一种单碱基突变方法及采用的系统
本案是申请日为2019/3/26，申请号为2019102324760，专利名称为一种单碱基突变方法及采用的系统的分案申请。
技术领域
本发明属于CRISPR/Cpf1基因治疗领域，具体涉及一种单碱基突变方法及采用的系统。
背景技术
β地中海贫血病(β地贫)是由于β珠蛋白基因的突变或缺失导致的构成血红蛋白HbA(a2β2)的珠蛋白肽链合成减少或不能合成，造成a与β肽链合成失衡所引起的一种常染色体隐性遗传病。Β地贫基因常以点突变最为常见，β珠蛋白非编码区IVS-II-654的点突变(C→T)是最早报道的与β地贫疾病相关的点突变之一，该致病性突变可影响mRNA剪切等加工过程不能准确进行形成异常的mRNA，从而导致β地中海贫血。
据报道，全世界约有4亿地中海贫血症基因携带者。在我国，该疾病好发于南方地区，尤其是广东省境内发生率远远高于其他省份。2012年对广东省21个地市共14332个户籍住院分娩孕妇的筛查研究发现，地贫基因携带率为16.8％，即高达1/6育龄人群携带地贫基因。每例重症地贫患儿的出生给社会和家庭带来的经济负担高达100万到300万元。目前可通过终生输血治疗地中海贫血症，然而绝大多数患儿在积极治疗的情况下仍在成年前死亡。另一种治疗方法则是通过骨髓或造血干细胞移植，但要找到相匹配的异体捐赠者非常困难，且费用不菲。目前只能通过胚胎植入前行遗传学诊断技术或通过胎儿脐血细胞基因检测技术筛选正常的胚胎或胎儿来阻断地贫致病基因的传播。随着基因编辑技术的出现与发展，如何利用基因编辑技术对基因突变类型遗传性疾病进行预防与治疗是目前新兴的疾病临床治疗模式。
从2011年美国率先提出“迈向精准医学”的倡议后，中国的精准医学也不断向前推进。“精确的基因编辑”是基因编辑技术的核心，也是精准医学的重要体现。开展基于特异性基因突变所致疾病的基因编辑精准治疗，获得更加精准高效的基因编辑是未来疾病治疗的创新方向。CRISPR技术自2012年面世以来，极大地促进了基因编辑在多种疾病包括恶性肿瘤和遗传性疾病的治疗作用，获得了广泛的临床应用，诸如此类：2016年美国国立卫生研究所批准了从癌症患者体内提取出免疫系统的T细胞，利用CRISPR对T细胞进行基因修饰，并将基因修饰后的T细胞输回病人体内，基因修饰后的T细胞将靶向摧毁肿瘤细胞；2018年5月，NATURE杂志报道了通过CAR-T治疗治愈一例患者白血病的病例；在中国，2016年10月首次批准了利用CRISPR开展人体临床试验，来治疗化疗、放疗以及其它疗法治疗无效的转移性非小细胞肺癌患者等等。本发明针对HBB-28地中海贫血基因点突变致病这一单基因遗传病，试验了该高效基因编辑治疗方法的高效性和实用性。
已有报道利用CRISPR治疗地中海贫血：通过利用基因编辑工具CRISPR精确特异性修复患者体细胞β珠蛋白基因(hemoglobin subunit beta，HBB)缺陷基因，然后将基因编辑与修复后的体细胞诱导成多能干细胞，最后移植入体内，从而分裂和分化为相应有功能的红细胞，来治疗和缓解β-地中海贫血患者症状。目前，针对β型地中海贫血的基因治疗，着手对象已从诱导型多能干细胞(iPS)和造血干细胞(HSC)过渡到人类胚胎，直接阻断该遗传性疾病的垂直传播。
2015年专利申请者在世界上首次利用CRISPR基因编辑技术对异常授精的人类3PN受精卵进行HBB基因编辑修复，观测到CRISPR对人胚胎中靶基因切割效率达到51.9％，但同时发现脱靶明显。2017年，申请者再次利用单碱基编辑系统(APOBEC1)以及核移植技术，第一次在人类胚胎中实现了单碱基编辑，成功地对导致β-地中海贫血的一种单核苷酸突变-28位突变进行校正。这种单碱基编辑系统由CRISPR的变体与胞嘧啶脱氨酶构成，通过导向RNA直接指向正确DNA位置，用胸腺嘧啶(T)替换鸟嘌呤(C)。但基因修复效率仅仅只有23％，并且修复后得到胚胎仍然是嵌合体，被修复的卵裂球也只有20％，很难实现完全治愈，且操作起来复杂繁琐。除此之外，该方法也存在较高的脱靶率。以上几种特征将极大地限制该技术在基因编辑治疗β地中海贫血中的使用。
发明内容
基于以上，申请者在前期基础上，基于CRISPR的基因组编辑框架，利用氨基酸的简并性及密码子优化，设计合成了新的高效精准修复的donor——在修饰型修复模板(ssODN)上引入无义突变，即突变的碱基并不会引起相应氨基酸的改变，它能以高效率及精度选择性引入单等位基因和双等位基因序列改变，极大地促进精确修复的提高。技术原理叙述如下：
