1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对HepG-2细胞作用的检测方法、应用
技术领域
本发明属于医药
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，具体涉及1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲基于p53靶点对HepG-2细胞的作用及其检测方法、应用。背景技术
肝癌是指来源于肝细胞和肝胆管细胞的恶性肿瘤，分为原发性和继发性两大类，是我国常见的恶性肿瘤。早期肝癌常症状无特异性，中晚期肝癌的症状则较多，常见的临床表现有肝区疼痛、腹胀、纳差、乏力、消瘦，进行性肝大或上腹部包块等；部分患者有低热、黄疸、腹泻、上消化道出血等。原发性肝癌的治疗包括系统化疗、靶向治疗、生物治疗，继发性肝癌患者的治疗包括手术治疗，手术治疗无效时可采取保守治疗。
治疗方式的选择取决于肿瘤的位置、恶性程度、发展程度以及病人身体状态。肝癌的治疗无论是化疗、手术或放疗都是对身体有极大负担，并且在发生恶性转移后，无论是何种方式都是很难彻底治愈。随着癌基因、抑癌基因发现、细胞凋亡学说形成，对其了解也从细胞水平深入到分子水平。癌症与许多癌基因和抑癌基因的改变有关，研究与细胞凋亡有关信息传递、蛋白酶活性，有望为癌症治疗提供新手段。
近年来抑癌基因p53在研究上取得一些进展，以该靶点作为研究治疗癌症的靶点药物受到广泛关注。MDM2蛋白是p53最重要负调控因子，参与调控p53蛋白稳定性和活性、抑制细胞生长、诱导凋亡和调节细胞周期功能。但p53靶点和MDM2-p53蛋白与蛋白作用通路在制备治疗和/或预防人肝癌的抗肿瘤药物中的应用鲜有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲基于p53靶点对肝癌HepG-2细胞作用的检测方法，同时提供其在在抗肝癌方面的应用。
为了实现上述目的，采用以下技术方案：
细胞凋亡是细胞程序型死亡方式之一，是细胞维持自身稳定的重要形式，无论是内源性细胞凋亡还是外源性细胞凋亡，都是通过p53靶基因诱导的。结合流式细胞仪、Hoechst 33258证实了1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲可以浓度依赖的诱导HepG-2细胞发生凋亡，并且将细胞周期阻滞在G0/G1期。这与正常细胞受到损伤时，激活p53通路抑制细胞周期促进受损的细胞DNA修复、促进细胞凋亡的表现一致。为进一步探讨1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲诱导HepG-2细胞发生凋亡的作用机制，通过Western Blot检测其对p53通路、Bcl-2家族(Bax、Bcl-2、Mcl-1)等蛋白表达的影响。结果表明，在HepG-2细胞中，1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲增加了p53蛋白表达量，使Bax/Bcl-2比值升高，并且发现p53的下游靶基因MDM2的表达量降低。众所周知，p53与MDM2存在着负反馈调节，由于本发明中MDM2蛋白表达的降低，使p53蛋白在体内聚集，表达量升高，从而发挥其正常的生物学功能。因此，证明1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲作用于p53-MDM2通路，阻断了MDM2对p53的反向调节。为进一步证明1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲发挥抗肿瘤活性是否依赖于p53，对HepG-2细胞进行了细胞p53 siRNA敲减实验，结果表明p53 siRNA+Drug组细胞的存活率显著高于Control siRNA+Drug组，p53参与了1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对HepG-2细胞的抗增殖活性。基于以上研究表明，1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲具有潜在开发抗肝癌的治疗药物。
综上所述，本发明证实1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲通过细胞周期阻滞在G0/G1期抑制HepG-2细胞增殖，通过诱导细胞凋亡来发挥抗肿瘤的作用，其通过激活P53实现抑制效果，具体机制为基于p53靶点和MDM2-p53蛋白与蛋白作用通路，见图1。
1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲基于p53靶点对肝癌HepG-2细胞作用的检测方法，具体包括：
以下检测不分先后顺序。
1、检测1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对HepG-2细胞增殖的影响。
1.1MTT体外抗肿瘤活性的测定，用来检测HepG-2细胞的增殖和存活情况。
MTT全称为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐。其检测原理为外源性MTT被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强(本实验中是测药物毒性，则表示药物毒性越小)。
具体步骤：
(1)种板：按照4×104个/ml的密度取HepG-2细胞，接种到96孔板中，进行细胞培养。
(2)给予1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理：待细胞长至50％-60％，给予1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理；1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲浓度为1.56μM，3.125μM，6.25μM，12.5μM，25μM，50μM，100μM。
(3)MTT检测：避光加入MTT原液，混匀，培养箱中培养，弃旧的培养基，加入DMSO溶解甲瓒结晶，震荡，检测490nm波长处的OD值。
(4)计算细胞存活率：
其中，实验组为不同浓度的处理组。对照组为加入DMSO的组。
(5)化合物IC50的测定。
1.2IncuCyte活细胞成像系统，检测细胞融合率。
