应4小时以确保Au在[email protected]上的嵌入和吸附。
3)将产品(Ru-PEI/[email protected])离心，用超纯水洗涤，并分散在10mL超纯水中，以便进一步使用。
1.2 Ru-PEI/[email protected]的表征
首先，通过TEM说明了Ru-PEI/[email protected]的合成过程。图1A是ZIF-8的TEM图像，可以看出ZIF-8呈现十二面体状颗粒，颗粒分布均匀，大小约为200nm。随着ZIF-8表面氨基的修饰，加载了Ru-PEI和Au纳米颗粒，如图1B所示，可以发现规则的几何颗粒表面变得模糊，这可以归因于Ru-PEI在其表面的吸附和Au3+还原的结果。为了进一步验证这一结论，本实施例探讨了纳米粒子表面的元素，元素图谱(图1C)显示，以Zn为核心元素的ZIF-8构成了以Ru为基本元素的Ru-PEI和以Au为基本元素的Au纳米粒子的吸附载体，这也推断出Ru-PEI/[email protected]是按照本实施例设计的合成路线合成的。
本实施例还通过X射线光电子能谱(XPS)对Ru-PEI/[email protected]进行了元素表征(如图2A)，其中出现的特征峰如O1s(531.1eV)、N1s(399.6eV)，C1s(284.6eV)，Ru3p，Au4f(4f5/2为87.1eV，4f7/2为83.5eV)，Zn2p(2p1/2为1044.9eV，2p3/2为1021.7eV)，表明成功合成了Ru-PEI/[email protected]。为了进一步表征Ru-PEI/[email protected]的形成，本实施例也对Ru-PEI/[email protected]的元素组成进行了EDS光谱表征，如图2B所示，这表明纳米复合物含有所有预期的元素，得到了理想的纳米复合物发射体。
实施例2
2.1 ECL生物传感器的制备，包括如下步骤：
S1：在建造传感器之前，需要对GCE进行清洗。将直径为3毫米的GCE浸入食人鱼溶液中(其中98％(v/v)的H2SO4和30％(v/v)的H2O2的摩尔比为4比1)，以去除电极表面的非特异性吸附物质，然后用0.05μm的氧化铝粉末反复抛光，并在乙醇和水中进行超声波清洗，直到出现一个明亮、干净的界面。然后在浓度为0.1M的硫酸中激活电极，电压为-0.8-0.8V，扫描速率为0.1V/s，直到出现连续稳定的CV峰。用超纯水冲洗后，电极在干燥的N2下干燥，用于下一步生物传感器的构建。
S2：将0.5％(质量百分数)的Nafion(N169478-5ml，阿拉丁)和8μL的Ru-PEI/[email protected]滴在GCE的无斑点表面，依次得到Nafion/GCE和Ru-PEI/[email protected]/Nafion/GCE。随后，在避光条件下，将8μL C3N4滴加到Ru-PEI/[email protected]/Nafion/GCE上，得到C3N4/Ru-PEI/[email protected]/Nafion/GCE。之后，用PBS溶液清洗C3N4/Ru-PEI/[email protected]/Nafion/GC,成功构建了用于SARS-COV-2 RNA检测的ECL生物传感器。
2.2使用CRISPR-Cas 12a反式切割特性及ECL生物传感器检测SARS-CoV-2 RNA
涉及DSN的目标循环以及CHA扩增技术程序，具体包括如下步骤：
1)需要将所有发夹DNA(表1中的H1发夹探针、H2发夹探针和H3发夹探针)加热到95℃，并在10分钟内冷却到25℃。
2)将6μL含有10mM Mg2+、DSN(0.05Uμ/L)、H1发夹探针(5μM)的溶液与6μL不同浓度的SARS-CoV-2 RNA溶液在60±5℃下反应75分钟，得到反应液1。
3)反应液1中加入15μL的EDTA溶液(10mM)，在50℃下持续30分钟以抑制DSN的酶活性。接下来，将混合物迅速加热到90℃并保持10分钟，然后冷却到4℃，使DSN酶的活性完全丧失，得到反应液2。
