Plpp1在利用car-t技术防治实体瘤中的应用
技术领域
本申请属于肿瘤防治
技术领域
，具体涉及磷脂磷酸酶PLPP1在利用CAR-T技术防治实体瘤中的应用专利申请事宜。背景技术
恶性肿瘤是人类健康的一大杀手，目前主要治疗方法包括：手术、放化疗、靶向治疗及各种联合疗法，但治疗效果因人因病而异。近年来，基于人体免疫系统开发出来的免疫疗法，因其适用范围广、副作用小、不会产生耐药性等优点，因此被认为是最优技术前景的肿瘤防治方法。
CAR-T细胞疗法，则是基于免疫疗法原理，进一步将基因疗法与过继性细胞回输结合产生的新型肿瘤免疫治疗方法，该疗法中，CAR是将抗体的特异性识别能力与T细胞的激活信号进行融合，赋予T细胞不依赖于MHC的抗原特异性，因而具有更强的肿瘤针对性、更好的防治效果。
临床上，依据肿瘤形态特点，可将肿瘤分为实体肿瘤和非实体肿瘤。其中，实体肿瘤即有形瘤，可通过临床检查如x线摄片、CT扫描、B超、或触诊检测到有实体肿块，而通过X线、CT扫描，B超及触诊检测无法看到的肿瘤如血液系统肿瘤中的白血病就属于非实体肿瘤。
现有技术中，CAR-T疗法在血液系统肿瘤防治中表现出良好的应用前景，但在实体瘤的防治中，CAR-T疗法仍然存在较多问题，其主要影响因素包括：实体肿瘤靶点蛋白表达的异质性、浸润障碍、毒性反应、CAR-T扩增和持久性等多个方面。
已有研究认为，实体肿瘤往往被大量的调节性T细胞、骨髓来源的抑制细胞（MDSC）、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）和肿瘤相关成纤维细胞等不同类型的非恶性细胞浸润，而这些细胞能够支持肿瘤生长，促进血管生成和肿瘤转移同时抑制抗肿瘤免疫反应。因此，肿瘤微环境的影响，也是实体肿瘤防治中与血液系统肿瘤防治的主要区别之一，也是影响CAR-T防治效果的最主要因素之一。另一方面，恶性细胞的高代谢速率导致肿瘤局部营养缺乏和免疫抑制性代谢废物的累积也是肿瘤微环境的重要特点之一。
细胞代谢是细胞发挥正常功能的基础。T细胞实现异物识别、信号传导、克隆扩增进而发挥杀伤功能都依赖于代谢的正常进行。而已有研究表明，细胞内的脂肪酸代谢对T细胞功能的发挥具有特殊作用。脂肪酸不仅是构成 细胞膜磷脂的主要成分之一，还能够通过脂肪酸氧化为细胞供能、参与细胞信号分子合成与信号传递。
磷脂磷酸酶 1（PLPP1），是一种多功能的磷酸磷脂酶，能够催化多种脂肪酸磷酸脂的水解，包括LPA、S1P、PA、CRE-P等。已有研究报道认为，PLPP1 在大部分恶性肿瘤中表达下调，从而导致LPA在肿瘤部位积累，而LPA作为一种生长因子可以促进肿瘤细胞的生长。另外，S1P在T细胞归巢过程中起重要作用，而PA是PLPP1 的胞内催化底物，能够被PLPP1 水解成DAG，DAG又是TCR下游信号传递重要的第二信使，对T细胞的增殖非常重要。由此可见虽然PLPP1对细胞代谢、肿瘤微环境具有十分重要的影响，因此，对于PLPP1对于T细胞免疫功能发挥是否具有直接影响，是极有必要加以研究和明确的。
发明内容
基于PLPP1在细胞代谢中的用途，本申请目的在于提供一种新的肿瘤防治策略，从而为相关肿瘤防治奠定一定技术基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
PLPP1在利用CAR-T技术防治实体瘤中的应用，利用CAR-T技术防治实体瘤时，PLPP1可以增强T细胞分泌杀伤因子能力，同时可以增强T细胞的增殖能力。
一种利用PLPP1所构建的CAR-T载体，具体通过如下步骤构建获得：
（一）获取人PLPP1开放阅读框克隆序列
首先，设计PCR克隆用引物序列如下：
PLPP1-F: 5’-atgtttgacaagacgcggct-3’，
PLPP1-R: 5’-aggctggtgattgctcggat-3’；
随后，以所提取的人外周血单个核细胞RNA反转录所制备的cDNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行电泳检测、并切胶回收PCR扩增产物，所得即为人PLPP1开放阅读框序列；
所述人PLPP1开放阅读框序列（854bp），具体参考如下：
Atgtttgacaagacgcggctgccgtacgtggccctcgatgtgctctgcgtgttgctggcttccatgcctatggctgttctaaaattgggccaaatatatccatttcagagaggctttttctgtaaagacaacagcatcaactatccgtaccatgacagtaccgtcacatccactgtcctcatcctagtgggggttggcttgcccatttcctctattattcttggagaaaccctgtctgtttactgtaaccttttgcactcaaattcctttatcaggaataactacatagccactatttacaaagccattggaacctttttatttggtgcagctgctagtcagtccctgactgacattgccaagtattcaataggcagactgcggcctcacttcttggatgtttgtgatccagattggtcaaaaatcaactgcagcgatggttacattgaatactacatatgtcgagggaatgcagaaagagttaaggaaggcaggttgtccttctattcaggccactcttcgttttccatgtactgcatgctgtttgtggcactttatcttcaagccaggatgaagggagactgggcaagactcttacgccccacactgcaatttggtcttgttgccgtatccatttatgtgggcctttctcgagtttctgattataaacaccactggagcgatgtgttgactggactcattcagggagctctggttgcaatattagttgctgtatatgtatcggatttcttcaaagaaagaacttcttttaaagaaagaaaagaggaggactctcatacaactctgcatgaaacaccaacaactgggaatcactatccgagcaatcaccagcc；
（二）构建含有PLPP1开放阅读框的克隆载体
首先，基于后续EcorI、BamHI双酶切需要，重新设计PCR克隆PLPP1序列用引物序列如下（即，在上下游各加入 20bp与线性化质粒末端匹配的同源序列）：
F: 5’-actctagagctagcgaattcatgtttgacaagacgcggct-3’，
R: 5’-atccgagcaat caccagcctggatccgcggccgctgaggg-3’；
随后，以步骤（一）所提取PLPP1开放阅读框序列为模板，利用上述所设计引物（引入同源臂），再次扩增PLPP1 序列，扩增结束后，对PCR扩增产物进行电泳检测、并切胶回收PCR扩增产物，
再后，将上述所提取的扩增产物与经EcoRI、BamHI双酶切后的线性化pCDH-EF1A-MCS-T2A-copGFP载体进行连接；
最后，将上述连接产物转化DH5α感受态细胞，并培养过夜，挑取单菌落进行测序验证， 取序列正确的菌株，扩大培养后提取质粒，或者冻存备用；
（三）构建PLPP1-MSLN CAR慢病毒质粒
首先，基于在上游引入线性化载体同源臂、下游引入PLPP1同源序列需要，以及基于从含有MSLN-CAR-P2A-GFP序列的重组质粒中扩增获得MSLN-CAR-P2A序列需要，设计PCR扩增用引物序列如下：
F: 5’-actctagagctagcgaattcatggccttaccagtg accgc-3’，
R: 5’-agccgcgtcttgtcaaacataggtccagggttctcctcca-3’；
同时，基于上游引入20bp的 MSLN-CAR-P2A同源臂，下游引入线性化载体同源臂需要，以及基于以步骤（1）中的含有PLPP1 序列的重组质粒为模板扩增PLPP1序列需要，设计PCR扩增用引物序列如下：