具体步骤：
(1)种板：按照4×104个/ml的细胞密度，取HepG-2细胞，铺板于96孔板中，分为对照组和药物浓度组(1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲组)。
(2)给予1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理：待细胞贴壁后，给予1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理。方法同步骤1(2)。
(3)数据处理：将96孔板放置于IncuCyte活细胞成像系统内，定时采集细胞图像动态，计算不同处理条件下细胞融合率。
2、1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对HepG-2细胞迁移的影响，用来量化细胞集体扩散的潜力。
具体步骤：
(1)种板：按照4×104个/ml的细胞密度，取HepG-2细胞，铺板于96孔板中，进行细胞培养。
(2)划痕及给予1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理：待细胞长满后，弃掉培养基，进行划痕，缓冲液冲洗，给予1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理，1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理浓度为0.4μM(2IC50)。
(3)数据处理：在IncuCyte活细胞成像系统中，不同时间点进行拍照，分析细胞各个时间点的迁移率。
3、1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对HepG-2细胞凋亡的影响。
3.1Hoechst 33258染色检测细胞凋亡
具体步骤：
(1)种板：按照7.5×104个/ml的细胞密度，取HepG-2细胞，铺板于六孔板中，进行培养。
(2)给予1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理：待细胞生长至60％-70％，给予1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲(1.56μM、3.125μM)处理。
(3)固定：1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理处理HepG-2细胞48h小时后，加入4％的多聚甲醛，常温避光固定。
(4)染色：弃掉固定液，加入Hoechst 33258染色液，37℃避光孵育。
(5)荧光显微镜观察：缓冲液冲洗，荧光显微镜下观察细胞形态，拍照。
3.2Annexin V/PI双染检测细胞凋亡，用来区分凋亡早晚期、坏死及正常的细胞。
具体步骤：
(1)种板：按照7.5×104个/ml的细胞密度，取HepG-2细胞，接种于六孔板中，进行培养。
(2)给予1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理：待细胞生长至60％-70％，给予1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲(1.56μM、3.125μM，6.25μM)处理。
(3)收集细胞：1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理48h后收集细胞。
(4)分组：对照组(DMSO组)和1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲组分别加入1×Annexin V Bingding Solution。对照组分为阴性对照组、Annexin V-FITC染色组、PI染色组、Annexin V-FITC和PI双染色组；1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲组分为Annexin V-FITC和PI双染色组。
(5)染色：向步骤(4)的各组中加入Annexin V-FITC结合物，混匀后，再加入PISolution，混匀，室温下避光培养。
(6)流式检测：加入1×Annexin V Binding Solution，在1h内上机检测。
4、1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对HepG-2细胞周期的影响
4.1PI单染结合流式细胞仪检测细胞周期
具体步骤：
(1)种板：按照7.5×104个/ml的细胞密度，取HepG-2细胞，接种于六孔板中，进行培养。
(2)给予1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理：待细胞长至60％-70％，给予1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲(3.125μM)处理。
(3)收集细胞：1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲作用36h后收集细胞。
(4)乙醇固定：加入70％的乙醇，4℃环境下固定。
(5)碘化丙啶染色：乙醇固定后，每管细胞样品中加入碘化丙啶染色液，37℃避光温浴。
(6)流式检测：1h内用流式细胞仪进行细胞周期检测。
5、1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲作用于HepG-2细胞后体内相关蛋白变化情况。
5.1蛋白质印迹实验(Western Blot analysis)
具体步骤：
(1)细胞总蛋白的提取：
种板：按照7.5×104个/ml的细胞密度，取HepG-2细胞，接种于六孔板中，进行培养。
给予1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理：待细胞长至60％-70％，给予1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲(1.56μM，3.125μM，6.25μM)处理。
收集细胞：1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲干预48h后，收集细胞。
