一种基于pamam介导的生物素/链霉素级联放大免疫磁富集牡蛎中诺如病毒的方法
技术领域
：本发明属于生物
技术领域
，具体涉及一种基于PAMAM介导的生物素/链霉素级联放大免疫磁富集牡蛎中诺如病毒的方法及其应用。背景技术
：诺如病毒(Norovirus，NoV)是急性肠胃炎的主要致病原因之一，尤易引起群体性食品安全事件的暴发，造成高危人群的脱水性死亡，社会与经济损失巨大。牡蛎是滤食性动物，诺如病毒颗粒容易在其消化道中积聚。牡蛎的生食增加了诺如病毒传播的速度。因此牡蛎中的诺如病毒污染的诊断对于控制病毒暴发和确保患者获得最佳治疗至关重要。RT-qPCR是诺如病毒诊断和检测的“金标准”。但是，这种方法通常会受到牡蛎样品中诺如病毒含量较低和牡蛎组织中抑制剂的影响。因此，有必要建立一种有效的诺如病毒富集方法排除两者的干扰。传统的富集方法包括直接处理、聚乙二醇沉淀法和蛋白酶K法等都是非特异性的，不适合基质复杂的样品及大规模样品处理。
免疫磁富集(Immunomagnetic enrichment，IME)技术广泛应用于复杂样品中目标微生物的前处理检测，并且该过程比传统的非特异性前处理方法更有效。免疫磁富集法是以磁性微球作用固相表面，用于从复杂的基质中富集目标并显着提高系统的捕获率。此法操作步骤简单、样品处理时间短，广泛应用于病毒检测中，它可以有效的去除样本中的PCR抑制物。但传统的IME是将磁珠与抗体结合在一起，从复杂的基质中富集靶标物，该方法简单有效，但是体系很容易受到pH和偶联时间微小变化的影响。链霉亲和素(Streptavidin,SA)-生物素介导的IME因其高亲和力和特异性而获得了广泛的应用，SA是由相同亚基组成的四聚体蛋白，因此一个SA分子可以与四个生物素分子结合，在稳定的同时实现了信号的放大。
聚酰胺基胺(PAMAM)是一种具有大量可用于表面修饰(例如乙酰化，糖基化)的官能团的树状聚合物，具有良好的生物相容性，可以作为药物和基因的偶联载体，在生物学和医学领域具有良好的应用前景。
发明内容
：针对现有技术的特异性差、灵敏度低、耗时长等问题，本发明提供了一种基于PAMAM介导的生物素/链霉素级联放大免疫磁富集牡蛎中诺如病毒的方法。
本发明的基于PAMAM介导的生物素/链霉素级联放大免疫磁富集牡蛎中诺如病毒的方法，包括以下步骤：
将PAMAM进行生物素修饰，再结合抗诺如病毒抗体mAb，得到PAMAM-biotin-mAb，然后将PAMAM-biotin-mAb添加到牡蛎提取液中孵育，再加入链霉亲和素包被的磁珠孵育，然后磁分离，洗脱获得富集的牡蛎中诺如病毒。
优选，所述的PAMAM-biotin-mA、链霉亲和素包被的磁珠的用量质量比为40:60。
优选，所述的将PAMAM-biotin-mAb添加到牡蛎提取液中孵育，再加入链霉亲和素包被的磁珠孵育是每0.8～1ml牡蛎提取液中添加40μg PAMAM-biotin-mAb，孵育15～45min，再加入60～120μg链霉亲和素包被的磁珠孵育20～50min。
进一步优选，所述的将PAMAM-biotin-mAb添加到牡蛎提取液中孵育，再加入链霉亲和素包被的磁珠孵育是每0.8～1ml牡蛎提取液中添加40μg PAMAM-biotin-mAb，37℃孵育15min，再加入60μg链霉亲和素包被的磁珠37℃孵育20min。
所述的将PAMAM进行生物素修饰是PAMAM和sulfo-NHS-LC-biotin混合反应得到biotin-PAMAM，再将biotin-PAMAM与2-亚氨基硫烷.盐酸盐在氮气环境下反应，得到生物素修饰的PAMAM，即biotin-PAMAM-SH。
所述的结合抗诺如病毒抗体的具备步骤为：
将sulfo-SMCC与抗诺如病毒抗体结合形成SMCC-mAb，将SMCC-mAb与生物素修饰的PAMAM进行反应，然后用N-乙基顺丁烯二酰亚胺封闭未结合的巯基，得到PAMAM-biotin-mAb。
链霉亲和素包被的磁珠为纳米级，大小为750nm。
优选，所述的牡蛎提取液，制备方法为取1.5g的牡蛎消化腺组织，加入1mL DEPC处理的pH 7.2PBS均质后离心所得的上清液。
本发明的有益效果如下：
