一种荞麦立枯病抗性鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种农作物病害抗性鉴定方法，具体涉及一种荞麦立枯病抗性鉴定方法。
背景技术
荞麦立枯病是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的一种真菌病害。植株发病率可高达30-45％。植株发病初期，植株茎基部出现不规则黑褐色病斑，随着病情发展，茎基部病斑沿荞麦茎秆扩展蔓延，病斑部位明显凹陷，幼苗时期发病受害茎基部容易腐烂折断，导致植株倒伏，给荞麦生产造成严重的经济损失，影响了荞麦产业的可持续发展。目前，荞麦立枯病已成为严重影响荞麦生产的主要病害之一。因此，科学有效地防控荞麦立枯病已成为荞麦安全生产和持续稳定发展的关键。
培育和利用抗病品种是荞麦立枯病最经济有效安全的防控措施。当前，国内尚无荞麦立枯病抗性鉴定方法及抗病性的荞麦种质资源，严重制约了荞麦立枯病抗病性品种的选育。操作简单、准确、高效、稳定的荞麦立枯病抗性鉴定方法，可为今后抗病性荞麦种质资源的筛选及抗病育种研究提供重要的技术支撑，从而为有效防控荞麦立枯病和抗病育种研究奠定重要的研究基础。
发明内容
不同微生物对不同荞麦品种的侵染能力不同，为了达到对未知荞麦品种所携带的微生物抗性进行快速的判断，迫切需要一种普适性强、准确性高，不随荞麦品种迁移的病原菌抗性鉴定方法以及配套的抗性评价体系。立枯丝核菌对荞麦植株的侵染方式与其他侵染荞麦茎秆的病原菌不同，该病原菌主要通过侵染荞麦茎基部(接近土壤的第一茎节)对植株造成危害，使植株茎基部感染发病，严重时导致植株茎基部腐烂或植株倒伏。
本发明的目的是提供一种荞麦立枯病抗性鉴定方法，包括：选择生长12-15天的荞麦植株的茎基部接种立枯病病原菌；接种后采用湿润的脱脂棉覆盖接种处，并用封口膜包裹固定脱脂棉；接种培养15-20天后观察记录植株茎基部的病斑侵染情况。
荞麦生长至12-15天的茎基部比较适宜接种及后期症状观察。用封口膜包裹固定脱脂棉及菌丝，有利于病原菌孢子萌发，加速茎基部发病。
在本发明提供的鉴定方法中，使用灭菌针头刺伤荞麦茎基部，被刺伤的荞麦植株仍能直立于土壤中正常存活；所述茎基部为荞麦出土后的第一茎节处，选取第一茎节有利于病原菌孢子从针刺伤口侵染植株，使荞麦植株快速发病。
在本发明提供的鉴定方法中，接种所用的立枯病病原菌为在PDA培养基25℃恒温黑暗活化培养后的立枯病病原菌菌丝。
在本发明提供的鉴定方法中，接种48h后，清除病原菌菌丝。
在本发明提供的鉴定方法中，所述接种培养为：将接种病原菌后的荞麦植株，在温度25-30℃、相对湿度70-90％的条件下培养。
具体地，一种荞麦立枯病抗性鉴定方法，步骤如下：
(1)对生长12-15天的健康荞麦植株茎基部表面用无菌水清洗后，用灭菌针头轻轻刺伤荞麦出土后第一茎节，将立枯病病原菌的菌丝接种于针刺点，用无菌的湿润脱脂棉覆盖菌丝，并用封口膜包裹固定脱脂棉及菌丝；
(2)将接种植株在温度25-30℃、相对湿度70-90％的条件下培养，培养完成后观察记录植株茎基部病斑扩展情况；
(3)接种培养15-20天后观察记录病斑大小，将病斑的大小进行分级，根据所属的级别计算茎基部的病情指数，进行抗性评价。
在本发明提供的鉴定方法中，根据病斑侵染情况进行分级，根据分级情况计算茎基部的病情指数，根据病情指数进行抗性评价。
在本发明提供的鉴定方法中，抗性评价包括：
(1)根据病斑的大小划分发病等级：
0级：无病斑，未发病；
1级：病斑直径为0.01-0.50mm；
3级：病斑直径为0.51-2.00mm；
5级：病斑直径为2.01-3.50mm；
7级：病斑直径为3.51-5.00mm；
9级：病斑直径≥5.01mm；
(2)根据发病等级计算得到病情指数：
(3)根据病情指数划分抗性等级：
高抗：病情指数≤25；
中抗：25＜病情指数≤45；