裂解细胞：加入裂解混合液(体积比为RIPA:PMSF:磷酸酶抑制剂＝100:1:1)，裂解30min，然后超声，离心。
(2)BCA测蛋白浓度
标准品稀释：将0.5mg/ml蛋白标准品进行稀释。
待测蛋白的稀释：40倍稀释
96孔板加样：96孔板加入蛋白标准品稀释液和待测蛋白稀释液，再加入BCA工作液。
孵育：37℃避光孵育。
酶标仪测吸光度：测定A562nm下各孔吸光度，以浓度为横坐标，吸光度(OD)为纵坐标，绘制标准曲线。
(3)蛋白变性
在蛋白样品中加入5×上样缓冲液，100℃恒温变性。
(4)配胶
检漏：加入去离子水，检测是否漏胶。
配胶：分别配制分离胶及浓缩胶，将分离胶加入至板子中，待凝固后加入浓缩胶，插入9孔梳子，静置等待浓缩胶凝胶聚合。
(5)电泳准备及上样
安装装置：配1×电泳液加入电泳槽，拔梳子排气泡，设计上样孔道。
蛋白样品及Marker上样：每孔孔道上样15ul-20ul的蛋白变性样品，加入与蛋白体积相同的Marker。
电泳：恒压80V，待溴酚蓝跑过浓缩胶后，电压调为120V，待溴酚蓝跑到浓缩胶底部且不跑出，终止电泳。
(6)转膜：用翘板除去不含蛋白的浓缩胶，转膜夹子黑色和白色各铺一层海绵，各加4层滤纸，浸湿，铺平，将凝胶放到黑色转膜夹子上，PVDF膜放入甲醇中激活，转移至凝胶上，合上转膜夹，转膜。
(7)牛奶封闭：将PVDF膜转移至的牛奶封闭液中，室温封闭。
(8)一抗孵育：根据膜的大小加入一抗，4℃环境中孵育。
(9)二抗孵育：根据膜的大小加入二抗，室温孵育。
(10)显影：将ECl超敏发光液A液B液，等体积混合，然后覆盖在膜表面，上机，显影。
(11)结果分析：使用Image lab凝胶分析系统采集图像并进行分析。
5.2小干扰RNA(siRNA)细胞转染
进行小干扰RNA(siRNA)细胞转染实验，小干扰RNA通过与目标基因或是目标基因的mRNA结合,特异性降解靶mRNA，从而沉默目的基因。
具体步骤：
(1)种板：按照7.5×104/ml的细胞密度，取HepG-2细胞，接种于六孔板中，进行培养。
(2)转染：待细胞密度达到30％-50％后加入转染试剂，进行转染。所述的转染试剂为，siRNA control、p53 siRNA#1、p53 siRNA#2、p53 siRNA#3、jetPRIME Buffer、jetPRIMETransfection reagent。
(3)转染16h后，收集转染后的细胞，重新计数接种到96孔板，培养10h后，给予1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲(1.56μM，3.125μM)处理。
(4)MTT检测及分析数据：48h后进行MTT检测计算其存活率，IncuCyte变焦活细胞成像系统中定时采集图像用于分析细胞存活情况。
本发明的有益效果：
(1)本发明发现了化合物1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲(毛兰菲)治疗或预防肝癌的作用机制为基于MDM2-p53蛋白与蛋白相互作用信号通路及p53靶点新作用机制，该发明为其临床应用提供了科学理论依据。
(2)通过细胞划痕实验证实1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲可抑制HepG-2细胞的迁移；通过Hoechst33258荧光染色、AnnexinV-FITC/PI双染、PI单染细胞凋亡检测均证实1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲可诱导细胞凋亡；通过PI单染细胞周期方法证实，1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲可诱导HepG-2细胞G0/G1期阻滞。
(3)1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲通过激活p53蛋白发挥抗肿瘤的作用，其通路为p53-MDM2通路及p53作用靶点。
附图说明
图1 p53靶点和MDM2-p53蛋白与蛋白作用通路简图。
图2 BCA测定蛋白质浓度的标准曲线。
图3 1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲抑制HepG-2细胞实验结果；A:1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对HepG-2细胞的抑制结果；B:不同浓度的1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对HepG-2细胞的抑制作用；C:不同作用时间1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对HepG-2细胞的抑制作用。
图4 1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲作用于48h后，对照组及1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲组细胞形态变化。
图5 HepG-2细胞加1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲后，各个时间点细胞融合率的变化情况。
图6 1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲抑制HepG-2细胞的迁移；A:1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲作用HepG-2细胞24h，HepG-2细胞迁移的镜下观察；B:1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲作用HepG-2细胞24h，HepG-2细胞平均迁移率。统计学结果用平均值±标准差表示，n＝3，与对照组相比，*P<0.05。
图7荧光显微镜下观察1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对细胞核的影响。
图8 1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲诱导HepG-2细胞凋亡；A:AnnexinV-FITC/PI双染检测细胞凋亡；B:1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲作用HepG-2细胞48h，HepG-2细胞平均凋亡率。统计学结果用平均值±标准差表示，n＝3，与对照组相比，***P<0.01。
