具体实施方式

本发明提供了一种利用灰霉菌检测辣椒素含量的方法，包括：将灰霉菌接种于含有不同浓度辣椒素的V8培养基中，建立辣椒素浓度和灰霉菌斑直径的线性标准曲线；提取待测样品中的辣椒素，制备待测液；将所述灰霉菌接种于含有所述待测液的V8培养基中进行培养，根据培养时间内待测灰霉菌斑直径和线性标准曲线，计算待测样品中辣椒素的含量。

在本发明中，所述灰霉病原菌从田间发病植株中分离纯化获得，经过测序，证实为Botrytis cinerea。

在本发明中，对所述待测样品的种类没有特殊限定。在本发明的具体实施例中，所述待测样品的种类包括辣椒果实，更进一步为杭椒12号、辛香2号和P1622。

在本发明中，所述培养时间优选为3～4d，更优选为4d。在本发明中，培养灰霉菌的时间若超过4d，0ug/ml培养基上灰霉菌斑的大小会超出培养皿，无法测量有效直径，所以本发明选择灰霉菌的培养时间为3～4d。

在本发明中，培养4d时，所述辣椒素浓度和灰霉菌斑直径的线性标准曲线为：y＝-1.699x+49.44公式(1)；所述y为辣椒素浓度，所述x为灰霉菌斑直径。

在本发明中，所述灰霉菌为灰霉菌悬液，所述灰霉菌悬液的接种浓度优选为0.5～1.5×10⁵个/mL，更优选为1×10⁵个/mL。

在本发明中，所述灰霉菌悬液为将培养得到的灰霉菌菌体在浸染液中震荡后得到，所述侵染液优选包括麦芽糖和蛋白胨，所述麦芽糖和蛋白胨的质量比优选为(5～10):(1～3)，更优选为8:2。

在本发明中，所述灰霉菌菌体的培养方法优选包括：将灰霉菌接种于V8培养基中，优选于23～27℃下培养8～13天，更优选为于25℃下培养10天。

在本发明中，所述待测样品中辣椒素的提取方法优选包括：将待测样品用甲醇超声提取，过滤、浓缩后，用甲醇定容得到所述待测液。

在本发明中，所述超声提取的温度优选为45～55℃，更优选为50℃，时间优选为40～50min，更优选为45min。在本发明中，超声时间长有利于辣椒素提取，但是过长的话耗费提取时间；提取温度低，辣椒素提取不充分，提取温度高辣椒素容易降解。

在本发明中，所述待测样品与甲醇超声的质量体积比优选为(8～13):(12～17)g/mL，更有优选为10:15g/mL。在本发明中，通过甲醇提取的辣椒素较其他有机试剂的提取效率高。

在本发明中，所述浓缩的温度优选为66～73℃，更优选为70℃。

在本发明中，在所述甲醇超声提取前还优选包括将待测样品冷冻干燥、粉碎。

在本发明中，在所述浓缩后还优选包括过滤，作为一种可实施方式，采用0.45μm滤膜过滤。

本发明对未提及的原料来源并没有特殊限定，采用本领域的常规市售产品即可。

本发明对未提及的机械设备并没有特殊限定，采用本领域的常规机械设备即可。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

辣椒素浓度和灰霉菌斑直径的线性标准曲线制作

1.辣椒素的配制：

辣椒素母液制备：辣椒素(60.0mg)、甲醇(1mL)混合形成辣椒素母液制剂，放于4℃低温保存。

2.选择高致病性灰霉菌种(Botrytis cinerea，从田间发病植株中分离纯化获得)进行试验，该菌种的扩繁条件如下：

1)V8培养基制备：V8(360mL)、碳酸钙(2.0g)、琼脂(20.0g)。上述组分混合并加入蒸馏水，形成1000mL溶液制剂，所述的溶液制剂进行高温高压(121℃，15分钟)后，放于4℃待用；

2)V8浸染液制备：麦芽糖(8.0g)、蛋白胨(2.0g)。上述组分混合并加入蒸馏水，形成200mL溶液制剂，所述的溶液制剂进行高温高压(121℃，15分钟)后，放于4℃待用；