CRISPR/Cas基因编辑系统来源于细菌适应性免疫系统，由核酸酶Cas和20bp的向导RNA(sgRNA)组成。CRISPR的特异性切割是由sgRNA介导的，sgRNA通过RNA-DNA碱基互补配对，与基因组DNA上邻近有protospacer-adjacent motif(PAM)序列的位点相结合，将Cas酶导向靶位点。这种由可编程sgRNA进行的简单目标导航，使CRISPR系统有别于早期的技术(如锌指核酸酶或转录激活因子样效应核酸酶(TALENs)，这两种技术都需要复杂的DNA结合蛋白结构域的组装来进行位点特异性编辑)。CRISPR/Cpf1是一种新的2类V型CRISPR效应蛋白，是在单链向导RNA引导下与靶DNA特定位点结合幵切割的核酸内切酶。与常用的经典CRISPR/Cas9相比，Cpf1只需一段42-44个核苷酸组成的单链RNA即可识别和剪切DNA，从而简化了实验设计步骤，更有利于多基因编辑；Cpf1剪切会产生黏性末端，可促使目的基因插入靶定位点；此外，Cpf1能够识别富含胸腺嘧啶(T)的PAM序列，可以扩展CRISPR的编辑范围。CRISPR/Cpf1的开发有利于突破和克服CRISPR/Cas9应用中的一些限制，因此被称为是新一代的CRISPR基因组编辑工具。参考本发明研究针对的β珠蛋白IVS-II-654致病性突变的序列特征，可知突变点附近有适用于采用CRISPR/Cpf1进行基因组编辑的靶标位点。
CRISPR/Cpf1蛋白需要有PAM和sgRNA结合才能在特异性位点引入双链断裂(DSB)。在大多数情况下，这些DSBs通过非同源末端连接(NHEJ)途径修复，导致非特异性插入、缺失或其他突变，通常称为‘indels’。这很容易在目标基因的开放阅读框产生突变导致密码子提前终止翻译或者错误翻译，从而达到基因敲除的目的。然而，NHEJ修复不允许引入特定的序列改变，对于维持正常生命功能必需的正常基因突变致病这一类型的精准基因治疗来说并不适用。
要产生特定的序列改变，例如，引入致病突变或纠正患者衍生细胞系中的突变，必须使用同源定向修复(HDR)，这是一种独特的细胞DNA修复途径。要做到这一点，最常见的方法是同时引入一个修改的DNA修复模板，例如单链寡核苷酸(ssODN)，其中包含与DSB周围基因组区域同源的两端侧翼序列，以及预期的序列变化。单链DNA常常作为“donor template”被广泛应用于基因编辑过程中，可实现定点修复和DNA片段敲入，研究表明长度为70-100bp的ssDNA作为同源臂具有更高的定点修复和片段敲入效率，更易筛选获得定点编辑和片段敲入的突变体。在哺乳动物细胞中，HDR相对少见，基因组被CRISPR编辑产生的双链断裂(double-strand break，DSBs)主要由NHEJ修复，但细胞周期调控、NHEJ组分抑制或引入修复模板可提高HDR的频率。然而，通过HDR生成所需的基因组编辑事件，也需要通过防止切割后sgRNA再次靶向结合来提高编辑的准确性，而这一点在早期的研究中并没有直接解决。这些“不准确”的编辑来源于CRISPR复合体对先前编辑过的位点的重新编辑，这将重新出现目标位点，直到它们被充分修改(图1)。我们通过在CRISPR靶向的目标序列中，利用氨基酸的兼并性，引入无义突变(blocking base)到HDR-ssDNA修复模板中，可以在很大程度上防止不受欢迎的再次编辑(图2)，达到无痕修复的目的。
ssDNA donor已在多个实验体系中(包括在细胞实验和胚胎显微注射等等)被证实有强大的定点修复效率。末端核苷酸的部分硫代修饰可极大提高ODN抵抗核酸酶降解的能力，而不必对整个ODN均进行硫代修饰，硫代的寡聚核苷酸虽能与互补链的RNA或DNA片段杂交形成稳定的双链结构，但研究表明，比较其Tm值的变化发现，这种双链的稳定性和解链温度(Tm)与相应正常寡核苷酸的双链相比有一定减小，此外，硫代寡核苷酸常常对正常细胞有轻微毒性作用。寡核苷酸末端部分硫代修饰的方法既克服了完全硫代修饰的上述缺点，又大大提高了寡核苷酸的稳定性，是改进核酸治疗效果的一个好方法。目前我们采用了对5’和3’端2个碱基进行硫代修饰的ssODN，在实验中观察其达到了最佳的定点编辑效果。此种方法的运用和研究主要集中在细胞系或动物胚胎，在人类胚胎细胞中的运用鲜有报道。
