具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本公开。应理解，这些实施例仅用于说明本公开而不用于限制本公开的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

目前，现有的检测激酶的方法存在操作步骤复杂、放射性污染、检测灵敏度低等问题，尤其是，由于针对不同的激酶，识别的底物不同，因此，没有关于可以通用的检测激酶活性的生物传感器，为此，本公开提供了一种锆离子介导的纳米传感器及制备方法和应用。

在本公开的一种实施方式中，一种QD-捕获探针纳米结构，所述纳米结构包括单量子点QD和捕获探针，链霉亲和素修饰在单量子点QD表面，磷酸基团和生物素各修饰在捕获探针的两端；所述捕获探针利用生物素-链霉亲和素自组装到单量子点QD表面。

上述QD-捕获探针纳米结构中，磷酸基团和生物素各修饰在捕获探针的两端，这种特殊的结构设计有利于QD-捕获探针纳米结构快速实现对激酶的检测，有利于金属离子快速、准确的定位到磷酸基团，实现自组装过程，提高了QD-捕获探针纳米结构在激酶检测中的效率。尤其是，在检测激酶的过程中，不同的激酶，底物探针不同，当磷酸基团和生物素各修饰在捕获探针的两端时，便于实现对不同激酶的检测，扩宽了QD-捕获探针纳米结构在激酶检测中的应用范围。

然而，传统的发明构思是，直接将磷酸基团和生物素连接，修饰在捕获探针的同一端，这种结构设计只能够检测一种激酶，无法检测具有不同底物探针的激酶。

进一步地，经过修饰的捕获探针为5’P-TTT TTT TTT T-biotin。该捕获探针能够提高激酶检测的灵敏度。

在本公开的一种实施方式中，一种PKA和/或PNK检测用试剂盒，所述试剂盒包括所述的一种QD-捕获探针纳米结构和锆离子Zr⁴⁺。以Zr⁴⁺为磷酸识别元件，实现了磷酸化与非磷酸酸化的底物探针的有效区分，同时Zr⁴⁺还可以成为连接磷酸化底物与捕获探针的桥梁，与单分子检测技术结合实现了PKA和PNK的通用检测。

进一步地，所述试剂盒还包括Cy5修饰的探针，便于实现对激酶的检测。

进一步地，所述探针包括多肽探针和/或DNA探针，其中，当检测PKA时，采用多肽探针，当检测PNK时，采用DNA探针。

进一步地，所述试剂盒还包括腺苷5′-三磷酸(ATP)和PKA和/或PNK反应缓冲液，缓冲液为激酶检测提供合适的检测环境。

在本公开的一种实施方式中，一种锆离子介导的纳米传感器，所述纳米传感器由内而外依次为所述的一种QD-捕获探针纳米结构、锆离子Zr⁴⁺和Cy5修饰的探针，构建QD-Zr^{4 +}-Cy5纳米结构。多个Cy5修饰的底物探针组装到一个QD表面的纳米结构提高了FRET的效率，利用该纳米传感器，当待检测的激酶存在时，可以催化Cy5修饰的探针磷酸化，并通过Zr⁴⁺与磷酸基团的配位作用组装到单个QD表面，形成QD-Zr⁴⁺-Cy5纳米结构并导致QD和Cy5发生FRET。通过单分子检测，可以很容易地测量FRET信号。

上述纳米传感器能够实现对不同激酶的检测，只要待检测的激酶能够催化探针实现磷酸化，得到磷酸基团就能够被上述纳米传感器检测到。这是传统的激酶的检测方法无法做到的。上述纳米传感器在单分子检测的高信噪比，具有灵敏度高、分析时间短、样品消耗量小等显著优点。

进一步地，所述探针包括多肽探针和/或DNA探针，所述多肽探针为含有PKA识别位点的多肽探针，在探针的羧基端标记了Cy5荧光基团，该结构能够实现对PKA的检测，检测灵敏度高、检测方法简单；进一步地，所述多肽探针的序列为Cy5-(COOH)-KLRRASL-(NH₂)；进一步地，所述识别位点为丝氨酸，更有利于提高检测的灵敏度。此外，当检测PNK时，所述DNA探针的序列为5’-GTT GAG C-Cy5-3’。