F: 5’-tggaggagaaccctggacctatgtttgacaagacgcggct-3’，
R: 5’-ccctcagcggccgcggatccaggctggtgattgctcggat-3’；
随后，分别利用上述引物进行PCR扩增，并对PCR扩增产物进行电泳、回收获得片段MSLN-CAR-P2A（1500bp左右）、PLPP1（850bp左右）；
所述MSLN-CAR-P2A序列（1539bp），具体如下：
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgcaggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagcggcctggggcctcagtgcaggtttcctgcagggcatctggatactccatcaacacctactatatgcaatgggtgcgacaggcccctggagcagggcttgagtggatgggagtaatcaaccctagtggtgtcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccttgaccaatgacacgtccacgaacacagtctacatgcagctgaacagcctgacatctgcagacacggccgtgtattactgtgcgagatgggcattgtggggggatttcgggatggacgtctggggcaagggaaccctggtcaccgtctcctcaggtggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttccggtggtggtggttccgacatccagatgacccagtctccttccaccctgtctgcatctattggagacagagtcaccatcacctgccgggccagtgagggtatttatcactggttggcctggtatcagcagaagccagggaaagcccctaaactcctgatctataaggcctctagtttagccagtggggccccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcaacttattactgccaacaatatagtaattatccgctcactttcggcggagggaccaagctggagatcaaaaccacaacacccgccccccggccccccacacccgcccccacaatcgccagccagcccctgagcctgaggcccgaggcctgccggcccgccgccgggggggccgtgcacacaagggggctggatttcgcctgcgatatctacatctgggcccccctggccggcacctgcggcgtgctgctgctgagcctcgtgatcacactgtactgcaagagggggcggaagaagctgctgtacatcttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcagaccacccaggaggaggacggctgttcctgtaggtttcctgaggaggaggaaggaggatgtgagttgcctagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacct；
再后，利用NovoRec一步PCR克隆试剂盒，将上述克隆所得MSLN-CAR-P2A、PLPP1序列和EcoRI、BamHI双酶切后的线性化pCDH-EF1A-MCS-T2A-copGFP进行连接，
最后，将上述连接产物转化DH5α感受态细胞，筛选、并测序，确保重组正确（此即为PLPP1-MSLN CAR慢病毒质粒），并对测序正确的菌株提取质粒或者冻存备用。
所述CAR-T载体在制备肿瘤防治药剂中的应用，将CAR-T载体转染T细胞后，用于相关肿瘤的防治，所述肿瘤为非小细胞癌、结直肠癌或食管癌相关的肿瘤。
需要解释和说明的是，本申请中，构建CAR-T载体时所涉及的PLPP1序列、MSLN-CAR-P2A序列均是基于现有技术中序列所引用的，因此，相关序列并非本申请的主要创新点，本申请的主要目的在于评估和验证及考察PLPP1对于CAR-T相关应用的改进提升效果，从而为CAR-T技术的进一步改进奠定一定基础。同时，需要解释的是，相关CAR-
T构建过程也是基于实验的便捷性、可操作性以及发明人、申请人已有的相关实验条件、相关成果等因素所进行的，并非必须按照此路线进行操作。实际应用时，可根据实际情况对相关操作步骤进行进一步的调整和优化。
本申请中，通过比对外周血中激活的T细胞和肿瘤组织中激活的T细胞的差异，以及经过发明人的仔细分析，初步认为肿瘤微环境中T细胞脂质代谢异常，而PLPP1 分子是造成这些异常的主要原因。而肿瘤微环境中PLPP1表达的缺失则可能是肿瘤微环境中复杂的免疫抑制微环境作用于T细胞后对T细胞造成的代谢改变进而影响T细胞功能和活性的关键。基于此研究，发明人选择实体肿瘤靶点的MSLN-CAR为模型，以研究PLPP1对CAR-T功能的影响，初步研究结果表明，利用PLPP1改造后，可明显增强CAR-T细胞在肿瘤微环境中的功能及增殖能力，进而可为相关疾病的防控奠定良好的技术基础，同时也为CAR-T技术在实体瘤中应用、以及其他类型肿瘤的防控提供一定借鉴和参考。
附图说明
图1为PLPP1表达缺失情况下所导致的肿瘤浸润T细胞脂代谢异常情况，其中：
A为HPLC-MS检测肿瘤患者外周血 和肿瘤微环境中CD8+CD69+T细胞部分磷脂Lipd-P和游离脂Lipid含量；
B为PLPP家族催化Lipid-P水解生成Lipid的反应示意图；
C为GEO 数据库中CD8+T细胞RNA-seq结果PLPP1，PLPP2，PLPP3表达水平；
D为利用荧光定量PCR检测肿瘤患者外周血中和肿瘤浸润的CD69+CD8+T细胞PLPP1表达；
图中，TIL为Tumor infiltrating lymphocytes （肿瘤浸润淋巴细胞），PB为Peripheral blood 外周血来源CD8+ CD69+ T细胞，CA为肿瘤组织来源CD8+ CD69+ T细胞；
图2为PLPP1在CD8+ T细胞中的表达与T细胞增殖和功能相关性分析；其中：
A为GEO数据库中肿瘤浸润T细胞中PLPP1表达和T细胞增殖相关基因表达的相关性；
B为GEO数据库中肿瘤浸润T细胞 PLPP1表达与T细胞功能分子表达的相关性分析；
图3 为肺癌患者肿瘤浸润T细胞中PLPP1 表达对T细胞功能和增殖能力的影响情况；其中：
A为根据PLPP1表达高低将肿瘤浸润的T细胞分为PLPP1高表达的PLPP1-HIGH和PLPP1低表达的PLPP1-LOW
B为PLPP1-HIGH和PLPP1-LOW的肿瘤浸润T细胞上T细胞功能相关分子IL-2、GranzymeB、Perforin表达峰形图及平均荧光强度统计结果；
C为流式分析PLPP1-HIGH和PLPP1-LOW组的肿瘤浸润T细胞上细胞增殖相关分子Ki67表达结果；
图 4为PLPP1-CAR慢病毒载体构建及CAR-T制备情况，其中：
A为MSLN-CAR及MSLN-PLPP1-CAR结构示意图；
B为慢病毒感染3天后流式检测CAR-T感染效率；
C为利用荧光定量PCR法，检测感染5天后 CAR-T细胞中PLPP1基因表达水平；
D为感染5天后western blot检测CAR-T细胞PLPP1 蛋白表达；
图5 为PLPP1修饰对CAR-T细胞上相关分子表达影响情况，其中：
A为感染3天的CAR-T经CD3/CD28 单抗活化48h后，流式检测活化相关分子CD69、41BB、PD1表达峰形图；
B为MSLN和 MSLN-PLPP1组细胞中CD69、41BB、PD1表达统计结果；
图6为PLPP1表达对CAR-T细胞因子分泌能力的影响情况；其中：
A为PMA离子霉素和BFA进行处理 6h 后流式内因子检测T细胞功能分子表达峰形图；