因此，本发明针对HBB-IVS-II-654点突变的地中海贫血这一非编码区点突变的常染色体隐性遗传病，构建相应的靶向地中海贫血中该突变位点的CRISPR/Cpf1表达质粒，同时采用5’和3’端2个碱基硫代修饰的ssDNA(单链寡核苷酸)，并在其中利用氨基酸简并性原理引入阻断再次编辑的无义突变，合成为donor，将CRISPR/Cpf1表达质粒和donor二者共同转染到细胞中，在293TT细胞中特异性的诱导IVS-II-654型地中海贫血中基因突变位点的无痕定向改造，对开展基于单基因点突变疾病的基因编辑精准治疗，具有重要的临床应用价值。
为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
本发明的一个目的是提供一种单碱基突变方法，包括如下步骤：
(1)针对欲突变基因的点突变位点设计sgRNA；
(2)将所述的sgRNA和CRISPR/Cpf1切割酶克隆到真核表达载体PX330上构建具有特异性靶向切割能力的CRISPR/Cpf1质粒；
(3)截取欲突变成基因的突变点附近的碱基序列，并在所述的碱基序列中引入无义突变和对所述的碱基序列的5’和3’端的碱基进行硫代修饰，然后合成donor1；
(4)将所述的CRISPR/Cpf1质粒和所述的donor1共转染含有欲突变基因的细胞，经克隆筛选后得到含有无义突变的细胞；
(5)针对所述的含有无义突变的细胞中的含有无义突变的序列的点突变位点设计Re-sgRNA；
(6)将所述的Re-sgRNA和CRISPR/Cpf1切割酶克隆到真核表达载体PX330上构建Re-CRISPR/Cpf1质粒；
(7)截取欲突变成基因的突变点附近的碱基序列，并对所述的碱基序列的5’和3’端的碱基进行硫代修饰，然后合成donor2；
(8)将所述的Re-CRISPR/Cpf1质粒和所述的donor2共转染所述的含有目标突变以及无义突变的细胞，得到含有欲突变成基因的细胞系。
优选地，所述的方法针对IVS-II-654型地中海贫血的点突变。
优选地，步骤(3)和步骤(7)中，进行所述的硫代修饰时，对5’和3’端的两个碱基进行修饰。
优选地，所述的donor1和所述的donor2的长度为90bp。
优选地，所述的sgRNA的序列为aatttctactcttgtagattgggttaaggcaatagcaatat、aatttctactcttgtagatctattgccttaacccagaaatta、aatttctactcttgtagataggcaatagcaatatctctgcat，所述的Re-sgRNA的序列为aatttctactcttgtagatctggtaccttaacccagaaatta。
优选地，所述的donor1的序列为
c*c*attctaaagaataacagtgataatttctgggttaaggtaccagcaatatctctgcatataaatatttctgcatataaattgtaact*g*a，所述的donor2的序列为
c*c*attctaaagaataacagtgataatttctgggttaaggcaatagcaatatctctgcatataaatatttctgcatataaattgtaact*g*a，其中，*表示硫代修饰。
本发明的另一个目的是提供一种用于单碱基突变的系统，所述的系统包括用于向欲突变基因中引入无义突变的第一系统单元，以及用于将经第一系统单元定向突变后的基因突变为欲突变成基因的第二系统单元，所述的第一系统单元包括CRISPR/Cas9Cpf1质粒和donor1，所述的第二系统单元包括Re-CRISPR/Cas9Cpf1质粒和donor2，所述的donor1的碱基序列中含有无义突变。
优选地，所述的无义突变的碱基为cc。
优选地，所述的用于单碱基突变的系统能特异性的诱导HBB-IVS-II-654致病性突变的修复。所述特异性指只针对HBB-IVS-II-654致病位点的特异性，靶向其的CRISPR/Cpf1和相应的donor，仅能特异性的诱导HBB-IVS-II-654致病性突变的修复，对HBB-β41/42等其他类型致病性突变和正常细胞无编辑治疗作用。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明通过引入无义突变，能够避免经修复后的基因序列再次被切割，从而提高了切割效率，降低了脱靶效应，从而能够达到无痕修复的目的，对开展基于单基因点突变疾病的基因编辑精准治疗，具有重要的临床应用价值。
附图说明