通过磷酸基团与无机离子(Zr⁴⁺)之间的配位共价作用，Zr⁴⁺选择性地与两个磷酸功能化分子结合，作为开发通用激酶纳米传感器的桥梁，对疾病的治疗和诊断具有重要意义。

在本公开的一种实施方式中，一种锆离子介导的纳米传感器的制备方法，所述制备方法包括QD-捕获探针纳米结构的制备和QD-Zr⁴⁺-Cy5纳米结构的制备；进一步地，所述QD-捕获探针纳米结构的制备方法包括将捕获探针、单量子点QD和10×QD缓冲液混合后避光孵育；进一步地，所述孵育时间为10-30min，优选的，为20min；

或，所述QD-Zr⁴⁺-Cy5纳米结构的制备包括：将探针、ATP、PKA和/或PNK反应缓冲液、PKA和/或PNK反应溶液混合后，在30-45℃下反应1-4h，然后，在55-75℃下孵育。

上述制备方法过程简单、耗时较短，不需要昂贵的抗体、特殊标记的ATP，不需要任何洗涤和分离步骤，操作十分简单。同时，也不需要复杂的探针设计和核酸扩增步骤，可以在等温、均相的条件下进行。

在本公开的一种实施方式中，一种PKA和/或PNK抑制剂的筛选方法，所述方法包括将模型抑制剂和所述的一种锆离子介导的纳米传感器共同反应；进一步地，所述模型抑制剂为H-89模型抑制剂和/或二磷酸腺苷和硫酸铵。由于锆离子介导的纳米传感器具有检测灵敏度高的特点，因此，利用该纳米传感器和抑制剂进行竞争反应，能够极大地提高抑制剂筛选的灵敏度和准确性。实验结果显示，利用上述纳米传感器进行抑制剂的筛选，具有较高的准确性，进一步拓展了纳米传感器的应用。

在本公开的一种实施方式中，所述的一种QD-捕获探针纳米结构和/或所述的一种PKA和/或PNK检测用试剂盒和/或所述的一种锆离子介导的纳米传感器和/或所述的一种锆离子介导的纳米传感器的制备方法在PKA和/或PNK活性检测中的应用。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。

实施例1

1.QD–捕获探针纳米结构的制备：

将150纳摩尔每升捕获探针(5’P-TTT TTT TTT T-biotin)、2.5纳摩尔每升QD、2微升的10×QD缓冲液(1摩尔每升三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl),30毫摩尔每升氯化镁(MgCl₂),100毫摩尔每升硫酸铵(NH₄)₂SO₄)，pH 8.0)加入到20微升反应体系中，在避光条件下室温孵育20分钟。反应得到的QD–捕获探针纳米结构保存在4℃以供进一步使用。

2.QD-Zr⁴⁺-Cy5纳米结构的制备和荧光光谱分析：

对于PKA的反应：

用PKA稀释缓冲液(20毫摩尔每升Tris-HCl,50毫摩尔每升氯化钠(NaCl),1毫摩尔每升乙二胺四乙酸(EDTA),50％甘油，pH 7.5)稀释PKA用于其活性检测。PKA催化磷酸化反应的过程为在20微升含有2.5微摩尔每升多肽探针(Peptide probe:Cy5-KLRRASL)、10微摩尔每升腺苷5'-三磷酸(ATP)、2微升10×PKA反应缓冲液(500毫摩尔每升Tris-HCl,100毫摩尔每升氯化镁,0.01％Brij-35,PH 7.5)和不同浓度PKA的反应溶液混合后，在37℃反应2小时，然后在65℃孵育20分钟终止反应。为了构建QD-Zr⁴⁺-Cy5纳米结构，将1.8微升1毫摩尔每升Zr⁴⁺添加到20微升制备好的QD–捕获探针纳米结构溶液中，得到30微升混合溶液，在室温下孵育1小时。随后将PKA磷酸化反应产物与上述反应溶液混合，得到50微升混合溶液，在室温下孵育1小时。反应产物的荧光信号用FLS-1000荧光光谱仪(爱丁堡仪器有限公司，利文斯顿，英国)测量。在405纳米的激发波长下记录在550纳米-750纳米范围内的发射光谱，读取608纳米(量子点的最大发射波长)和670纳米(Cy5的最大发射波长)处的荧光强度进行数据分析。