B为流式检测CAR-T细胞功能分子表达统计结果；
图7为PLPP1表达对CAR-T细胞增殖能力影响情况，其中：
A为增殖染料标记的CAR-T细胞活化72h后增殖情况；
B为CAR-T细胞活化48h流式检测Ki67表达；
C为1×105 CAR-T细胞活化72小时后细胞计数结果；
图8为PLPP1修饰后对MSLN-CAR-T肿瘤细胞杀伤能力影响情况；其中：
A为肺癌细胞系H322 靶抗原 mesothelin（间皮素）表达情况；
B为ANNEXINV标记凋亡细胞，流式检测不同效靶比CAR-T对肿瘤细胞杀伤能力；
C为与肿瘤细胞共孵育6h后CAR-T细胞CD107a表达情况；
D为荧光素酶活性检测与CAR-T共孵育24h后肿瘤细胞活性情况；
E为增殖染料标记的CAR-T细胞与靶细胞共孵育72小时后增殖情况；
图9为PLPP1修饰对MSLN-CAR-T在小鼠肿瘤模型中肿瘤生长抑制能力情况；其中：
A为小鼠模型构建及治疗策略示意图；
B为CAR-T细胞回输后小鼠肿瘤生长曲线；
C为第 21天处死小鼠后肿瘤大小；
D为小鼠主要脏器的病理染色；
图10为 PLPP1对肿瘤微环境中CAR-T功能和增殖能力情况；其中：
A为流式检测肿瘤浸润CAR-T细胞功能分子IL-2、Perforin、IFN-G、TNF-A表达峰形图；
B为流式检测肿瘤浸润CAR-T细胞功能分子IL-2、Perforin、IFN-G、TNF-A表达统计结果；
C为流式检测肿瘤浸润CAR-T细胞增殖相关子 Ki67 表达峰形图和统计结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。
生物材料：
肿瘤患者外周血及肿瘤组织，均来源于郑州大学第一附属医院，相关研究方案均经郑州大学第一附属医院伦理委员会批准，并获得了患者签署的知情同意书；
健康人外周血，来自于河南省红十字会血液中心；
肺癌细胞系H322 及人胚肾细胞 293T，购自于中科院上海细胞库；
感受态大肠杆菌 DH5α、感受态大肠杆菌 Tstbl3，购自北京擎科生物技术有限公司；
主要试剂：
DMEM高糖培养基、RPIM1640 培养基、PBS缓冲液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂DMSO（二甲基亚砜）、PMSF（苯甲基磺酰氟）等，均为美国Sigma公司产品；
Opti-MEM培养基、胎牛血清等，为美国 Gibco公司产品；
x-vivo15培养基，瑞士LONZA生物科技公司产品；
人外周血淋巴细胞分离液，天津灏洋华科生物技术有限公司产品；
Human CD8 microbeads、Human CD3 microbeads、MACS buffer、磁分选 LS 柱，德国美天旎公司产品；
RIPA 裂解液，上海碧云天生物技术有限公司产品；
RNAiso Plus，美国 Thermo公司产品；
反转录试剂盒、Gt-551培养基、EcoRⅠ限制性内切酶、BamHI限制性内切酶，日本宝日生物技术有限公司产品；
免疫组化试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司产品；
蛋白电泳凝胶试剂盒，北京达科为生物技术有限公司产品；
一步定向克隆试剂盒，上海近岸科技有限公司产品；
DNA凝胶回收试剂盒，美国Axygen 公司产品；
ELISA 试剂盒，杭州联科生物技术股份有限公司产品；
100x青-链霉素混合液、胰蛋白酶粉、0.25%胰蛋白酶消化液、0.05%胰蛋白酶消化液、20× TBST、50xTAE缓冲液等，均为北京索莱宝科技有限公司产品；
线性PEI转染试剂，美国Polysciences公司产品；
重组人IL-2、CD28 单抗、CD3 单抗、AnnexinV结合缓冲液、10x破膜剂、PE-anti-human CD69、APC-CY7 anti-human CD8、APC anti-human Ki67、APC-A700 anti-humanTNF-A、Percp anti-human GranzymeB 、FITC anti-human IFN-G、APC anti-human IL-2、APC-A700 anti-human Perforin等，均为美国biolegend 公司产品；
SYBER Green荧光定量预混液，澳大利亚 BCS 公司产品；
NC膜，美国GE公司产品；
PE anti-PLPP1，武汉博欧特生物科技有限公司
其余的10% FBS-DMEM高糖完全培养基、10% FBS-RPIM1640 完全培养基、T细胞培养基（GT-T511 培养基与X-vivo15 培养基 1:2 混合，加1%青链霉素混合液，使用前每 1ml加入500IU重组人IL-2）、细胞冻存液、蛋白裂解液、电泳液、转膜液、1×TBST缓冲液、Western封闭液、5% BSA溶液等，按现有技术常规配制即可；
主要仪器设备：
PCR仪、凝胶成像系统，美国 Bio-Rad 公司产品；
DxFLEX流式分析系统、Moflo-XDP高速流式分选系统，美国贝克曼库尔特公司产品；
Ivis活体成像系统，美国PerkinElmer公司产品；
Miltenyi磁分选磁场，德国美天旎公司产品。
实施例1
鉴于磷脂磷酸酶 1（PLPP1）对于细胞代谢影响的重要作用，因此，本实施例中，基于相关实验，发明人首先对肿瘤微环境中PLPP1的作用进行了初步探讨。下面就相关实验及具体实验结果简要介绍说明如下。
在介绍具体实验过程前，首先就相关通用性实验操作过程简介如下。
（1）细胞培养
H322及293T细胞系均采用含10% FBS+1%青-链霉素混合液的DMEM高糖培养基培养，培养时，细胞融合率达到90%左右时，进行细胞传代，具体而言：
在超净台中弃去培养基，再用无菌PBS清洗细胞 2 次以除去残余培养基；
对于H322细胞系，向瓶内加入 1mL的0.25%胰酶，对于293T细胞，加入1ml 的0.05%胰酶溶液，随后将细胞置于37℃的培养箱中消化（293T消化2min，H322消化 5min）；
消化完成后，取出细胞，加入 10ml 的完全培养基以中和胰酶，并用吸管吹打细胞成单细胞悬液；
再将细胞转移至50ml离心管中，1000rpm离心 3min以除去细胞碎片；
再次加入适当培养基重悬细胞至约 4×105个/ml，取 10ml细胞转接至T75 细胞培养瓶中以继续培养。
（2）肿瘤组织单细胞悬液的制备
将所收取的肿瘤组织（事先置于组织保存液中冰上保存）剪成小块后，用2.7ml无血清 的1640培养基进行重悬，随后加入300μl 的10×组织消化三酶混合液；
随后，用组织解离仪解离后，置于微型摇床上，37℃消化30min，可重复操作以确保解离和消化充分；
最后一次消化结束后，加入5ml 的RPMI 1640 完全培养基以中和三酶，再用 70μm滤网过滤两次以除去组织碎片，最后，500g离心 5min后，用PBS清洗细胞两遍，并最终根据需要重悬后即为肿瘤组织单细胞悬液。
（3）外周血单个核细胞分离
取外周血10ml，500g、22℃离心 5min，吸去血浆后（或者-80℃保存备用），用 1 倍体积的PBS稀释备用；
取一50ml离心管，加入 20ml淋巴细胞分离液，吹匀上述稀释后外周血并轻轻加入到淋巴细胞分离液上层；
22℃、1100g离心 25min，离心完成后小心的吸取淋巴细胞层，再加入（与所吸取淋巴细胞层）相同体积的PBS，1800rpm离心 5min以清洗细胞；再次弃去上清，并再加入5ml 的PBS清洗细胞一次，离心弃去PBS，所得沉淀即为外周血单个核细胞。
（4）活化CD8+ T细胞分选
将外周血单个核细胞（或肿瘤组织单细胞悬液），500g离心 5min，随后用 3ml 的MACs（Magnetically activated cell sorting）缓冲液重悬细胞，500g离心 5min；再次用3ml的MACs缓冲液重选细胞并计数；