图1为CRISPR/Cpf1介导的双链断裂之后的基因修复方式说明，注：在CRISPR/Cpf1介导的双链断裂(1)之后，大多数基因将通过易出错的NHEJ途径修复，导致随机基因突变(2)。在～1-10％的病例中，引入了同源DNA修复模板产生了HDR(3)提供的预期序列改变。然而，仅在极少数情况下，这一序列变化是准确的(即没有被额外的CRISPR/Cpf1再次编辑所破坏)(4)。在大多数DSB修复中，CRISPR/Cpf1复合体将重新出现并结合到靶标位置(5)，并造成额外的indels(6)。
图2为在donor上引入无义突变的blocking碱基进行无痕修复的模式图，注：B——blocking mutation，位于HDR修复模板中sgRNA靶向的序列当中，以减少整合修复后的再次切割；M——与致病基因突变修复有关的突变，同样位于HDR修复模板中，以引入需要的目的突变。
图3为ssDNA donor的修饰模式图，注：星号*代表硫代修饰，上图显示在ssDNA的两末端进行2个碱基的硫代修饰。
图4为采取临床样本中正常人(纯合无突变)、轻型HBB-IVS-II-654地贫患者(杂合突变)和重型HBB-IVS-II-654地贫患者(纯合突变)的血液DNA进行sanger测序，明确IVS-II-654致病性突变为C→T致病。
图5为依据图2的设计原理，在突变位点附近设计sgRNA，将正常293TT细胞定点突变为异常的纯合突变型HBB-IVS-II-654-293TT细胞的序列设计模式图，注：第一行和第三行序列中的框指示原始目标突变序列(intended mutation)为C，第二行序列中的小框指示突变成IVS-II-654后此处变为致病性突变T，第二个序列中的大框指示donor上引入无义突变同时可产生原本不具有的限制性酶切位点KpnI，改良的donor整合后可通过此酶切位点快速鉴定是否整合，以及是否在基因组序列中引入blocking base进行了无痕修复；第二行序列底下的小方块上方的2个碱基(cc)为引入的blocking base，该blocking base可以避免donor整合修复后被同样的sgRNA再次靶向识别。
图6为CRISPR/Cpf1粒和donor-ssDNA共转染293TT细胞后，抽提总细胞基因组DNA进行PCR扩增包含突变的目的片段后，进行的酶切实验，其中T7E1酶切实验鉴定刀子的切割效率，KpnI酶切实验鉴定donor-ssDNA整合的效率，两组酶切实验控制为同一批实验，并且模板量一致。
图7为通过对图6的胶图进行灰度分析，量化后所计算的效率值，注：编辑效率的计算公式为：％gene modification＝100x(1–(1-fraction cleaved)1/2)。T7E1酶切效率——反映刀子靶向切割的效率；KpnI酶切效率——当donor整合至目标位置时，会被此酶识别并切割；Donor的整合效率——计算公式为修复效率＝整合效率＝(KpnI酶切效率/T7E1酶切效率)x100％，此效率代表了整合修复引入突变的修复效率，亦是本发明更为关注的效率。
图8为将编辑后的细胞种单克隆细胞，挑选出单克隆IVS-II-654突变型293TT细胞系，提取DNA后进行PCR目标片段后sanger测序，进一步鉴定donor是否整合修复，注：覆盖一个碱基的小方框代表基因组引入IVS-II-654突变，C→T；覆盖二个碱基的小方框代表引入的无义突变碱基，AT→CC。第一行序列中覆盖一个碱基的小方框，表示在正常的序列中，此处的正常碱基为C；第二行序列中覆盖一个碱基的小方框，表示在纯合致病性突变的临床患者中，该处致病性突变碱基为T；第三行序列中，表示经过基因编辑后，覆盖一个碱基的小方框代表了本发明方法引入的目标突变T，覆盖二个碱基的小方框代表本发明方法引入的无义突变碱基，AT→CC。需进一步说明的是：此处的正常碱基为C的由于单克隆IVS-II-654突变型293TT测序方向为反向测序，因此在测序峰图上表现为IVS-II-654突变G→A，根据碱基互补配对原则，即对应着正向测序的C→T，即所需的目标突变；覆盖二个碱基的小方框代表引入的无义突变碱基，AT→CC红色框代表引入的无义突变碱基，TA→GG。
图9为，使用同样的研究方法策略，仅仅将sgRNA和donor1分别替换Re-sgRNA和donor2，将单克隆IVS-II-654突变型293TT细胞系，再次进行编辑，将其进一步突变回正常野生型的293TT细胞系，并通过PCR-sanger测序进行验证，注：覆盖一个碱基的小方框代表将引入IVS-II-654突变修复为正常的碱基，T→C；覆盖二个碱基的小方框代表引入的无义突变碱基修复为正常的野生型碱基，CC→AT。由于单克隆IVS-II-654突变型293TT测序方向为反向测序，因此在测序峰图上表现为IVS-II-654突变G→A；红色框代表引入的无义突变碱基，TA→GG。