图9 1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲阻滞HepG-2细胞周期于G0/G1；A、B:PI单染和流式细胞术检测细胞周期；C:1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲作用HepG-2细胞48h，细胞各周期所占比例。统计学结果用平均值±标准差表示，n＝3，与对照组相比，**P<0.01。
图10 1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲作用于HepG-2细胞后蛋白表达情况。
图11 p53介导1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对HepG-2细胞的增殖抑制；转染p53siRNA，1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲作用HepG-2细胞48h，HepG-2细胞的融合率曲线。
图12转染p53 siRNA后，1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理HepG-2细胞48h，HepG-2细胞的存活率。
具体实施方式
下面结合实施例来更详细的说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限制。
实施例
本发明具体实施例中采用的药品与试剂来源，见表1，实验仪器见表2。
表1药品与试剂
表2实验仪器
一、试剂和试品的配制
1.1受试药物的配制：
精密称取1.00mg的1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲粉末，加入DMSO配成50mM的溶液。
1.2MTT溶液的配制：
向250mg的MTT粉末分批次加入50ml PBS，充分溶解，配成5mg/ml的MTT溶液，用0.22μm的微孔滤膜进行过滤，并分装到1.5ml的棕色EP管中，注意避光及无菌操作，贴好封口膜，置于-20℃冰箱中长期保存，避免反复冻融，于4℃冰箱可保存两周。
1.3细胞冻存液的配制：
20％胎牛血清，70％的DMEM高糖培养基及10％的DMSO，充分混匀，制备细胞冻存液。
1.4完全培养基的制备：
在DMEM高糖培养基中加入含10％(v/v)的胎牛血清和1％(v/v)双抗(青霉素、链霉素)配成完全培养基。
1.5碘化丙啶染色液的配制：
(1)1个样品的染液的配制：
(2)根据样品数量进行配制碘化丙啶染色液
1.6Tris-甘氨酸电泳缓冲液(1×)
(1)称取以下试剂至1000mL的烧杯中
Tris-base 3.03g
甘氨酸 14.4g
SDS 1.00g
(2)加入1L UP水，置磁力搅拌器上加速溶解。
1.7Tris-甘氨酸电转缓冲液(1×)
(1)称取以下试剂至1000mL的烧杯中
Tris-base 3.03g
甘氨酸 14.4g
(2)置于1000ml烧杯中，加800ml UP水溶解，置磁力搅拌器上加速溶解
(3)再量取200ml甲醇，定容至1L。(注意甲醇易挥发)。
1.8洗膜缓冲液TBST(1×)
(1)称取以下试剂至1000mL的烧杯中
Tris-base 2.42g
NaCl 8.0g
(2)置于1000mL烧杯中，加入1L UP水,置磁力搅拌器上搅拌均匀
(3)再缓慢加入1mL Tween 20，继续搅拌至均匀。
1.9牛奶封闭液(5％的脱脂牛奶)
(1)称取以下试剂至100mL的烧杯中
脱脂奶粉2g
(2)加入40ml洗膜缓冲液TBST，置磁力搅拌器上充分溶解。
1.10蛋白标准品准备
(1)将一管蛋白标准品(20mg BSA)中加入0.8ml的蛋白标准配制液，充分溶解后配置成25mg/ml的蛋白标准溶液。
(2)采用PBS稀释25mg/ml上述蛋白标准溶液至0.5mg/ml。稀释后的0.5mg/ml蛋白标准溶液可以在-20℃长期保存。
1.11BCA工作液配制
根据样品数量，按50体积的BCA试剂A加1体积的试剂BCA试剂B(v:v＝50:1)配制适量的BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。
二、细胞基础培养
人肝癌细胞HepG-2用DMEM高糖完全培养基培养，并置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养，待细胞呈对数生长时进行实验。
2.1细胞复苏
从-80℃冰箱中取出一管HepG-2细胞，使其快速解冻，后将其移至2ml预热的DMEM高糖培养基中，以800rmp/min常温离心5min，弃掉上清液，加入新的培养基重悬细胞，接种至培养瓶中，放入37℃、5％的CO2培养箱中培养，24h后换液。
2.2细胞传代
待培养瓶中的细胞密度长到80％-90％时，弃掉培养基，用PBS清洗2遍。加入胰酶消化细胞(计时，约2min，胰酶作用时间不宜过长)。显微镜下观察到细胞变圆后，轻轻拍打瓶身使之脱落，立即加入新的完全培养基停止消化，将其转移至离心管，离心，弃培养基，加入新的培养基，以1:3的比例将一瓶HepG-2细胞平均分配到三个新的培养瓶中，放入37℃、5％的CO2培养箱中继续培养。
2.3细胞冻存
待培养瓶中的细胞密度长至80％-90％，且生长状态良好，按照步骤2.2细胞传代的方法离心后弃上清，加入细胞冻存液，吹打混匀后，吸取1ml细胞悬液至冻存管，冻存管做好标记(细胞名称，冻存日期)，放入程序梯度冻存盒中，短期保存放到-80℃冰箱中，长期保存放入液氮中。
2.4细胞计数
取10μl的细胞悬液缓慢打到细胞计数板中，在显微镜下进行计数。在显微镜下分别计算四个方格线中的细胞数量，根据公式：(四个大格中细胞数量之和/4)×104＝细胞数/ml，计算细胞密度。
三、1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲基于p53靶点对HepG-2细胞作用的检测方法，包括以下步骤：
以下步骤部分先后顺序；
1、1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对HepG-2细胞增殖的影响
1.1MTT体外抗肿瘤活性的测定，用来测试细胞数量，IC50值。