每 1×107 细胞加入 10μl的人CD8 磁珠和40μl的MACs缓冲液，涡旋混匀，4℃避光孵育 15min，期间每隔 3min混匀一次；
最后一次混匀后，将MS磁分选柱置于相应的磁场中，加入 1ml的MACs缓冲液润洗柱子；前述孵育操作结束后，将细胞全部加入磁分选柱中，待细胞完全通过柱子后，加入1ml 的MACs缓冲液洗以去除未结合的细胞，重复两次；
待液体完全通过柱子后，加入 3ml 的MACs缓冲液，并将柱子从磁场中取出，再用活塞迅速将细胞打入无菌离心管中；细胞计数后，500g离心 5min并弃去液体，用流式缓冲液清洗细胞 2 次；
用100μl流式缓冲液重悬细胞并加入 10μl的PE-anti-human CD69 流式抗体，4℃避光孵育 30min；
再用1ml的流式缓冲液洗细胞，4℃、500g离心5min（可重复操作两次）；最后用Moflo-XDP流式细胞分选仪分选阳性细胞并记录细胞数量。
（5）实时荧光定量PCR
荧光定量PCR时，20μl反应体系设计如下：
cDNA模板，0.2μl；
上游引物，0.5μl（10μM）；
下游引物，0.5μl（10μM）；
2 x PCR mix（2x SYBER green PCR mix），10μl；
ddH2O，8.8μl；
PCR程序：95℃、3min；95℃、10s，60℃、30s，40个循环；溶解曲线 65℃~95℃， 0.5℃/5s；以b-actin 为内参。
运行结束后，以 2-∆∆CT值代表不同样本中目标基因相对对照组的相对基因表达量。
（6）脂质组学的全定量检测
取流式分选的后的T细胞，并进行精确计数；随后取 1×106 细胞，离心弃去上清，并用 100μl预冷的PBS重悬细胞；
向细胞悬液中迅速加入500μl预冷的抗淬灭剂，并轻微震荡，4℃、500g离心 5min，弃去上清，沉淀（-80℃保存）由上海百趣生物公司进行HPLC-MS脂质组学全定量检测。
已有研究表明，肿瘤微环境中浸润的T细胞具有肿瘤识别能力，但同时肿瘤微环境存在大量免疫抑制细胞的免疫抑制分子及免疫抑制性代谢物，这些物质均会导致T细胞功能异常（T细胞耗竭）。另一方面，T细胞脂代谢状态对于细胞功能的正常发挥起着至关重要的作用。因此，肿瘤浸润T细胞功能耗竭机制研究、以及从T细胞脂代谢的角度研究肿瘤微环境中T细胞的异常变化，进而可为探索靶向T细胞脂代谢的细胞基因修饰策略奠定一定技术基础。
基于上述考虑，发明人对肿瘤浸润条件下的T细胞脂代谢情况进行了初步研究，具体情况简介如下。
首先，分选肿瘤组织和外周血中CD69+CD8+ T细胞，随后，对其进行全脂质组HPLC-MS检测，以对比分析考察肿瘤浸润条件下的T细胞脂代谢变化情况（相关操作参考前述通用实验操作即可，不再赘述）。具体实验结果简介如下。
相关代谢数据检测结果表明：
肿瘤微环境中的CD8+T细胞中磷脂酸（PA）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰乙醇胺（PE）磷脂酰丝氨酸（PS）、己糖神经酰胺（HEXCER）异常积累，而二脂酰甘油（DG）、鞘氨醇（SPH）、神经酰胺（CER）含量降低（依据百趣生物公司对相关组分的测定结果，汇总绘制图1A）；
进一步对脂代谢通路的分析（图1B），可以发现：PLPPs作为一类多功能的磷酸磷脂酶，能够催化PA、S1P、Cer1P等分子的去磷酸化，因此，PLPP1、PLPP2、PLPP3 的变化可能是导致相关代谢异常的原因；
在上述分析基础上，进一步地，对GEO（Gene Expression Omnibus）数据库中肺癌患者CD8+ T细胞中的PLPP1、PLPP2和PLPP3的表达水平进行分析（如图1C所示），可以发现，仅PLPP1在T细胞中有较高的表达，也由此可以初步推测判定PLPP1是导致相关脂代谢异常的主要原因；
为进一步验证PLPP1 在T细胞中表达的意义，基于GEO数据库中所收集的36例肿瘤浸润T细胞的RNAseq数据，通过分析T细胞增殖相关基因和 T细胞功能相关分子与PLPP1 表达的相关性，结果显示，PLPP1 与T细胞增殖（图2 A）和功能分子（图2 B）表达呈显著正相关；这也初步表明：PLPP1在肿瘤微环境中表达缺失导致T细胞代谢异常，进而影响了T细胞的增殖能力与肿瘤杀伤功能。
在上述推测结果基础上，利用荧光定量PCR技术，发明人进一步对肿瘤患者外周血和肿瘤浸润条件下的 CD69+CD8+T细胞中PLPP1表达情况进行了检测（图1D），结果显示：肿瘤浸润中的 CD8+T细胞的PLPP1 表达明显降低，这一结果初步证实了PLPP1 的表达缺失导致了肿瘤浸润情况下的CD8+T细胞脂代谢异常，进而基于此结果可为相关治疗策略提供一定参考和指导。
上述结果基础上，为进一步明确PLPP1的高表达是否对肿瘤浸润中T细胞增殖能力和肿瘤杀伤能力具有进一步的增强作用，发明人根据PLPP1表达水平将肿瘤浸润的CD8+体细胞分为PLPP1-HIGH和PLPP1-LOW（图3A）。使用流式细胞术分析PLPP1-HIGH和PLPP1-LOW细胞T细胞功能分子IL-2、GrzymeB、Perforin（图 3.B）和细胞中增殖标记分子Ki67 表达情况（图3C）。结果显示PLPP1- HIGH 组的CD8+T细胞增殖与功能分子表达明显高于PLPP1-LOW组的CD8+ T细胞。基于此结果，可以初步明确PLPP1的高表达对肿瘤浸润中T细胞增殖能力和肿瘤杀伤能力具有进一步增强作用。
实施例2
基于实施例1初步结果，结合CAR-T技术，发明人进一步构建了相关重组质粒，并利用慢病毒转染技术进行了相关实验。具体实验过程简介如下。
（一）获取人PLPP1开放阅读框克隆序列
首先，提取健康人外周血单个核细胞的 RNA，并进行反转录以制备cDNA模板；
随后，基于已知的PLPP1 开放阅读框序列，设计PCR克隆用引物序列如下：
PLPP1-F: 5’-atgtttgacaagacgcggct-3’，
PLPP1-R: 5’-aggctggtgattgctcggat-3’；
最后，以上述所制备cDNA为PCR扩增用模板，并利用上述所设计引物进行PCR扩增，PCR扩增时，50μl扩增体系设计如下：
cDNA模板，2 μl；
PLPP1-F引物，2μl（10uM）；
PLPP1-R引物，2μl（10uM）；
primer star mix，25μl；
去离子水，19μl；
PCR仪中，反应程序如下：
95℃、5min；95℃、15s，58℃、15s，72℃、1min，35个循环；72℃、5min。
PCR结束后，对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，并回收850bp左右条带产物，所得即为PLPP1 开放阅读框序列。
所述PLPP1 开放阅读框序列（854bp），具体如下：
Atgtttgacaagacgcggctgccgtacgtggccctcgatgtgctctgcgtgttgctggcttccatgcctatggctgttctaaaattgggccaaatatatccatttcagagaggctttttctgtaaagacaacagcatcaactatccgtaccatgacagtaccgtcacatccactgtcctcatcctagtgggggttggcttgcccatttcctctattattcttggagaaaccctgtctgtttactgtaaccttttgcactcaaattcctttatcaggaataactacatagccactatttacaaagccattggaacctttttatttggtgcagctgctagtcagtccctgactgacattgccaagtattcaataggcagactgcggcctcacttcttggatgtttgtgatccagattggtcaaaaatcaactgcagcgatggttacattgaatactacatatgtcgagggaatgcagaaagagttaaggaaggcaggttgtccttctattcaggccactcttcgttttccatgtactgcatgctgtttgtggcactttatcttcaagccaggatgaagggagactgggcaagactcttacgccccacactgcaatttggtcttgttgccgtatccatttatgtgggcctttctcgagtttctgattataaacaccactggagcgatgtgttgactggactcattcagggagctctggttgcaatattagttgctgtatatgtatcggatttcttcaaagaaagaacttcttttaaagaaagaaaagaggaggactctcatacaactctgcatgaaacaccaacaactgggaatcactatccgagcaatcaccagcct。