具体实施方式
以下将通过具体实施例进一步阐述本发明，但并不用于限制本发明的保护范围。本领域技术人员可在权利要求范围内对制备方法和使用仪器作出改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
本实施例中使用的引物设计均使用Primer3 Plus在线引物设计工具(http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)完成；由苏州金唯智生物科技有限公司合成，整合的硫代修饰型donor-ssDNA由苏州金唯智生物科技有限公司合成；鉴定刀子是否切割所使用的工程酶T7E1酶，购自NEW ENGLAND BIOLAB(货号为#M0302S)，鉴定donor整合修复的工程酶KpnI酶以及配套的10×Buffer购自Thermo Scientific公司(货号：FD0524)。sanger测序委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成，依据专利申请者设计的序列进行质粒构建由苏州金唯智生物科技有限公司完成等。
1、采取临床样本中正常人(纯合无突变)、轻型IVS-II-654地贫患者(杂合突变)和重型IVS-II-654地贫患者(纯合突变)的血液DNA进行sanger测序，明确IVS-II-654突变为C→T致病。
使用采血针采取正常人(纯合无突变)、轻型IVS-II-654地贫患者(杂合突变)和重型IVS-II-654地贫患者(纯合突变)的血液样本，并使用全式金DNA抽提试剂盒(货号：#M10122)，依据操作说明提取血液中的DNA，结果见图4。
通过NCBI数据库，寻找IVS-II-654突变点的上下游序列，在Primer3 Plus在线引物设计工具网站(http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)设计引物，扩增目标突变点的上下游片段，PCR产物送上海生工生物技术公司进行Sanger测序，明确IVS-II-654突变特征为C→T单碱基点突变。引物序列为:
primer-F:aactttacacagtctgcctagt(SEQ ID NO.1)
primer-R:aagggcctagcttggactca(SEQ ID NO.2)
对重型IVS-II-654地贫患者(纯合突变)的血液DNA进行测序所得的测序序列为：(标粗大写碱基为突变碱基T)
2、依据图2的设计原理，在对正常人(纯合无突变)的血液DNA进行测序所得测序所得序列的突变位点附近设计sgRNA，设计并挑选3条最佳的sgRNA，据此构建CRISPR质粒。
挑选的序列为：
sgRNA1：
sgRNA2：
sgRNA3：
其中，标粗字母为sgRNA序列与靶DNA结合的序列，未标粗字母部分为scaffold(DR)，即sgRNA发挥作用的二级结构区域。
CRISPR/Cpf1的表达载体构建方法参考引文(Zhang F.Cell.2015 Sep 23.pii:S0092-8674(15)01200-3.doi:10.1016/j.cell.2015.09.038.)中的构建方法完成构建，将Cpf1序列和sgRNA序列克隆到表达载体PX330上，构建CRISPR/Cpf1的真核表达载体质粒，构建完成后，通过常规测序比对确定构建载体序列正确无突变，挑选出完全正确的克隆进行扩增并提取质粒。
3、依据图2的设计原理，设计合成定点无痕突变的donor1序列并合成。
截取IVS-II-654突变点附近的90bp碱基序列，在其中引入IVS-II-654致病突变(标粗)和无义突变(大写)，并在两端进行硫代修饰(*所示)，donor序列如下：
序列提交苏州金唯智生物科技有限公司合成。
4、鉴定CRISPR/Cpf1质粒刀子的切割作用以及donor是否整合。