4)将3μL H2和H3发夹探针浓度均为10μM的溶液加入到反应液2中，在4℃下保持16小时，最终得到H2/H3杂交的dsDNA，得到反应液3。
随后，H2/H3参与了Cas 12a引导的反式裂解。具体来说，包括如下步骤：
S1：将含有50nM Cas12a、50nM gRNA、10U RNase抑制剂多种成分的混合物(25μL)与25μL的反应液3混合，并在室温下孵化20分钟，得到反应液4。
S2:将反应液4与二茂铁(Fc)修饰的DNA探针(Fc修饰的DNA探针的终浓度为100nM)25℃反应2小时，得到最终反应溶液。
S3:将10μL最终反应溶液在4℃下滴在用于SARS-COV-2 RNA检测的ECL生物传感器表面，反应1小时，并用PBS溶液(0.1M，pH＝7.4)清洗，得到Fc标记的探针/C3N4/Ru-PEI/[email protected]/Nifion/GCE。
S4：用PBS溶液(0.1M，pH＝7.4)冲洗电极，以去除非特异性吸附的物质。
S5：在PBS(0.1M，pH＝7.4)溶液中收集ECL信号，电位范围为0到1.3V。
2.3使用CRISPR-Cas 12a反式切割特性及ECL生物传感器SARS-CoV-2 RNA检测的原理
在本实施例利用CRISPR-Cas12a反式裂解特性构建的检测SARS-CoV-2 RNA的ECL生物传感器中。本发明合成了ZIF-8，如图6A所示，然后对其表面的氨基进行修饰，并与自强化的Ru-PEI复合物耦合，得到Ru-PEI/ZIF-8，其中PEI是一种活性物质，具有增强Ru ECL强度的特性，有利于提高ECL的发射强度和效率。同时，为了提高电极上的电荷转移效率，增强ECL发射体的导电性，在[email protected]的表面修饰了金纳米粒子，从而在电极表面形成了优良的Ru-PEI/[email protected]发射材料，用于生物感应。
图6B说明了DSN辅助的目标回收和CHA信号放大方法。在涉及DSN的目标回收过程中，目标RNA首先与发夹H1结合，打开H1的颈环结构。由于DSN酶在双链DNA或DNA/RNA中切割DNA的独特特性，使靶RNA不断循环，产生H1的残余片段来打开发夹H2。同样地，H1的残余片段与H2结合，H2的颈环结构被打开。由于打开的H2有一个能够打开发夹H3的核酸片段，而且H2与H3的结合比H1残留片段更强，所以H1残留片段被释放出来，循环打开H2，最终产生大量的H2/H3双链。然后这些双联体接下来激活Cas12a/gRNA的反式裂解特性，不断裂解Fc标记的DNA探针分子。
图6C描述了Ru-PEI/[email protected]被修饰到GCE表面，然后C3N4被滴涂到电极上以稳定ECL信号。Fc标记的DNA探针可以强烈地吸附在C3N4表面，并大大淬灭ECL信号。然而，当目标RNA存在时，Fc标记的DNA探针会被水解，所以ECL的强度比没有目标RNA存在时强。因此，目标浓度可以从ECL强度中推断出来。
2.4 ECL生物传感器构建的验证和SARS-CoV-2 RNA检测策略的验证
为了说明所提出的传感器的分步组装和检测过程，进行了EIS表征，结果见图3(A)。首先，测试了用Nafion修饰的裸露GCE的电子转移条件(曲线a)，并呈现出相对较低的电子转移电阻。图3(A)的插图显示了电极修饰过程中的模拟电路，其中电荷转移的电阻(Rct)主要由Nyquist图的高频半圆显示。随着Ru-PEI/[email protected]的修饰(曲线b)，由于Au在ZIF-8上具有良好的导电性，电荷转移的效率得到提高，导致Rct下降。当C3N4被滴在改性的GCE上时(曲线c)，由于非导电材料的改性增加了电荷转移的阻力，导致了Rct的增加。当Fc标记的DNA探针被吸附在C3N4上时(曲线d)，Rct增加，因为它导致电荷转移的阻力更大。随着目标RNA的出现和浓度的变化(曲线e)和(曲线f)，最终导致了Fc标记的DNA探针的部分水解，导致Rct下降。