相关操作现有生物医学常规操作即可，或者可参考如下操作说明。
（1）RNA提取
取不少于1×105 个细胞，4℃、500g离心 5min，弃去上清后，加入1ml trizol、500μl氯仿，上下颠倒混匀 30s，室温静置 10min；
静置结束后，4℃、12000rpm离心 15min，离心结束后小心吸取上层有机相，加入到含500μl的异丙醇管中，上下颠倒混匀30s，室温静置10min；
4℃、12000rpm离心 10min，弃去上清；
加入 1ml预冷的 75%乙醇清洗RNA，4℃、12000rpm离心 2min，重复该步骤一次；
尽量吸去液体，并室温晾干 20min左右，加入15μl的DEPC水以溶解RNA，并利用nanodrop2000 检测RNA浓度以确保满足使用需要，随后直接进行反转录或者-80℃保存备用。
（2）反转录
取1000ng RNA加入到EP管中，加DEPC水补至7μl，加入1μl gDNA Eraser和2μlgDNA Eraser 缓冲液，涡旋混匀后瞬时离心，室温孵育 5min以消化基因组DNA；
再加1μl RT Primer MIX、1μl Prime Script RT Enzyme Mix I 和 4μl DEPC水，混匀后，置于PCR仪中，按照：“37℃、15min，85℃、5s，4℃保存”程序运行，反应结束后，反转录产物直接诶应用或者保存于-20℃。
（3）电泳
取 300ml锥形瓶，加入 50ml TAE 缓冲液、0.5g琼脂糖，加热至琼脂糖完全溶解，再加入 2μl GOD View II核酸染料，待降温至60℃左右将凝胶 倒入模具中，室温冷却凝固约30min；
PCR完成后，每 50μl产物加入 5μl 的10×DNA上样缓冲液，混匀后加入到泳道中，120v恒压电泳50min；
电泳结束后于凝胶成像仪中曝光，并在蓝光照胶仪上用手术刀片切取 850bp左右条带以进行回收。
（4）DNA凝胶回收
对所切取目的凝胶条带称重后，加入 3 倍凝胶体积的凝胶溶解缓冲液A，于 75℃水浴锅中溶解凝胶 6-8min，待凝胶完全溶解后，加入相当于 1.5 倍凝胶体积的试剂B，混匀后将溶液全部加入到凝胶回收柱中；
12000rpm离心1min，弃去滤过液体，再用 500μl WA+700μl WB+700μl WB洗柱子；
12000rpm空转离心 2min，除去剩余液体；再向回收柱中加入30μl去离子水，室温静置 2min；
12000rpm离心1min，滤出液体即为DNA溶液，用nanodrop2000 检测回收的DNA浓度，确保满足使用要求。
（二）构建重组载体
pCDH-EF1A-MCS-T2A-copGFP（BioFeng产品）质粒属于一种慢病毒载体，其利用人EF1A（人延长因子 1a）为启动子，在真核细胞中表达水平中等，细胞毒性低，其中的T2A序列编码T2A肽段，能够介导翻译出肽链的自剪切，避免表达的目的蛋白和标签蛋白的融合表达。本申请中以该质粒为基础来构建重组载体。具体过程简介如下。
（1）构建PLPP1 开放阅读框的克隆载体
首先，基于后续EcorI、BamHI双酶切需要，重新设计PCR克隆PLPP1序列用引物序列如下（即，在上下游各加入 20bp与线性化质粒pCDH-EF1A-MCS-T2A-copGFP末端匹配的同源序列）：
F: 5’-actctagagctagcgaattcatgtttgacaagacgcggct-3’，
R: 5’-atccgagcaat caccagcctggatccgcggccgctgaggg-3’；
随后，以前述所提取PLPP1开放阅读框序列为模板，利用上述所设计引物（引入同源臂），再次扩增PLPP1 序列，扩增体系参考前述操作，PCR程序如下：
95℃、5min；95℃、15s，62℃、15s，72℃、1min，35个循环；68℃、5min；
再后，PCR结束后进行琼脂糖凝胶电泳，纯化850bp左右条带，并用nanodrop2000检测DNA浓度，确保满足使用需要；
再后，将上述所提取的扩增产物与EcoRI、BamHI双酶切后的线性化pCDH-EF1A-MCS-T2A-copGFP质粒载体进行连接，20μl连接体系设计如下：
PLPP1（PCR产物），50ng；
线性化质粒载体，50ng；
5×反应缓冲液，4μl；
NovoRec，2μl；
加水补至20μl；
混匀后，50℃孵育15min；
最后，将上述连接产物转化DH5α感受态细胞，并培养过夜，挑取单菌落进行测序验证， 取序列正确的菌株，扩大培养后提取质粒，或者冻存备用。
（2）构建PLPP1-MSLN CAR慢病毒质粒
首先，基于在上游引入线性化载体同源臂、下游引入PLPP1同源序列需要，以及基于从MSLN-CAR-P2A-GFP质粒（本申请以pCDH-EF1A-MCS-T2A-copGFP质粒为基础，常规构建即可，当然，也可采用其他质粒进行构建）中扩增MSLN-CAR-P2A序列需要，设计PCR扩增用引物序列如下：
F: 5’-actctagagctagcgaattcatggccttaccagtg accgc-3’，
R: 5’-agccgcgtcttgtcaaacataggtccagggttctcctcca-3’；
同时，基于上游引入20bp的 MSLN-CAR-P2A同源臂，下游引入线性化载体同源臂需要，以及基于以步骤（1）中的含有PLPP1 序列的重组质粒为模板扩增PLPP1序列需要，设计PCR扩增用引物序列如下：
F: 5’-tggaggagaaccctggacctatgtttgacaagacgcggct-3’，
R: 5’-ccctcagcggccgcggatccaggctggtgattgctc ggat-3’；
随后，分别利用上述引物进行PCR扩增，并对PCR扩增产物进行电泳、回收获得片段MSLN-CAR- P2A（1500bp左右）、PLPP1（850bp左右）；
所述MSLN-CAR-P2A序列（1539bp），具体如下：
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgcaggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagcggcctggggcctcagtgcaggtttcctgcagggcatctggatactccatcaacacctactatatgcaatgggtgcgacaggcccctggagcagggcttgagtggatgggagtaatcaaccctagtggtgtcacaagctacgcacagaagttccagggcagagtcaccttgaccaatgacacgtccacgaacacagtctacatgcagctgaacagcctgacatctgcagacacggccgtgtattactgtgcgagatgggcattgtggggggatttcgggatggacgtctggggcaagggaaccctggtcaccgtctcctcaggtggtggtggttctggtggtggtggttctggtggtggtggttccggtggtggtggttccgacatccagatgacccagtctccttccaccctgtctgcatctattggagacagagtcaccatcacctgccgggccagtgagggtatttatcactggttggcctggtatcagcagaagccagggaaagcccctaaactcctgatctataaggcctctagtttagccagtggggccccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcaacttattactgccaacaatatagtaattatccgctcactttcggcggagggaccaagctggagatcaaaaccacaacacccgccccccggccccccacacccgcccccacaatcgccagccagcccctgagcctgaggcccgaggcctgccggcccgccgccgggggggccgtgcacacaagggggctggatttcgcctgcgatatctacatctgggcccccctggccggcacctgcggcgtgctgctgctgagcctcgtgatcacactgtactgcaagagggggcggaagaagctgctgtacatcttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcagaccacccaggaggaggacggctgttcctgtaggtttcctgaggaggaggaaggaggatgtgagttgcctagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgcggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacct。
再后，利用NovoRec一步PCR克隆试剂盒，将克隆所得MSLN（MSLN-CAR- P2A）、PLPP1和EcoRI、BamHI双酶切后的线性化pCDH-EF1A-MCS-T2A-copGFP质粒载体进行连接，20μl连接体系如下：
线性化载体，50ng；
MSLN片段，100ng；
PLPP1，100ng；
5×反应缓冲液，4μl；
NovoRec，2μl；
加水补至 20μl；
50℃孵育15min。
最后，将上述连接产物转化DH5α感受态细胞，涂板培养过夜后，挑取阳性单菌落转接与含200μg/ml氨苄的LB培养基中摇菌过夜，取1ml菌液样品进行质粒测序，确保重组正确（此即为PLPP1-MSLN CAR慢病毒质粒），并对测序正确的菌株提取质粒或者冻存备用。
上述过程中，质粒转化、质粒提取等参考现有技术常规操作即可，或者可具体参考如下。
质粒转化时：将感受态细胞 100μl冰上溶解后，将连接体系（或者质粒10ng）加入感受态细胞中，轻弹 2-3 次混匀，于冰上孵育 30min；42℃热激45s，再冰上放置2min；加入400μl无抗生素的LB培养基，37℃、200rpm摇菌30min；取100μl菌液涂于含200μg/ml氨苄的LB平板中，37℃培养过夜；进一步挑取阳性单菌落扩大培养。
质粒提取时，采用天根质粒小提中量试剂盒提取，具体参考时，参考其说明书，或者参考如下：
取待提取菌液15ml，3000rpm离心10min，弃去培养基，用盐水重悬菌液并转移至2ml离心管中，12000rmp离心3min，弃去上清；
加入500μl试剂P1，涡旋振荡至菌体充分悬浮，混匀，随后加入500μl菌体裂解液P2。轻柔的上下颠倒混匀 8 次，再加入试剂P4 500μl，立即混匀；
室温静置10min后，12000rmp离心 10min；吸取上清液加入到去除内毒素过滤柱中，离心；加入滤过液体0.3 倍体积的异丙醇，混匀后，将液体加入到质粒结合柱中（事先在质粒结合柱中加入500μl平衡缓冲液，12000rmp离心 1min以激活柱子），12000rpm离心1min；
用 500μl蛋白去除液PD清洗柱子 1 次，PW清洗柱子 2 次，12000rpm离心 2min以除去剩残余液体；
将质粒结合柱置于新的 1.5ml离心管中，加入 200μl无菌去离子水至DNA结合柱中央室温静置 2min；
12000rpm离心1min洗脱质粒，并检测质粒浓度。
（三）制备CAR-T细胞
首先，进行慢病毒包装，慢病毒时：
将生长状态良好的 293T细胞铺板于10cm细胞培养皿中，每皿 6×106，培养贴壁过夜；
在1.5ml离心管中，加入：250μl Opti-MEM培养基，5ug主质粒（即步骤（二）最后所制备质粒），3ug包装质粒PsPAX2，1.5ug包装质粒pMD2.G，涡旋混匀；随后加入250μl Opti-MEM和20μl线性PEI 4000 转染试剂（事先混匀），轻吹混匀后，室温静置 20min；
将上述转染体系滴加到前述293T细胞中，继续培养6h；
更换新鲜的含10% FBS的DMEM培养基，继续培养 48h；
16℃、3000rpm离心10min以去除细胞碎片，收取上清液，即为包装后慢病毒。
随后，利用上述慢病毒进行T细胞感染，以制备CAR-T细胞，具体操作而言：
取健康人外周血来源的CD3+T细胞，用T细胞培养基重悬至 3×106/ml；
加入 CD3 单抗 5ug/ml，CD28 单抗 2ug/ml，混匀后铺板至 12 孔细胞培养板中，每孔 2ml；
48h后收取T细胞，1500rpm离心 5min，弃去上清；用新鲜的 1640 培养基重悬细胞并计数；
将所取细胞500g离心 5min，重悬调节至 1×106/ml，铺到 12 孔板中，每孔 1ml；
加入 2ml病毒上清（前述病毒包装后所制备上清液）和 3μl 10mg/ml的polybrene助感染试剂；将 12孔板置于水平转子离心机中，32℃、1000g离心 2h；
离心结束后，小心的弃去培养基并加入 1ml新鲜T细胞培养基，重复此步骤一次；
将细胞放置于培养箱中继续培养，72h后流式细胞仪检测GFP阳性率以确定CAR的转染效率。
实验例1
利用上述所制备CAR-T细胞，发明人进一步进行了体外杀伤实验，具体实验情况简介如下。
取H322肿瘤细胞（人非小细胞肺癌细胞）或者过表达荧光素酶的H322 细胞（常规构建即可，主要用于直观观察）分别消化计数，取适量细胞，用RPMI1640 培养基分别调整细胞浓度至 3×105/ml；
取前述所制备CAR-T细胞，计数，并用RPMI1640 分别调整至 3×105、1.5×106、3×106/ml；每孔加入100μl与H322细胞混合。
将细胞置于培养箱中共孵育 6h；孵育完成取出 96 孔板置于冰上，收取悬浮细胞到 1.5ml 离心管中，并用预冷的PBS清洗贴壁细胞，上清收集至相应的离心管中；
加入50μl 0.25%的胰蛋白酶，37℃消化 5min，消化结束后收集消化后的细胞至对应的 离心管中，每孔加入100μl的1640完全培养基清洗残余细胞，并收集至对应离心管中；
4℃、700g离心 5min，弃去上清；每管加入 100μl的AnnexinV结合缓冲液重悬细胞；
4℃、700g离心 5min，弃去上清，每管加入100μl 的AnnexinV 结合缓冲液、2μl 的APC-AnnexinV和 2μl的7AAD ，4℃避光孵育 30min；孵育完成后，立即进行流式检测。
CAR-T细胞脱颗粒检测时，收取孵育 6h的效靶比 为 5：1 的悬浮细胞，用流式缓冲液清洗细胞 2 次，染后用 100μl流式缓冲液重悬细胞并加入 2μl PE anti-humanCD107a；4℃避光孵育30min后，用流式缓冲液清洗细胞 2 次，再上机检测。
luciferase分析时，设置CAR-T:表达荧光素酶的H322效靶比为 1：1 ，共孵育24h，用 Ivis成像系统检测肿瘤细胞活性。
实验例2
体外杀伤实验同时，利用严重免疫缺陷的NOD-SCI型小鼠（该型小鼠可直接接种人源的肿瘤细胞系并成瘤），采用上述CAR-T细胞，发明人进行了活体动物实验，具体实验过程简介如下。
在第 0 天给 5-6 周龄（约25g）的NOD-SCID小鼠皮下接种 1×106 人肺癌细胞系H322，7天后，尾静脉回输 5×106 CAR-T细胞进行治疗，此后每隔 3 天测量肿瘤大小。