检测原理为外源性MTT被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强(本实验中是测药物毒性，则表示药物毒性越小)。
具体步骤：
(1)种板：取对数生长期的HepG-2细胞接种到96孔板中，接种密度为4×104个/mL，培养箱中放置过夜。
(2)1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理：待细胞贴壁长至50％-60％，弃掉培养基，加入100μl经DMEM完全培养基稀释过的不同浓度梯度的1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲。1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲组、阳性对照组浓度设定为1.56μM，3.125μM，6.25μM，12.5μM，25μM，50μM，100μM，并设计空白对照DMSO对照组0.2％(v:v)。每组5个复孔。置37℃、5％的CO2培养箱中继续培养48h。
(3)MTT检测：每孔避光加入10μl的MTT原液，震荡混匀，置37℃、5％的CO2培养箱中继续培养2h后，弃旧的培养基，加入150μl的DMSO溶解甲瓒结晶，用酶标仪震荡5min后，检测其490nm波长处的OD值。
(4)计算细胞存活率：
(5)化合物IC50的测定：通过Graphpad 8.0.2软件进行曲线拟合及计算IC50值。
结果：1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对HepG-2的具有很强的抑制增殖作用，其IC50值为0.2±0.12μM，优于阳性药顺铂(IC50＝2.28±0.36)和紫杉醇(IC50＝0.21±0.076)。
1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲干预HepG-2细胞48h，显微镜下形态学观察发现，随着1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲浓度增大，细胞死亡数量增加(图3A)，且细胞形态发生改变，细胞开始伸出触角，细胞膜也可以观察到明显的皱缩(图4)，这一现象与细胞发生凋亡的结果相似，且细胞存活率下降(图3B)；1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲分别干预HepG-2细胞12h、24h、48h，HepG-2细胞存活率曲线逐渐下移(图3C)。
以上结果表明1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲能显著地抑制HepG-2细胞增殖，并呈浓度、时间依赖性关系。
1.2IncuCyte活细胞动态成像系统检测细胞融合率。
IncuCyte ZOOM，即长时间动态活细胞观察系统，以非侵入方法记录细胞的实时状态，对细胞进行实时无标记记录追踪，自动分析其功能指标。其工作原理是通过实时显微拍摄，记录细胞的整体生长过程，并对不同时间点图像进行自动分析，量化实时的细胞数目、细胞密度、细胞凋亡/死亡数目、荧光强度及密度、细胞迁移侵袭速度等检测指标，得到细胞全部生长过程数据。直接为实验提供细胞生长变化过程的图像、影像、变化数据、变化曲线等资料。
具体步骤：
(1)种板：取对数期生长状态良好的HepG-2细胞，按照4×104个/ml的细胞密度，铺板于96孔板中，放入IncuCyte ZOOM变焦活细胞成像系统内的培养箱中，设置参数并开始进行拍照，图像采集的时间间隔设置为2h，10X镜头采集图像。
(2)1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理：待细胞贴壁后，从培养箱中取出给予1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理。方法同步骤1(2)。
(3)数据处理：通过系统内置的分析软件自动识别每张图像中的细胞区域，每孔采集4个不同视野的照片，计算不同处理条件下细胞融合率，作出曲线图，间接反映细胞存活情况。
结果：通过实时采集不同浓度1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲(0-100μM)处理的HepG-2细胞的图像，并在给予1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理48h后对所采集的图像进行细胞融合率分析，结果显示随着1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲浓度的增加细胞融合率曲线逐渐下移，这间接反应了药物可以对肝癌细胞产生浓度依赖性的增殖抑制(图5)。
2、1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对HepG-2细胞迁移的影响。
细胞划痕实验(Wound Healing)是一种操作简单，经济实惠的研究细胞迁移的体外试验方法。其的原理是当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”，划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合，在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程，是研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法。
具体步骤：
(1)种板：取对数期生长状态良好的HepG-2细胞，按照4×104个/ml的细胞密度，铺板于96孔板中，放入37℃、5％的CO2培养箱中，培养过夜。
(2)划痕及1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理：待细胞长满后，弃掉培养基，每孔加入100μl PBS后用划痕器进行划痕，在用PBS冲洗2遍直至显微镜下没有刮下来的团块细胞后给予1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理，1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲浓度为0.4μM(2IC50)，对照组为相应体积的DMSO，每组设5个复孔。