将CRISPR/Cpf1质粒和donor1-ssDNA共转染293TT细胞后，抽提总细胞基因组DNA进行Sanger测序验证CRISPR/Cpf1质粒刀子的切割作用以及donor1是否整合。WT代表没有转染CRISPR/Cpf1质粒；sgRNA1，sgRNA2和sgRNA3(即654-g1，654-g2，654-g3)分别代表在IVS-II-654突变位点附近设计的3条sgRNA。质粒和ssDNA转染到细胞后，质粒表达出来的靶向IVS-II-654突变位点的CRISPR/Cpf1系统，可以迅速的识别IVS-II-654突变位点序列，发挥切割作用。切割后细胞在有外源ssDNA作为修复模板的时候，增加同源修复HDR的效率。同时将抽提的细胞基因组DNA进行PCR扩增包含突变的目的片段后开展酶切实验，其中T7E1酶切实验鉴定刀子的切割效率，KpnI酶切实验鉴定donor1-ssDNA整合的效率，两组酶切实验控制为同一批实验，并且模板量一致。可观测到实验组(654-g1，654-g2，654-g3)均出现T7E1酶和KpnI酶的酶切条带。
具体操作方法是：
(1)细胞培养
293TT细胞系用含有10％血清的DMEM完全培养基在37℃、5％CO2培养箱里培养。待细胞融合度达到90％时用0.25％的胰酶消化后，用DMEM完全培养基终止消化，接种到6孔板中，继续培养24小时。
(2)质粒转染
24小时后，确认细胞贴壁良好，细胞融合度达到80％，即可进行转染。每孔转染2ugCRISPR/Cpf1质粒以及100pmol的donor-ssDNA，使用Roche公司的X-tremeGENE HP DNATransfection Reagent转染试剂按照说明书要求进行转染，转染后的细胞继续在37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)基因组DNA抽提
转染48小时后，常规使用0.25％的胰酶消化细胞，收集细胞到离心管中，常温条件下300g离心5分钟，PBS洗涤一次，常温条件下300g离心5分钟。使用全式金DNA抽提试剂盒(全式金生物技术有限公司，货号：EE101-01)的试剂组分，按照以下方法抽提细胞基因组DNA：
·加入100ul细胞裂解液LB2，充分混匀，悬浮细胞，加入20ul RnaseA以及20ulProteinase K于样品中，涡旋混匀，室温孵育2min。
·加入500ul结合DNA的BB2试剂，立即涡旋5秒钟，室温孵育10min。
·将全部的溶液加入离心柱中，12000xg离心30秒，弃去流出液。
·加入500ul溶液clean buffer2(CB2)，12000xg离心30秒，弃去流出液。然后重复一次。
·加入500ul溶液wash buffer2(WB2)，12000xg离心30秒，弃去流出液。然后重复一次。
·12000xg离心2分钟，彻底去除残留的WB2。
·将离心柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入50ul预热(60-70℃)的去离子水(PH>7)室温静置1分钟，12000xg离心1分钟，洗脱DNA。测量DNA浓度。
(4)引物的设计
采用之前扩增目标突变点的上下游片段的引物，引物两端横跨靶点(产物长度优选～500bp，并且靶点距离引物两段的距离应当差别50bp以上以便在琼脂糖凝胶电泳时能有效的区分酶切开的两个小片段)。PCR产物送上海生工生物技术公司进行Sanger测序，扩增引物和测序引物一致，序列为:
primer-F:aactttacacagtctgcctagt(SEQ ID NO.8)
primer-R:aagggcctagcttggactca(SEQ ID NO.9)
(5)PCR反应
以上述提取的基因组DNA为模版，用上述引物进行PCR反应。本实验使用的高保真DNA聚合酶为北京全式金生物科技有限公司的PCR SuperMix(货号：AS111-02)。
PCR反应体系：
PCR反应条件：
PCR反应完成后，取少量PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果初步判定PCR产物的浓度以及条带大小是否正确等。
(6)T7 Endonuclease I酶切实验及琼脂糖凝胶电泳
本实验使用的T7 Endonuclease I以及配套的10×NEB Buffer 2购自NewEngland Biolabs公司(货号：M0302S)。操作步骤如下：
取200ng纯化PCR产物进行如下反应：
反应体系：
退火条件：
退火反应完成后，此时再加入T7 Endonuclease I 1μL，震荡混匀后，37℃孵育20分钟完成切割，加入2μL 0.25M EDTA溶液终止酶切反应。反应完成后，使用2％琼脂糖凝胶进行电泳。
琼脂糖凝胶电泳结果显示，上述PCR产物能被T7 Endonuclease I切断，出现一大一小两条条带(见图6)，说明CRISPR/Cpf1在细胞内成功的切割IVS-II-654基因序列，通过ImageJ软件对条带的灰度值进行测算，就能估算其切割效率(见图7)。