对于PNK的反应：

PNK催化磷酸化反应的过程为在20微升含有2.5微摩尔每升DNA探针(DNA probe:GTT GAG C-Cy5)、0.8毫摩尔每升ATP、2微升10×PNK反应缓冲液(700毫摩尔每升Tris-HCl,100毫摩尔每升氯化镁，PH 7.5)和不同浓度PNK的反应溶液混合后，在37℃反应1.5小时，然后在65℃孵20分钟终止反应。后续实验按照上述PKA检测方法进行。

3.单分子检测和数据分析：

将反应产物用1×QD缓冲液(100毫摩尔每升Tris-HCl,3毫摩尔每升氯化镁,10毫摩尔每升硫酸铵,pH 8.0)稀释50倍用于单分子检测。将10微升样品直接吸取到盖玻片上，用全内反射荧光显微镜成像。405纳米的激光用于激发量子点。荧光信号通过100×物镜(Olympus，Japan)得到量子点和Cy5的发射信号。成像的曝光时间为500毫秒。Image J软件用于Cy5分子计数，选择图像区域为500×500像素，用10张图得到的Cy5分子个数进行数据分析。

4.抑制剂筛选：

PKA抑制剂实验是在PKA反应混合物中加入不同浓度的H-89，随后的反应过程和单分子检测都遵循上述步骤。PNK抑制剂实验选择二磷酸腺苷(ADP)和硫酸铵作为模型抑制剂，将他们分别加PNK反应混合物中，随后的反应过程和单分子检测都遵循上述步骤。

5.细胞培养和细胞提取物的制备：

PKA细胞实验：

将宫颈癌细胞(HeLa)在含有胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中培养，保持含5％二氧化碳、温度37℃的潮湿气氛。在加入毛喉素(Fsk)/3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)前，将细胞培养基换成无血清培养基培养4小时。将溶解在二甲基亚砜(DMSO)中的Fsk和IBMX加入培养基培养30分钟，激活细胞内PKA。等体积的DMSO加入培养基培养对照组的细胞。将Fsk、IBMX和H-89一起加入培养基孵育30分钟用于细胞内PKA抑制剂实验。在细胞提取实验中，用胰蛋白酶消化收集细胞，并用1×磷酸盐缓冲液(PBS)(pH 7.4)洗涤两次。然后，将细胞收集在离心管中，以800转每分钟(rpm)的速度离心5分钟。细胞数通过Countstar细胞计数器(IC1000,威明顿市,特拉华州,美国)测量。将约1×106个细胞悬浮在100微升RIPA裂解缓冲液(50毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷(Tris)(pH7.4)，150毫摩尔每升的氯化钠(NaCl)，1％的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、1％的去氧胆酸钠(sodium deoxycholate)，0.1％的十二烷基硫酸钠(SDS))中并在冰上孵育10分钟，然后超声处理。将裂解物在4℃下以14000×g离心5分钟，收集上清液以测定PKA活性。蛋白浓度用改良的Lowry蛋白检测试剂盒(C504041，生工生物技术，上海，中国)进行定量。

PNK细胞实验：

将HeLa细胞在含有10％FBS和1％青霉素-链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中培养，保持含5％二氧化碳、温度37℃的潮湿气氛。培养成熟的细胞，通过Countstar细胞计数器计数。然后使用核蛋白提取试剂盒(生工生物技术，上海，中国)根据制造商的说明书制备细胞裂解液。收集的细胞裂解液立即用于PNK活性测定或保存在-80℃以备使用。

实验原理(如图1a和图1b)