(3)数据处理：放入在IncuCyte活细胞成像系统中，不同时间点进行观察并拍照，利用IncuCyte ZOOM软件分析细胞各个时间点的迁移率。
结果：划痕24h后，通过Incucyte活细胞动态成像系统，所拍摄的照片，HepG-2细胞向划痕区内部迁移，根据系统所自动分析迁移距离及迁移率，显示1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲组细胞迁移距离相比于对照组明显降低(图6A)。与对照组DMSO比较，0.4μM(2IC50)1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲组细胞迁移率在24h均下降(*P<0.05)(图6B)。
3、1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对HepG-2细胞凋亡的影响。
HepG-2细胞在加1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理后，细胞形态发生改变，细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离，细胞呈现一个个皱缩的状态，这与细胞凋亡状态结果相似，故我们先采用Hoechst 33258结合荧光显微镜对细胞核进行形态学观察，在采用Annexin V/PI双染结合流式细胞仪检测1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲是否诱导HepG-2细胞凋亡。
3.1Hoechst 33258染色检测细胞凋亡
Hoechst 33258为非嵌人性荧光染料，它们在活细胞中DNA聚AT序列富集区域的小沟处与DNA结合。在荧光显微镜紫外光激发时，凋亡细胞的细胞核可见浓染致密的颗粒块状荧光，活细胞呈均匀弥散荧光。故可用此来分析Hoechst 33258荧光染色细胞凋亡引起的形态学改变。
具体步骤：
(1)种板：取生长状态良好的HepG-2细胞，按照7.5×104个/ml的细胞密度铺板于六孔板中，放入培养箱中，培养过夜。
(2)1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理：待细胞长至60％-70％，用PBS冲洗两遍，洗掉漂浮的死细胞，每孔加入2ml经培养基稀释过的1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲。1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲组设定浓度为1.56μM、3.125μM，对照组为等体积的DMSO。
(3)固定：1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理HepG-2细胞48h小时后，弃掉培养基，每孔加入1ml 4％的多聚甲醛，常温避光固定15min。
(4)染色：弃掉固定液，用冷PBS冲洗3次，每次3min。加入500μl/孔的Hoechst33258染色液，37℃避光孵育15min。
(5)荧光显微镜观察：冷PBS洗2次，每次3min，在加入1ml的PBS后再荧光显微镜下观察细胞形态并进行拍照。
结果显示，对照组的HepG-2细胞呈现微弱、均一的蓝色荧光，而加药组的HepG-2细胞的细胞核染色质发生浓缩，细胞内可见浓缩致密的颗粒块状强荧光和明显的核不规则碎裂现象，且凋亡现象随着药物浓度的增加而明显(图7)。
3.2Annexin V/PI双染检测细胞凋亡
Annexin V检测细胞凋亡的原理正常细胞膜磷脂的分布是不对称的，膜内表面含负电的磷脂(如磷脂酰丝氨酸，PS)，而膜外表面含有占绝大多数的中性磷脂。在细胞凋亡的早期，细胞膜内的PS会从内侧翻转到细胞膜表面。Annexin V是一种钙依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。PI是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，而早期凋亡细胞的细胞膜是完好的，对PI有拒染性。但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能透过细胞膜而使细胞核染上。因此AnnexinV和PI同时使用，可以将凋亡早期的细胞与其它细胞区别开来。
具体步骤：
(1)种板：取对数期状态良好的HepG-2细胞，按照7.5×104个/ml的细胞密度，接种于六孔板中，放入培养箱中培养过夜。
(2)1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理：待细胞长至60％-70％，用PBS冲洗两遍，洗掉漂浮的死细胞，每孔加入2ml经培养基稀释过的1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲。1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲组设定浓度为1.56μM、3.125μM、6.25μM，对照组为最大1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲浓度等体积的DMSO，每三孔为一组，每个浓度的1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲设置3组复孔。
(3)收集细胞：1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理48h后收集细胞，将上清液转移至15ml离心管中，加入预冷的PBS洗2遍，清洗液也回收至对应15ml离心管中，用胰酶消化，加入培养基停止消化，回收至对应的15ml离心管中。1000rmp，4℃离心5min，弃掉上清液，加入1ml冷的PBS，重复离心1次。
(4)分组：弃掉上清后，加入1×Annexin V Bingding Solution。DMSO组加入400μl的1×Annexin V Bingding Solution，1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲组加入100μl的1×Annexin V Bingding Solution。各取100μl的细胞悬液，加入到新的流式管中。其中DMSO组分为阴性对照组、Annexin V-FITC染色组、PI染色组、Annexin V-FITC和PI双染色组；药物组记为Annexin V-FITC和PI双染色组。