(7)整合鉴定KpnI酶切实验及琼脂糖凝胶电泳
本实验使用的KpnI酶以及配套的10×Buffer购自Thermo Scientific公司(货号：FD0524)。操作步骤如下：
取200ng纯化PCR产物进行如下反应：
反应体系：
混匀后，37℃孵育1小时完成切割，加入2μL 0.25M EDTA溶液终止酶切反应。反应完成后，使用2％琼脂糖凝胶进行电泳。
琼脂糖凝胶电泳结果显示，上述PCR产物能被KpnI切断，出现一大一小两条条带(见图6)，说明CRISPR/Cpf1在细胞内成功切割IVS-II-654基因后，修饰的donor1-ssDNA整合至了目标位点。通过Image J软件对条带的灰度值进行测算，就能估算KpnI切割效率，将其与T7E1酶切效率进行比较，即可计算获得donor的整合效率(见图7)。
5、通过挑选单克隆细胞进一步鉴定筛选出IVS-II-654突变及无义突变的293TT细胞系。
单克隆细胞测序数据显示，通过此方法成功在正常293TT细胞中引入了IVS-II-654突变及无义突变，从而获得IVS-II-654突变型293TT细胞系。表明了高效定点突变方法的成功使用。
·取转染48h后的各组细胞，分别用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10％胎牛血清的DMEM培养液中备用。
·将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀，最终使培养孔中最多包含1个细胞。置37℃5％CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。
·经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，扩增传代至细胞数量达到50万个/孔，收取一部分细胞按前述方法抽提细胞DNA，按前述方法PCR扩增后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
6、依据图2的设计原理，在步骤5抽提的细胞DNA测序所得序列的突变位点附近设计sgRNA，设计1条最佳的sgRNA，据此构建Re-CRISPR/Cpf1质粒，以将654-293TT细胞突变回正常的野生型293TT细胞。
·根据前述试验结果，挑选与654-g2相对的sgRNA序列为：
654-repair-sg2：
其中，标粗字母为sgRNA序列与靶DNA结合的序列，未标粗字母部分为scaffold(DR)，即sgRNA发挥作用的二级结构区域。
CRISPR/Cpf1的表达载体构建方法参考引文(Zhang F.Cell.2015 Sep 23.pii:S0092-8674(15)01200-3.doi:10.1016/j.cell.2015.09.038.)中的构建方法完成构建，将Cpf1序列和sgRNA序列克隆到表达载体PX330上，构建CRISPR/Cpf1的真核表达载体质粒，构建完成后，通过常规测序比对确定构建载体序列正确无突变，挑选出完全正确的克隆进行扩增并提取质粒。
7、依据图2的设计原理，设计合成定点无痕突变的donor2序列并合成。
·截取IVS-II-654突变点附近的90bp碱基序列，在其中引入修复IVS-II-654突变(标粗字体)和无义突变(大写字母)，并在两端进行硫代修饰(*所示)，donor序列如下：
序列提交苏州金唯智生物科技有限公司合成。
8、将被编辑为654突变和无义突变的293TT单克隆细胞，再次进行编辑，将其进一步突变回正常野生型的293TT细胞系，并通过PCR-sanger测序进行验证。
由于前期已经验证了654-sg2质粒的切割效果，而针对修复所设计的654-repair-sg2为其相对序列，因此我们将654-repair-sg2的CRISPR/Cpf1质粒和donor-ssDNA共转染293TT细胞后，直接挑选修复为正常野生型的293TT细胞的阳性克隆佐证该方法的有效性，鉴定结果见图9。
具体操作方法是：
(1)细胞培养
293TT细胞系用含有10％血清的DMEM完全培养基在37℃、5％CO2培养箱里培养。待细胞融合度达到90％时用0.25％的胰酶消化后，用DMEM完全培养基终止消化，接种到6孔板中，继续培养24小时。
(2)质粒转染