上述实验过程中，相关实验操作参考现有技术或者可具体参考如下操作。
（1）蛋白免疫印迹分析
免疫印迹分析时，先提取细胞总蛋白，随后进行SDS-PAGE凝胶电泳、湿法转膜、免疫学检测，相关操作参考如下。
细胞总蛋白提取：取培养5天后的CAR-T细胞 2×106，500g离心 5min，弃去上清；用预冷的PBS清洗细胞2次，第二次清洗后完全弃去残余的PBS，每个样本加入 50μl蛋白 裂解液；涡旋震荡 30s后将样本-80℃速冻5min，再冰上溶解，重复 3 次；
4℃、12000g离心15min以除去杂质，吸取40μl上清到新的1.5ml离心管中；
用BCA法检测蛋白浓度，并用蛋白裂解液调整使各样本浓度一致；
最后，加入1/4蛋白体积的蛋白上样缓冲液并混匀，95℃变性蛋白15min。
凝胶电泳：使用快速凝胶制备试剂盒，参考其说明书，制备10%聚丙烯酰胺凝胶；
将蛋白样品于开水浴中孵育变性3min；
加入 15μl蛋白样品（或者 5μl 蛋白标准分子量marker）；设置电泳仪，80V恒压电泳 2.5h。
湿法转膜：剪取NC膜，于转膜缓冲液中湿润 5min；在转膜液中按照：负极-海绵-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-海绵-正极的顺序放置，调整电泳仪，200mA恒流转膜 2h。
免疫学检测：转膜结束后，用TBST洗膜 3 次，每次5min；用5% BSA室温60rpm摇晃封闭2h；
弃去封闭液，小心的加入 5% BSA稀释的一抗，4℃，50rpm孵育过夜；
恢复室温1h后，回收一抗；
用TBST洗膜3遍，每次 5min；完全弃去TBST，小心的加入 5% BSA稀释的二抗，室温孵育1h；弃去二抗，用TBST洗膜3遍；
配制ECL发光液，均匀的滴加到NC膜上，置于凝胶成像系统中采集图像。
（2）流式内因子染色
待测样本用流式缓冲液清洗细胞两遍，清洗完成后尽量弃去上清，每个样本加入100μl流式缓冲液重悬细胞；
每个样本加入2μl APC-CY7 anti-human CD8，涡旋混匀后于4℃避光孵育 30min；
孵育结束后，用1ml流式缓冲液清洗细胞2次，清洗完成后，每个样本加入 200μl组织细胞固定液，涡旋混匀后于4℃孵育 30min；
孵育结束后，4℃、1000g离心 5min，弃去上清，用 400μl 的perm 缓冲液清洗细胞两遍；清洗完成后，尽量弃去上清并用200μl perm缓冲液重悬细胞；
每个样本加入2μl的PE anti-PLPP1, APC anti-human Ki67, APC-A700 anti-human TNF-A,PERCP anti-human Granzyme B, FITC anti-human IFN-γ，涡旋混匀后 4℃孵育30min；
孵育完成后，用 500μl流式缓冲液清洗细胞 2 次，用贝克曼分析流式检测。
（3）肿瘤组织石蜡包埋、病理染色
石蜡包埋时：取固定的组织约3mm厚，把组织块放入包埋模具中，用 70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇各浸泡1h，再用 95%乙醇、无水乙醇各浸泡两次，每次一小时；然后用乙醇二甲苯浸泡 40min，二甲苯浸泡 25min，再用新的二甲苯浸泡15min；
在65℃下浸泡石蜡1小时，重复 3 次；
将组织切面朝向下进行包埋，待蜡块完全冷却后，从模具中取出蜡块进行修整；
将蜡块置于冷冻台预冷 30min后，用切片机切片厚度 4μm；用毛笔将切下的石蜡片转移到水中使其铺展，石蜡片展平后用黏附载玻片从一侧小心的黏附石蜡片。
病理染色时，将粘附石蜡切片的载玻片放到烤片机上烤干水分，然后65℃烤片1小时；
取出切片用二甲苯浸泡 10min，重复两次；用含50%二甲苯的乙醇浸泡2min，100%乙醇浸泡5min，重复一次；80%乙醇浸泡 5min，水冲洗 5min；
将切片转移到苏木素染液中浸泡染色 5min，自来水冲洗 5min；
盐酸乙醇分化液浸泡分化1s，氨水返蓝液浸泡返蓝10s，自来水冲洗30s；伊红染液浸泡染色3min，自来水冲洗 30s；
80%乙醇分化（光镜下观察），95%乙醇浸泡 1min，重复两次；100%乙醇（浸泡 3min重复两次；二甲苯浸泡3min，重复两次；小心的在组织部位滴加中性树脂封片剂，用盖玻片从一侧小心的盖住组织封片，光镜下观察并拍照。
下面就PLPP1-CAR慢病毒载体构建、CAR-T细胞，以及PLPP1表达对CAR-T细胞的影响的相关实验结果简要介绍如下。
（一）PLPP1-CAR慢病毒载体构建以及CAR-T细胞制备情况
为探究PLPP1表达对CAR-T功能及增殖能力的影响，本申请中，将PLPP1编码序列插入到MSLN-CAR慢病毒质粒中，并用自剪切肽P2A与CAR隔开(示意图如4A)。
分别将MSLN-CAR和MSLN-PLPP1-CAR转染 293T后，以LPA分解速率检测PLPP1 酶活，结果证明MSLN-PLPP1-CAR具有更强的PLPP1 酶活性。
在将慢病毒包装后的MSLN-CAR和MSLN-PLPP1-CAR分别感染健康人来源的CD3+T细胞后，收取培养 3 天后的CAR-T细胞用流式检测其感染效率，结果表明：MSLN-CAR和MSLN-PLPP1-CAR感染效率均在35-40%（图4B），感染效率无明显差异。
另外取培养 5 天的CAR-T细胞，提取RNA并用实时荧光定量qPCR检测 PLPP1 表达水平，结果表明，与MSLN-CAR-T组相比，MSLN-PLPP1-CAR-T组中PLPP1表达明显升高（图4C）。
另取感染5天的CAR-T细胞，提取蛋白，采用western blot分析PLPP1表达，结果表明，PLPP1 在MSLN-PLPP1-CAR-T中表达显著增加（图4D）。
（二）PLPP1 表达对CAR-T细胞体外活化的影响
CAR-T细胞在体外活化过程中会上调多种表面分子的表达,如：CD69、41-BB、PD-1等。CAR-T在体外活化时表面活化相关分子的表达能反应CAR-T功能。取感染 3 天的CAR-T用CD3/CD28 单抗对CAR-T进行活化，48h后检测T细胞活化相关分子的表达水平，结果如图5所示，可以看出，MSLN-PLPP1-CAR-T组相关分子表达显著高于MSLN-CAR-T，这表明，PLPP1能够显著促进CAR-T细胞的活化。
（三）PLPP1 表达对CAR-T功能分子表达能力的影响
同T细胞一样，CAR-T细胞通过释放IFN-G、TNFA、IL-2、Perforin、GranzymeB 等功能分子杀伤靶细胞。因此，CAR-T细胞功能分子分泌能力是CAR-T细胞功能的体现。同时，由于PMA和离子霉素能够迅速激活CAR-T细胞细胞因子表达分泌能力，而BFA 能够阻断细胞因子向胞外转运。因此，相关实验中，取CD3/CD28单抗活化48h后的CAR-T细胞，用PMA离子霉素和BFA处理6h后，再用流式内因子染色检测CAR-T细胞IFN-G、 GranzymeB和Perforin的表达。
结果如图6A、图6B，可以看出，MSLN-PLPP1-CAR-T细胞功能分子分泌能力明显提高，这表明PLPP1的表达显著增强了MSLN-CAR-T功能分子分泌能力。
（四）PLPP1 表达对CAR-T细胞增殖能力影响
CAR-T细胞的增殖能力是CAR-T细胞发挥肿瘤杀伤能力的前提。为探究 PLPP1 对CAR-T细胞增殖能力的影响，我们将CAR-T细胞用增殖染料染色，用 CD3/CD28 单抗活化72h后，流式检测CAR-T细胞增殖情况。
结果如图7A所示，同时对细胞进行计数（图 7C所示）；另取活化48h的CAR-T细胞，流式检测Ki67表达（图7B）。从这些结果可以看出，MSLN-PLPP1-CAR-T增殖能力显著强于MSLN-CART。
（五）PLPP1修饰对CAR-T细胞体外杀伤能力的影响