(5)染色：根据分组向细胞悬液中先加入5μl Annexin V-FITC结合物，混匀后，再加入5μl的PI Solution，混匀，室温下避光培养15min。
(6)流式检测：加入400μl 1×Annexin V Binding Solution，吹打混匀，在1h内上机检测。
结果显示：1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理48h后，HepG-2细胞的早期和晚期凋亡细胞数量均以剂量依赖性方式增加。给1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲后，HepG-2细胞早期凋亡细胞比例由对照组的1.33％增加到26.68％，晚期凋亡细胞比例由对照组的4.05％增加到17.39％。由此可知，1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲能够诱导HepG-2细胞凋亡，从而显著性的抑制其细胞增殖(图8)。
4、1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对HepG-2细胞周期的影响。
由于细胞周期阻滞也是抑制肿瘤细胞增殖的机制之一，故我们利用PI单染结合流式细胞仪研究1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对HepG-2细胞后的细胞周期影响。
4.1PI单染结合流式细胞仪检测细胞周期
具体步骤：
(1)种板：取对数期状态良好的HepG-2细胞，按照7.5×104个/ml的细胞密度，接种于六孔板中，放入培养箱中培养过夜。
(2)1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理：待细胞长至60％-70％，用PBS冲洗两遍，洗掉漂浮的死细胞，每孔加入2ml经培养基稀释过的1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲。1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲组设定浓度为3.125μM。对照组为最大1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲浓度等体积的DMSO，每三孔为一组，每个浓度的1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲设置3组复孔。
(3)收集细胞：1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲作用36h后收集细胞，弃掉上清液，用预冷的PBS冲洗2遍，加入0.25％的无EDTA的胰酶消化，加入培养基停止消化，1000rmp，4℃离心5min，弃掉上清液，加入1ml的PBS，重复离心1次，弃PBS。
(4)乙醇固定：加入1ml 70％的乙醇，4℃冰箱固定过夜。
(5)碘化丙啶染色：根据待测样品的数量配制碘化丙啶染色液，固定后的样品，1000rmp，4℃离心5min，去上清，每管细胞样品中加入500μl碘化丙啶染色液，缓慢充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30min后冰浴避光存放，24h内完成检测。
(6)流式检测：激发波长为488nm，检测红色荧光。
结果表明，在1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲(3.125μM)处理36h后，G0/G1期比例增加(*P＜0.05)，S期比例减少(**P＜0.01)，G2/M比例减少(*P＜0.05)，表明1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲将HepG-2细胞周期阻滞在G0/G1期。(图9)。
5、1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲作用于HepG-2细胞后体内相关蛋白变化情况。
为进一步研究1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲是通过何种作用方式引起细胞发生凋亡，我们对凋亡通路中的一些关键性蛋白的表达情况进行检测及通过转染siRNA进一步证实其作用通路。
5.1蛋白质印迹实验(Western Blot analysis)
具体步骤：
(1)细胞总蛋白的提取：
种板：取对数期状态良好的HepG-2细胞，按照7.5×104个/ml的细胞密度，接种于六孔板中，放入培养箱中培养过夜。
1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲处理：待细胞长至60％-70％，用PBS冲洗两遍，洗掉漂浮的死细胞，每孔加入2ml经培养基稀释过的1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲。1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲组设定浓度为1.56μM，3.125μM，6.25μM，对照组为最大1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲浓度等体积的DMSO。
收集细胞：药物干预48h后，收集上清液集及清洗液，用胰酶消化，加入培养基停止消化，转移至50ml离心管中，4℃1000rpm离心5min，弃上清，加入冷PBS吹打混匀，离心一次，加入1ml PBS，吹匀，转移至1.5ml EP管中，4℃1500rpm离心5min。
裂解细胞：弃上清液，加入裂解混合液，细胞裂解混合液体积比为RIPA:PMSF:磷酸酶抑制剂＝100:1:1，于冰上裂解30min，并用超声破碎仪50％的能量进行超声，使蛋白完全裂解，4℃，12XG离心30min。
(2)BCA测蛋白浓度
标准品稀释：将配制的0.5mg/ml蛋白标准品按以下浓度梯度稀释。
表3蛋白标准品的稀释
待测蛋白的稀释：按40倍稀释，即2μl蛋白样品加78μl去离子水。
96孔板加样：每孔分别加入20μl蛋白标准品稀释液和待测蛋白稀释液，设置三个复孔，再加入200μl BCA工作液，缓慢充分混匀，避免气泡的产生。
孵育：37℃孵育箱避光孵育30min。