设计了一个含有PKA识别位点(丝氨酸)的多肽探针(Peptide probe，图1a)，在探针的羧基(C-)端标记了Cy5荧光基团。PKA存在的条件下，催化ATP上的γ-磷酸基团转移到多肽探针中丝氨酸的羟基上，产生磷酸化的多肽探针。加入Zr⁴⁺后，通过-PO₃ ^2--Zr⁴⁺-PO₃ ^2--的相互作用将磷酸化的多肽探针连接到QD-捕获探针纳米结构上，形成QD-Zr⁴⁺-Cy5纳米结构，导致QD和Cy5发生FRET。因此，在单分子水平上检测Cy5信号能够实现PKA活性的检测。而PKA不存在的条件下，Cy5修饰的多肽探针不能被磷酸化，因而不能被组装到QD表面，所以QD和Cy5之间不会发生FRET。

为了证明该纳米传感器的通用性，进一步用它来分析PNK活性。设计了Cy5标记的DNA探针(DNAprobe，图1b)作为PNK分析的底物。当PNK存在时，PNK可以催化γ-磷酸基团从ATP转移到寡核苷酸或核酸的5'-羟基上，产生磷酸化的DNA探针。加入Zr⁴⁺后，通过-PO₃ ^2--Zr⁴⁺-PO₃ ^2--的相互作用将磷酸化的DNA探针连接到QD-捕获探针纳米结构上，形成QD-Zr⁴⁺-Cy5纳米结构，导致QD和Cy5发生FRET。因此，在单分子水平上检测Cy5信号能够实现PNK活性的检测。而当PNK不存在时，Cy5修饰的DNA探针不能被磷酸化，因而不能被组装到QD表面，所以QD和Cy5之间不会发生FRET。

实施例2

1.可行性实验

利用荧光光谱验证实施例1得到的纳米传感器用于PKA检测(图2)和PNK检测的可行性(图3)。在没有PKA/PNK的情况下，检测不到Cy5信号(图2/图3，上方的蓝线)，说明在没有PKA/PNK的情况下，不能形成QD-Zr⁴⁺-Cy5纳米结构。相比之下，随着PKA/PNK的加入，可以观察到明显的Cy5荧光信号，并伴随着QD荧光信号的降低(图2/图3，下方的红线)，这表明PKA产生的磷酸化反应可以诱导QD-Zr⁴⁺-Cy5纳米结构形成，并导致QD和Cy5之间发生高效的FRET。

进一步通过单分子检测验证该传感器检测PKA/PNK活性的可行性。如图4所示，当PKA不存在时，只能检测到QD荧光信号(图4A，绿色)，检测不到Cy5荧光信号(图4B)，说明没有PKA就不会发生FRET。与之相反的是，当PKA存在时，才能同时观察到QD(图4D，绿色)和Cy5(图4E，红色)的荧光信号，且两个信号具有明显的共定位区域(图4F，黄色)，表明PKA的存在可以引发FRET。如图5所示，当PNK不存在时，只能检测到QD荧光信号(图5A，绿色)，检测不到Cy5荧光信号(图5B)，说明没有PNK就不会发生FRET。与之相反的是，当PNK存在时，才能同时观察到QD(图5D，绿色)和Cy5(图5E，红色)的荧光信号，且两个信号具有明显的共定位区域(图5F，黄色)，表明PNK的存在可以引发FRET。

2.灵敏度检测

在最佳反应条件下，通过测量Cy5个数随着不同浓度PKA的变化，评估该纳米传感器检测PKA的灵敏度。如图6A所示，当PKA浓度从0.003单位每毫升增加到100单位每毫升时，Cy5计数相应增加。PKA浓度在0.003单位每毫升到3单位每毫升范围内时，Cy5计数与PKA浓度的对数形式呈线性相关(图6B)。回归方程为N＝218.79+71.63log₁₀ C(R²＝0.9944)，其中N代表Cy5分子数，C代表PKA浓度(单位每毫升)。根据空白信号加3倍标准偏差的原则，可计算出该方法的检测限为8.82×10^-4单位每毫升。该方法的灵敏度比基于磷酸化标签和酶信号放大的电化学分析法(0.15单位每毫升)提高了3个数量级，比羧肽酶Y辅助肽裂解的电化学生物传感器(0.083单位每毫升)提高了2个数量级。