已有研究表明，MSLN-CAR-T靶抗原间皮素（即，间皮素是MSLN-CAR-T的靶抗原）在很多实体瘤中都高表达，另外，统计研究表明，60%以上的肺腺癌患者都能检测到间皮素的异常高表达。为检测MSLN-CAR-T的肿瘤杀伤能力，我们使用肺癌细胞系H322 作为靶细胞，流式检测H322细胞系MSLN-CAR靶蛋白间皮素表达强阳性（图8A）。
用不同效靶比将CAR-T细胞与H322细胞共孵育6h后，流式检测肿瘤细胞的凋亡情况。 结果表明：MSLN-PLPP1-CAR-T肿瘤杀伤能力显著高于MSLN-CAR-T（图8B）。
另一方面，检测效靶比为5：1时CAR-T细胞脱颗粒分子CD107a表达水平，结果表明：MSLN-PLPP1-CAR-T组脱颗粒水平明显强于MSLN-CAR-T（图8C）。
将CAR-T细胞与表达荧光素酶的 H322细胞系以效靶比5：1 共孵育 24h，加入荧光素用Ivis成像系统检测，荧光强度反应H322细胞活性（图8D）。
将增殖染料标记的CAR-T细胞与H322细胞系以效靶比1：1共孵育72小时，结果表明：MSLN-PLPP1-CAR-T增殖明显高于MSLN-CAR-T（图8E）。
（六）PLPP1修饰后对肿瘤生长能力的影响
小鼠肿瘤模型的制备过程如图9A所示，肿瘤大小情况如图9B所示，可以看出，与MSLN-CAR-T相比，PLPP1修饰的CAR-T能显著延缓肿瘤生长。
第21天处死小鼠后，取出肿瘤，可以看出，MSLN-PLPP1-CAR-T治疗组肿瘤体积明显小于 MSLN-CAR-T治疗组（图9C）。
不同于传统药物，CAR-T是活的细胞，在体内具有极强的增殖能力，同时存在脱靶效应进而可能引起系统免疫激活的风险，基于此原因，为检测 PLPP1的修饰是否会导致系统性免疫激活或产生脱靶效应所引起组织损伤，利用HE染色检测了小鼠重要脏器（图9D）。分析可以看出，PLPP1的修饰不存在脱靶效应，也不会引起系统免疫激活。
（七）PLPP1修饰对肿瘤微环境中CAR-T功能增殖能力的影响
为进一步验证PLPP1修饰对CAR-T细胞抗肿瘤能力的影响，处死小鼠后，取部分小鼠肿瘤组织并提取其肿瘤浸润的淋巴细胞，使用流式细胞术对CAR-T的增殖能力和功能进行分析。
对T细胞功能相关内因子进行染色，分析发现：肿瘤微环境中的MSLN-PLPP1-CAR-T仍然具有较高的功能分子表达（图10A、图10B）；对肿瘤浸润的CAR-T细胞进行增殖标记，分子染色发现，MSLN-PLPP1-CAR-T增殖标记的表达也显著高于MSLN-CAR-T。
相关研究过程中，发明人在对结直肠癌和食管癌肿瘤浸润的 CD69+CD8+T细胞研究时，发现其同样存在PLPP1表达的缺失，因此可以初步认为，PLPP1表达缺失导致T细胞脂代谢异常是实体瘤肿瘤微环境抑制T细胞的普遍机制之一，也即，肿瘤微环境是CAR-T细胞杀伤实体肿瘤首先需要克服的技术障碍。
而结合上述实施例1、实施例2结果，可以看出：肿瘤微环境中PLPP1表达的缺失，是造成T细胞脂代谢异常、进而导致T细胞杀伤功能和增殖功能下降的主要因素之一。基于此，发明人利用PLPP1修饰CAR-T，并将PLPP1表达限制于T细胞内，从而在增强CAR-T抗肿瘤能力的同时减少对非肿瘤组织的影响。相关实验表明，稳定表达PLPP1的MSLN-CAR-T能够增T强细胞的体外活化水平，同时在体外杀伤和小鼠实体瘤模型肿瘤浸润研究中，能更好的抑制肿瘤生长。基于此结果，可为相关肿瘤防治提供一种新的防治借鉴策略。
SEQUENCE LISTING
<110> 郑州大学
<120> PLPP1在利用CAR-T技术防治实体瘤中的应用
<130> none
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1539
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 1
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgcaggtgc agctggtgca gtctggggct gaggtgaagc ggcctggggc ctcagtgcag 120
gtttcctgca gggcatctgg atactccatc aacacctact atatgcaatg ggtgcgacag 180
gcccctggag cagggcttga gtggatggga gtaatcaacc ctagtggtgt cacaagctac 240
gcacagaagt tccagggcag agtcaccttg accaatgaca cgtccacgaa cacagtctac 300
atgcagctga acagcctgac atctgcagac acggccgtgt attactgtgc gagatgggca 360
ttgtgggggg atttcgggat ggacgtctgg ggcaagggaa ccctggtcac cgtctcctca 420
ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct ggtggtggtg gttccggtgg tggtggttcc 480
gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctattggaga cagagtcacc 540
atcacctgcc gggccagtga gggtatttat cactggttgg cctggtatca gcagaagcca 600
gggaaagccc ctaaactcct gatctataag gcctctagtt tagccagtgg ggccccatca 660
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 720
gatgattttg caacttatta ctgccaacaa tatagtaatt atccgctcac tttcggcgga 780
gggaccaagc tggagatcaa aaccacaaca cccgcccccc ggccccccac acccgccccc 840
acaatcgcca gccagcccct gagcctgagg cccgaggcct gccggcccgc cgccgggggg 900
gccgtgcaca caagggggct ggatttcgcc tgcgatatct acatctgggc ccccctggcc 960
ggcacctgcg gcgtgctgct gctgagcctc gtgatcacac tgtactgcaa gagggggcgg 1020
aagaagctgc tgtacatctt caagcagccc ttcatgaggc ccgtgcagac cacccaggag 1080
gaggacggct gttcctgtag gtttcctgag gaggaggaag gaggatgtga gttgcctaga 1140
gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 1200
aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1260
gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1320
ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1380
aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1440
gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgcggaagcg gagctactaa cttcagcctg 1500
ctgaagcagg ctggagacgt ggaggagaac cctggacct 1539