24小时后，确认细胞贴壁良好，细胞融合度达到80％，即可进行转染。每孔转染2ugCRISPR/Cpf1质粒以及100pmol的donor2-ssDNA，使用Roche公司的X-tremeGENE HP DNATransfection Reagent转染试剂按照说明书要求进行转染，转染后的细胞继续在37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)种单克隆细胞
取转染48h后的各组细胞，分别用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10％胎牛血清的DMEM培养液中备用。
将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀，最终使培养孔中最多包含1个细胞。置37℃5％CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。
(4)单克隆细胞基因组DNA抽提
经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，扩增传代至细胞数量达到50万个/孔，收取一部分细胞按以下方法抽提细胞DNA：
常规使用0.25％的胰酶消化细胞，收集细胞到离心管中，常温条件下300g离心5分钟，PBS洗涤一次，常温条件下300g离心5分钟。使用全式金DNA抽提试剂盒(全式金生物技术有限公司，货号：EE101-01)的试剂组分，按照以下方法抽提细胞基因组DNA：
·加入100ul细胞裂解液LB2，充分混匀，悬浮细胞，加入20ul RnaseA以及20ulProteinase K于样品中，涡旋混匀，室温孵育2min。
·加入500ul结合DNA的BB2试剂，立即涡旋5秒钟，室温孵育10min。
·将全部的溶液加入离心柱中，12000xg离心30秒，弃去流出液。
·加入500ul溶液clean buffer2(CB2)，12000xg离心30秒，弃去流出液。然后重复一次。
·加入500ul溶液wash buffer2(WB2)，12000xg离心30秒，弃去流出液。然后重复一次。
·12000xg离心2分钟，彻底去除残留的WB2。
·将离心柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入50ul预热(60-70℃)的去离子水(PH>7)室温静置1分钟，12000xg离心1分钟，洗脱DNA。测量DNA浓度。
(5)引物的设计
采用之前扩增目标突变点的上下游片段的引物，引物两端横跨靶点(产物长度优选～500bp，并且靶点距离引物两段的距离应当差别50bp以上以便在琼脂糖凝胶电泳时能有效的区分酶切开的两个小片段)。PCR产物送上海生工生物技术公司进行Sanger测序，扩增引物和测序引物一致，序列为:
primer-F:aactttacacagtctgcctagt(SEQ ID NO.12)
primer-R:aagggcctagcttggactca(SEQ ID NO.13)
(6)PCR反应
以上述提取的基因组DNA为模版，用上述引物进行PCR反应。本实验使用的高保真DNA聚合酶为北京全式金生物科技有限公司的PCR SuperMix(货号：AS111-02)。
PCR反应体系：
PCR反应条件：
PCR反应完成后，取少量PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果初步判定PCR产物的浓度以及条带大小是否正确等。
(6)PCR扩增后产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。通过此方法成功在正常IVS-II-654突变型293TT细胞系修复突变为正常的野生型293TT细胞。表明了高效定点突变方法的成功使用。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 珠海舒桐医疗科技有限公司
<120> 一种单碱基突变方法及采用的系统
<160> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(rengongxulie)
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<213> Homo sapiens
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