通过测量Cy5个数随着不同浓度PNK的变化，评估该纳米传感器检测PNK的灵敏度。如图7A所示，当PNK浓度从0.0001单位每毫升增加到10单位每毫升时，Cy5计数相应增加。PNK浓度在0.0001单位每毫升到0.03单位每毫升范围内时，Cy5计数与PNK浓度的对数形式呈线性相关(图7B)。回归方程为N＝455.41+93.85log₁₀ C(R²＝0.9956)，其中N代表Cy5分子数，C代表PNK浓度(单位每毫升)。根据空白信号加3倍标准偏差的原则，可计算出该方法的检测限为1.40×10^-5单位每毫升。该方法的灵敏度比基于三维DNA纳米机器的荧光方法(0.0067单位每毫升)和比例荧光分析法(0.0037单位每毫升)提高了2个数量级。这些结果清楚地证明了该单量子点纳米传感器可用于PNK的高灵敏检测。

该方法灵敏度的提高可归因于：

(1)Zr⁴⁺能够区分磷酸化与非磷酸化的多肽探针并特异性的将磷酸化的多肽探针自组装到QD表面；

(2)多个Cy5修饰的多肽探针组装到一个QD表面的纳米结构可以提高FRET的效率；

(3)单分子检测具有高信噪比。

3.特异性实验

为了研究该纳米传感器对PKA检测的特异性，使用牛血清白蛋白(BSA)、免疫球蛋白G(IgG)、T4多核苷酸激酶(PNK)和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)作为干扰蛋白。如图8(A)所示，在存在干扰蛋白的情况下，未检测到明显的Cy5信号，说明QD与Cy5之间没有发生FRET。相比之下，PKA存在时，可以检测到很高的Cy5信号，表明QD与Cy5之间存在有效的FRET。这些结果清楚地证明了该方法应用于PKA检测时具有较好的选择性。

为了研究该纳米传感器对PNK检测的特异性，我们使用牛血清白蛋白(BSA)、免疫球蛋白G(IgG)、PKA和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)作为干扰蛋白。如图9所示，在存在干扰蛋白的情况下，未检测到明显的Cy5信号，说明QD与Cy5之间没有发生FRET。相比之下，当PNK存在时，可以检测到很高的Cy5信号，表明QD与Cy5之间存在有效的FRET。这些结果清楚地证明了该方法应用于PKA检测时具有较好的选择性。

4.抑制剂分析

为了验证该纳米传感器可用于PKA抑制剂的筛选，选择H-89作为模型抑制剂进行验证。H-89可以竞争性地结合PKA催化亚基上的ATP结合位点从而抑制PKA活性。测定了在不同浓度H-89存在时的Cy5分子数。如图8(B)所示，PKA的相对活性随H-89浓度的增加而降低。用IC50值(最大半抑制浓度)评估H-89对PKA酶的抑制作用。该方法测得的IC50值是41.57纳摩尔每升，与双信号读出荧光分析方法的结果一致(39.5纳摩尔每升)。此结果表明该方法可用于筛选PKA抑制剂。

为了验证该纳米传感器对筛选PNK抑制剂的可行性，选择二磷酸腺苷和硫酸铵作为模型抑制剂进行验证。二磷酸腺苷是PNK催化磷酸化反应的副产物，由于二磷酸腺苷与5'-磷酸化的DNA共存可以逆转磷酸化反应，因此会严重抑制PNK活性。此外，高浓度的盐(如硫酸铵)可以诱导PNK酶的构象变化，并有效地抑制PNK活性。随着二磷酸腺苷(图10A)和硫酸铵(图10B)浓度的增加，PNK的相对活性相对应的降低。该方法测得的二磷酸腺苷和硫酸铵的IC50值分别是0.96毫摩尔每升和9.21毫摩尔每升，分别与基于分子信标的荧光分析方法测得的二磷酸腺苷的IC50值(0.8毫摩尔每升)以及生物发光分析法测得的硫酸铵的IC50值(9.88毫摩尔每升)一致。这表明该纳米传感器可用于筛选PNK抑制剂。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一种锆离子介导的纳米传感器及制备方法和应用

<130> 202112601

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

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<212> PRT

<213> 未知

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Lys Leu Arg Arg Ala Ser Leu

1 5

<210> 2

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<212> DNA

<213> 未知

<400> 2

gttgagc 7