3)扩繁培养条件：高温融化固体培养基，10mL倒入90mm一次性灭菌培养皿，凝固后接种环接种灰霉菌。25℃培养10天，待用。

3.辣椒素抑制灰霉病菌生长的鉴定方法：

1)从V8培养基刮取扩繁的灰霉菌菌体，加入浸染液充分震荡释放孢子，两层纱布过滤，加浸染液稀释至孢子浓度为1×10⁵个/mL；

2)配置辣椒素浓度分别为0μg/mL、15μg/mL、30μg/mL和45μg/mL的V8固体培养基(10mL/培养皿)；

3)在步骤2中的4种含有不同浓度辣椒素的培养基中接种孢子浓度为1×10⁵个/mL的灰霉菌菌液1μL；

4)培养4天后，利用标尺分别对培养基上的灰霉菌斑直径进行测量；

5)根据图1-3可知，不同浓度的辣椒素对灰霉菌有抑制作用，辣椒素浓度越高，抑制作用越明显，并且辣椒素浓度与灰霉菌直径呈线性相关。利用Excel 2007对灰霉菌斑直径和辣椒素浓度进行线性趋势分析，得到换算公式y＝-1.699x+49.44，相关系数R²＝0.995。

实施例2

杭椒12号辣椒素的提取

1)采摘绿熟期10g新鲜辣椒杭椒12号果实，放入冷冻干燥仪冻干，研磨至粉碎后样品放于50mL离心管中，4℃保存待用；

2)在装有样品的50mL管中加入15mL甲醇，保鲜膜封口后在50℃水浴条件下超声波震荡提取45min；

3)提取液滤纸过滤后，用旋转蒸发器在70℃浓缩至1mL以下，用甲醇定容至1mL；

4)提取液用0.45μm滤膜过滤；

5)取10μL提取液配置10mLV8培养基，接种灰霉菌，培养4天后，利用标尺对培养基上的灰霉菌斑直径进行测量，灰霉菌斑直径为27.75mm，根据公式y＝-1.699x+49.44计算辣椒果实中的辣椒素的浓度为2.29μg/mL，V8培养基中辣椒素含量为22.93μg，提取液辣椒素浓度为2.29mg/mL，辣椒杭椒12号果实中辣椒素含量为2.29mg/10g。

实施例3

操作步骤与实施例1相同，不同的是辣椒果实为辛香2号。测得的灰霉菌斑直径为6.25mm，根据公式y＝-1.699x+49.44计算辣椒果实中的辣椒素的浓度为38.82μg/mL，经换算得辣椒辛香2号果实中辣椒素含量为38.82mg/10g。

实施例4

操作步骤与实施例1相同，不同的是辣椒果实为P1622。测得的灰霉菌斑直径为14.25mm，根据公式y＝-1.699x+49.44计算辣椒果实中的辣椒素的浓度为25.23μg/mL，经换算得辣椒P1622果实中辣椒素含量为25.23mg/10g。

对比例1

从10g杭椒12果实中提取辣椒素(方法参照实施例2)后，利用高效液相色谱HPLC(Waters Corp.,Milford,MA,USA)系统对辣椒素含量进行检测：流动相为甲醇+水(65+35,体积比)，色谱柱型号4.6mm×250mm，每个样品进样品量10μL，流速1mL/min，紫外检测波长280nm，辣椒素出峰时间为15min左右，经峰面积换算，杭椒12辣椒果实中辣椒素浓度为2.07mg/10g。

对比例2

从10g辛香2号果实中提取辣椒素(方法参照实施例2)后，利用高效液相色谱HPLC(Waters Corp.,Milford,MA,USA)系统对辣椒素含量进行检测：流动相为甲醇+水(65+35,体积比)，色谱柱型号4.6mm×250mm，每个样品进样品量10μL，流速1mL/min，紫外检测波长280nm，辣椒素出峰时间为15min左右，经峰面积换算，辛香2号辣椒果实中辣椒素浓度为34.77mg/10g。

对比例3

从10g P1622果实中提取辣椒素(方法参照实施例2)后，利用高效液相色谱HPLC(Waters Corp.,Milford,MA,USA)系统对辣椒素含量进行检测：流动相为甲醇+水(65+35,体积比)，色谱柱型号4.6mm×250mm，每个样品进样品量10μL，流速1mL/min，紫外检测波长280nm，辣椒素出峰时间为15min左右，经峰面积换算，P1622辣椒果实中辣椒素浓度为28.39mg/10g。

实施例5

实施例2-4、对比例1-3中辣椒果实中辣椒素含量结果如表1。

表1 实施例2-4、对比例1-3中辣椒果实中辣椒素含量

由表1可知，采用本发明方法与高效液相色谱(HPLC)方法测得的辣椒素数值较为接近。可见，本发明检测辣椒素的方法精准度高，并且相对于高效液相色谱(HPLC)方法具有低成本、操作简便的优势。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。