酶标仪测吸光度：利用多功能酶标仪测定A562nm下各孔吸光度，以浓度为横坐标，吸光度(OD)为纵坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线计算样品蛋白浓度，蛋白浓度曲线如图2所示。
(3)蛋白变性
根据所测浓度，对蛋白样品的上样量用UP水进行调平，在加入5×上样缓冲液，加入量为蛋白样品的1/4，混合均匀后，变性仪中100℃恒温变性5min。
(4)配胶
检漏：安装好电泳槽，加入去离子水，进行检漏，后将水倒出，用滤纸吸干。
配胶：按表4、表5分别配制分离胶及浓缩胶，每个板子大约需要6.5ml的分离胶及1.5ml的浓缩胶，待分离胶凝固后加入浓缩胶并缓慢插上9孔梳子，静置等待凝胶聚合。
表4配制15ml SDS-PAGE分离胶(12％)各成分体积(毫升)
(5)电泳准备及上样
1×电泳液500ml加入电泳槽，拔梳子排气泡，设计上样孔道。
蛋白样品及Marker上样：9孔梳子的孔道每孔上样15ul的蛋白变性样品及Marker，空白孔道用相同体积1×loading补齐。
电泳：恒压80V，待溴酚蓝跑过浓缩胶后，电压调为120V，待溴酚蓝跑到浓缩胶底部且不跑出，终止电泳。
(6)转膜：将电泳结束后的胶板放入装有1×转膜液(配好后放入4℃冰箱冷藏)的白色空盘里，根据Marker所标记的分子量大小，用翘板除去多余的胶，转膜夹子黑色在下，白色在上，依次铺一层海绵，4层滤纸，凝胶，PVDF膜(PVDF膜放入甲醇中激活20s)，4层滤纸，海绵，合上转膜夹，避免有气泡，放入转膜槽中，倒入转膜液，于冰水浴中恒流转膜90min。
(7)牛奶封闭：转膜结束，用镊子将PVDF膜转移至的牛奶封闭液中，于摇床上室温4℃封闭过夜。
(8)一抗孵育：将PVDF膜放入洗膜液中，于上洗膜3次，每次10min。根据抗体说明书对抗体进行稀释，装入塑封膜中，封口并放入4℃摇床上中孵育过夜。
(9)二抗孵育：将膜从一抗中取出，放入洗膜液中，于摇床上洗膜3次，每次10min。将抗体按照说明书进行稀释，装入塑封膜中，封口于室温摇床孵育1.5h。
(10)显影：将膜从二抗中取出，放入洗膜液中，于室温摇床上洗膜3次，每次10min。将ECl超敏发光液A液B液，等体积混合，然后覆盖在膜表面，上机，显影。
(11)结果分析：使用Image lab凝胶分析系统采集图像并进行分析。
结果显示：p53蛋白上调，MDM2蛋白下调，Bax/Bcl-2比值升高。p53蛋白上调，MDM2蛋白下调表明1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲可能作用于p53-MDM2通路，Bax/Bcl-2比值升高也表明其参与了1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲作用HepG-2细胞后的调控其凋亡(图10)。
5.2小干扰RNA(siRNA)细胞转染
小干扰RNA(Small interfering RNA；siRNA)也称为短干扰RNA(shortinterfering RNA)或沉默RNA(silencing RNA)，是一个长20到25个核苷酸的双股RNA。它通过干扰了表达与互补的核苷酸序列的特定基因的转录后降解的mRNA，从而防止翻译。
具体步骤：
(1)种板：取对数生长期的HepG-2细胞，按照7.5×104个/ml的细胞密度，接种于六孔板中，放入培养箱中，过夜培养，使用不含双抗的培养基进行接种。
(2)转染：待细胞密度达到30％-50％后，弃掉培养基，加入含转染试剂的培养基，注意使用不含双抗的培养基。转染试剂按照厂家说明书进行配制。
(3)转染16h后，收集转染后的细胞，重新计数接种到96孔板，培养10h后，给予药物处理(1.56μM，3.125μM)。并将96孔板放入IncuCyte变焦活细胞成像系统中定时采集图像。
(4)MTT检测及分析数据：48h后进行MTT检测计算其存活率，IncuCyte变焦活细胞成像系统中定时采集图像用于分析细胞存活情况。
结果：(1)沉默p53基因可逆转1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对肝癌细胞的增殖抑制。
在图11中，应用IncuCyte动态观察加药48h后细胞融合率的变化情况。根据不同时刻所收集的图像，进行融合率分析，结果显示，在HepG-2细胞中，对比对照组Control siRNA和p53 siRNA组细胞融合，p53 siRNA组细胞融合率曲线高于对照组Control siRNA，说明下调p53的表达可以促进细胞的增殖。加1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲后，p53 siRNA+Drug组细胞融合率曲线高于Control siRNA+Drug组，说明p53的表达量可以影响1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对细胞的增殖作用，以此证明化合物1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲作用于p53通路。
(2)下调p53蛋白的表达，1,5,6-三甲氧基-2,7-二羟基菲对HepG-2细胞的存活率的影响。
在图12中，在HepG-2细胞中转染p53 siRNA后，按照对照组、p53 siRNA组、ControlsiRNA+Drug组和p53 siRNA+Drug组分别处理细胞，48h后MTT检测细胞存活率。结果显示：对照组中，Control siRNA+Drug(3.125μM)组处理后的HepG-2细胞存活率为33.53％，而在转染p53 siRNA后，p53 siRNA+Drug处理后的HepG-2细胞存活率提高到39.26％(si p53#3)，对照组中，Control siRNA+Drug(1.56μM)组处理后的HepG-2细胞存活率为47.13％，而在转染p53 siRNA后，p53 siRNA+Drug处理后的HepG-2细胞存活率提高到54.97％(si p53#3)，差异具有统计学意义(****P<0.0001)。
本实验数据用Graphpad 8.0.2软件进行统计分析，数据均以均值±标准差表示。图表由GraphPad 8.0.2和Adobe Photoshop CS6软件绘制。*P<0.05被认为有统计学意义。
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