中感：45＜病情指数≤65；
高感：病情指数>65。
在本发明提供的鉴定方法中，选择生长健壮的荞麦植株，使用灭菌针头刺伤茎基部，被刺伤的荞麦植株仍能直立于土壤中正常存活。
根据本领域技术人员的理解，本发明还请求保护上述的鉴定方法在荞麦种质资源创新、提高荞麦产量中的应用。
本发明的有益效果至少在于：
(1)本发明选择生长了12-15天的荞麦植株，进行病原菌接种及鉴定，获得了最精确的荞麦植株抗性结果。
(2)本发明在接种培养15-20天后，观察记录植株茎基部的病斑侵染情况，获得了最准确的抗性评价方法。
(3)本发明所述的方法直接将病原菌的菌丝接种于茎基部的针刺部位即可，操作简单，发病快，成本低，效率高。
(4)本发明根据立枯病病原菌在不同抗性荞麦品种茎基部的生长特性，采用相对级数值0、1、3、5、7、9共9级6个不同水平对接种后茎部的病斑直径进行分级，并计算病情指数，根据严重度判别抗病性；本发明提供的病害分级是根据调查的病斑直径数据在Excel系统下进行排序，以无症状对应的样品的部位严重度指标设置为0级，其余数据自低至高的连续读取数值分割为5段，各段分别代表一个病害严重度级别，即0、1、3、5、7、9共9级6个不同水平进行分级；本发明根据不同级别的茎杆计算病情指数，数据采用SPSS19.0统计软件进行显著性分析，根据显著性确定病害抗感病情指数的划分。结果证实采用本发明确定的测评方法可准确地对荞麦的抗性进行评价。
具体实施方式
以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
若未特别指明，本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本实施例以在田间分别表现为高抗的荞麦材料米棕35号，中抗的荞麦材料米苦27号，中感的荞麦材料YZ39，高感的荞麦材料YZ62作为供试材料。
荞麦材料种子由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所作物种质资源保存中心提供。
立枯病病原菌菌株及来源：立枯病病原菌的强致病性菌株LK-43，由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所荞麦病害课题提供。
抗性鉴定的具体步骤如下：
(1)将荞麦立枯病的病原菌移植至PDA培养基平板25℃恒温黑暗活化培养7天，用接种针取少许立枯病病原菌菌丝，备用。
(2)在荞麦植株生长12-15天左右，选取荞麦植株相对一致的健康植株，用无菌水清洗茎基部。
(3)用灭菌针头轻轻刺伤茎基部(高于地面3cm)，用灭菌接种针挑取菌丝于荞麦茎基部针刺点进行接种，用无菌的湿润脱脂棉覆盖菌丝，并用封口膜包裹固定脱脂棉及菌丝，接种48h后取掉菌丝。
(4)将所述接种植株在温度为25-30℃、相对湿度为70-90％左右的温室内进行培养，培养15-20天后观察记录植株茎基部的病斑侵染情况。
(5)根据病斑扩展直径进行分级，根据所属的级别计算茎基部的病情指数，进行抗性评价(见表1)，荞麦立枯病发病等级划分标准和抗性等级划分标准如下：
发病等级划分标准：
A、根据病斑的大小划分发病等级：
0级：无病斑，未发病；
1级：病斑直径为0.01～0.50mm；
3级：病斑直径为0.51～2.00mm；
5级：病斑直径为2.01～3.50mm；
7级：病斑直径为3.51～5.00mm；
9级：病斑直径≥5.01mm；
B、将所述发病等级带入病情指数计算公式，得病情指数：
C、根据以病情指数划分的抗性等级，鉴定所述荞麦的抗性；
所述抗性等级的划分标准为：
高抗(HR)：病情指数≤25；
中抗(MR)：25＜病情指数≤45；
中感(MS)：45＜病情指数≤65；
高感(HS)：病情指数>65。
表1 供试荞麦材料立枯病病原菌人工接种抗性鉴定结果
症状