本实施例还调查了每个步骤的修饰和检测过程中的ECL反应。如图3(B)所示，Nafion修饰的GCE(曲线a)没有ECL信号。而当Ru-PEI/[email protected]滴在改性GCE上时(曲线b)，ECL信号出现了强烈的反应。随着C3N4的修饰(曲线c)，ECL信号略有下降，因为C3N4掩盖了发射体。随着Fc标记的DNA探针在C3N4上的修饰(曲线d)，ECL信号由于二茂铁的强淬灭作用而明显下降。然而，随着目标DNA的存在，由于Cas 12a的反式裂解特性，Fc标记的DNA探针被部分水解，导致ECL信号明显增加(曲线e和f)，与单独孵化Fc标记的DNA探针相比。EIS表征和ECL反应都表明ECL生物传感器的成功制造和所提出的SARS-CoV-2RNA检测策略的建立。
实施例3使用CRISPR-Cas 12a反式切割特性及ECL生物传感器对SARS-CoV-2 RNA的检测
为了证明实施例2中的使用CRISPR-Cas 12a反式切割特性及ECL生物传感器对SARS-CoV-2 RNA的检测水平，本实施例分析了ECL强度与目标RNA浓度之间的关系，得到了它们之间的数学关系，从而实现了根据信号强度推断目标浓度的可能性。如图4(A)所示，当样品中SARS-CoV-2 RNA(SEQ ID：NO.5)的浓度增加时，ECL强度逐渐变强，这进一步印证了靶标RNA可以驱动DSN酶随CHA反应过程循环，激活CRISPR-Cas12a系统的活性，实现Fc标记的DNA探针的水解。本实施例还探索了ECL强度与靶标RNA浓度之间的线性关系，如图4B所示。得到的线性关系是Y＝1013.3+322.2lgCtarget(R2＝0.9998)，其中Y代表ECL强度，lgCtarget代表SARS-CoV-2 RNA浓度的对数值。用3σ法计算的传感器的检测限(LOD)为6.7fM，这在之前报道的RNA检测常用方法中处于领先水平，这也显示了本实施例方法的先进性和敏感性。
实施例4基于CRISPR 12a的策略的特异性和稳定性
为了说明实施例2使用CRISPR-Cas 12a反式切割特性及ECL生物传感器对SARS-CoV-2 RNA检测的特异性，本实施例选择了几种常见的非特异性RNA，包括miRNA-133a、miRNA-499、miRNA-208和miRNA-328(序列见表2)，用miRNA-133a、miRNA-499、miRNA-208或miRNA-328替换实施例2中的SARS-CoV-2 RNA，以Blank sample(空白样品)作为对照。为了更充分地说明该传感器的选择性，非特异性RNA(100fM)的浓度是SARS-CoV-2 RNA(10fM)的10倍，其他条件见实施例2。图5A所示的结果表明，非特异性RNA的ECL反应与空白样品的反应大致相同，而远低于目标RNA的ECL强度，表明该系统具有优越的特异性。
用带有突变位点的gRNA(gRNA1、gRNA2或gRNA3)替换实施例2中的gRNA用于验证传感器的特异性，其他条件见实施例2。显示Cas12a的激活受特异gRNA的控制，如图5(B)所描述。在恒定的SARS-CoV-2 RNA条件下，具有突变位点的gRNA没有明显增加ECL强度，表明CRISPR-Cas12的活性不能被突变的gRNA激活。
本实施例还讨论了使用CRISPR-Cas 12a反式切割特性及ECL生物传感器检测浓度为1pM SARS-CoV-2 RNA的稳定性，在循环电压下连续25次扫描ECL信号(如图5C所示)，计算出信号的相对标准偏差(RSD)为2.9％，表明传感器的稳定性极佳。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 江苏省原子医学研究所
<120> 一种检测SARS-CoV-2 RNA的探针组、ECL生物传感器及其制备方法和应用
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