材料名称
病斑直径(mm)*
病情指数*
抗性类型
有病斑
米棕35号
1.07
20.25
HR
有病斑
米苦27号
1.85
36.40
MR
有病斑
YZ39
3.36
54.81
MS
有病斑
YZ62
5.62
69.13
HS
*：病斑直径和病情指数均为5个重复的平均值。
由以上结果可以看出，对于田间表现抗感的荞麦材料，通过抗性鉴定试验，其抗性鉴定结果与已知的实际情况相吻合。
实施例2
本实施例采用与实施例1相同的抗性鉴定方法，对YZ39、YZ5、YZ62、米棕35号、米苦27号、云荞3号、米黑42号进行立枯病抗性鉴定。
本实施例提供的抗性鉴定方法，步骤如下：
由一个实验人员用字母对7个不同荞麦材料的健康植株进行编号后，将只带有编号的植株交给另外一个实验人员，按照实施例1中抗性鉴定方法的步骤进行实验。待实验结束后，对照编号查材料名称。结果显示，7个不同荞麦材料对立枯病的抗性表现差异明显，而且7个不同荞麦材料YZ39、YZ5、YZ62、米棕35号、米苦27号、云荞3号、米黑42号的抗性结果与大田中实际表现的结果一致(见表2)。
本实施例的抗性鉴定验证试验再次证实，抗性鉴定结果与已知的实际情况相吻合。因此，验证了本发明提供的方法可用于荞麦立枯病的抗性快速鉴定。
表2 不同荞麦材料立枯病病原菌人工接种抗性鉴定结果
*：病斑直径和病情指数均为5个重复的平均值。
由此可见，本发明的抗性鉴定方法具有操作简单、准确、高效、稳定，检测周期短等优点，适合对大批量材料进行快速的抗病性鉴定，具有广阔的应用前景。
对比例1采用不同生长时期的荞麦植株
以在田间分别表现为高抗的荞麦材料米棕35号，中抗的荞麦材料米苦27号，中感的荞麦材料YZ39，高感的荞麦材料YZ62作为供试材料。选取不同生长时期的米棕35号、米苦27号、YZ39和YZ62接种立枯病病原菌，接种培养18天后观察病斑情况，结果见表3。
通过实验可看出，生长期为5天、8天的荞麦植株由于茎基部节间短小，接近土壤，不易操作，因此不宜接种。生长期为12天、15天的荞麦植株茎基部节间长度适中，且病原菌侵染快，发病快，病斑明显。生长期为20天、25天的荞麦植株茎基部组织木质化程度较高，硬度较大，针刺较困难，且病原菌侵染发病很慢，病斑扩展慢。因此对生育期为12天、15天的荞麦植株茎基部接种，不仅可以得到良好的接种症状，而且可以获得更准确的抗性水平。
表3 供试材料不同生长期接种立枯病病原菌18天后的病斑直径
*：病斑直径为5个重复的平均值。
对比例2观察时期不同
以在田间分别表现为高抗的荞麦材料米棕35号，中抗的荞麦材料米苦27号，中感的荞麦材料YZ39，高感的荞麦材料YZ62作为供试材料。在供试材料生长至14天，对植株茎基部接种荞麦立枯病病原菌，分别在接种培养2天、5天、10天、15天、18天、20天、25天、30天时观察接种症状。
表4结果发现，接种培养2天，四种供试材料接种点均未出现症状。接种培养5天，高抗材料米棕35号和中抗材料米苦27号未出现症状，中感材料YZ39和高感材料YZ62接种点出现褪绿症状，但未出现病斑。接种10天后调查发现，四种供试材料接种点出现病斑，但病斑微小。接种15天、18天、20天调查发现，四种供试材料病斑均逐渐扩大，且不同材料间的病斑差异明显。在接种25天、30天后发现，高感材料YZ62病斑直径和中感材料YZ39的病斑直径仅有微量增加，高抗材料米棕35号和中抗材料米苦27号的病斑直径均基本无变化。因此从本实验可看出，材料在接种病原菌后，观察的最佳时间为接种培养15天、18天、20天，在此观察期间，供试材料病斑基本稳定，无明显变化，可以对供试材料的抗性水平进行有效区分。
表4 供试材料接种立枯病病原菌后不同观察时间的病斑直径
*：病斑直径为5个重复的平均值。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