1、本发明在SA-biotin介导的免疫磁富集方法基础上引入PAMAM树杈状分子，利用PAMAM的分子表面具有大量带正电荷的氨基，一个PAMAM分子可以与多个生物素结合，放大生物素信号，这使得PAMAM-biotin-mAb分子比传统SA-biotin-mAb捕获更多的诺如病毒，从而提高了富集过程的捕获效率，与诺如病毒检测金标准RT-qPCR结合检测牡蛎中的诺如病毒，可明显提高检出率。该方法应用于富集牡蛎中的诺如病毒，具有操作简单，不需要复杂的设备，并且特别适用于具有复杂基质的样本检测，可以有效去除样本中抑制剂的感染，高效富集样品中的病原体。
2、PAMAM是具有大量可用于表面修饰(例如乙酰化，糖基化)的官能团的树状高分子聚合物，表面含有丰富的氨基，可以与含羧基的生物配体结合，其具有良好的生物相容性，没有免疫原性，十分适合作为药物和基因等的偶联载体，增加生物配体的暴露，提高灵敏度。
基于PAMAM的生物素/链霉素级联放大免疫磁富集诺如病毒的方法，可以特异性富集牡蛎中的目标病毒，是对传统富集方法非特异性的弥补，富集效率与检测周期均优于常规免疫磁富集方法。
附图说明
：图1：PAMAM介导的生物素/链霉素级联放大免疫磁富集原理图
图2：基于PAMAM的生物素/链霉素级联放大免疫磁富集方法的PAMAM-biotin-mAb用量优化；
图3：基于PAMAM的生物素/链霉素级联放大免疫磁富集方法免疫时间优化；
图4：基于PAMAM的生物素/链霉素级联放大免疫磁富集方法SA-MNP用量优化；
图5：基于PAMAM的生物素/链霉素级联放大免疫磁富集方法孵育时间优化。
具体实施方式
：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
1.PAMAM的生物素修饰
称取10mg的PAMAM，将其加入在1mL的pH 9.0的PBS溶液中，不断混匀，直至完全溶解，将1.6mg的sulfo-NHS-LC-biotin加入在PAMAM溶液中，将其固定在旋转混合仪上，持续反应2h。反应结束后转移至30KD的超滤管中再加入等体积的PBS溶液，5600rpm低温8℃离心10min，补充PBS溶液至原体积，重复上述步骤3-4次，除去未结合的sulfo-NHS-LC-biotin，得到biotin-PAMAM。再取2-亚氨基硫烷盐酸盐完全溶解于PBS溶液中，使其终浓度为1mg/mL，吸取175μL加入biotin-PAMAM溶液中，在氮气环境下反应1h，最后得到biotin-PAMAM-SH。
2.生物素化PAMAM抗体的制备
称取sulfo-SMCC(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐)使其终浓度为1mg/mL，吸取20μL溶液加入到500μL1 mg/mL抗诺如病毒抗体溶液中，于室温下充分反应2h。将sulfo-SMCC与抗体的反应液置于30KD的超滤离心管中，再加入200μLPBS溶液后，5600rpm低温8℃离心10min，补充PBS溶液至原体积，重复上述步骤3-4次，去除未结合的sulfo-SMCC对实验造成的影响，最后得到终产物为SMCC-mAb。
将上述制备的SMCC-mAb与biotin-PAMAM-SH充分混合，于室温孵育过夜。随后向溶液中加入500μg 200mM N-乙基顺丁烯二酰亚胺封闭未结合的巯基。将反应液置于50KD的超滤离心管，5600rpm低温8℃离心10min，补充PBS溶液至原体积，重复上述步骤3-4次。最后向纯化后的溶液中加入等体积的灭菌甘油，保存于-20℃。由此获得PAMAM-biotin-mAb。
实施例1：基于PAMAM介导的生物素/链霉素级联放大免疫磁富集牡蛎中诺如病毒方法的条件优化
具体步骤如下：
1)基于PAMAM介导的生物素/链霉素级联放大免疫磁富集原理如图1所示，首先对PAMAM-biotin-mAb的用量进行优化，取5支1.5mL离心管，依次编号1-5，将1mL PBS置于离心管中，加2μL诺如病毒样本，分别加入PAMAM-biotin-mAb 10μg、20μg、30μg、40μg、50μg，将离心管置于摇床37℃反应1h，转速180r/min。加入120μg SA-MNP于37℃反应1h，进行孵育。将离心管置于磁力架上磁分离5min，吸出上清液，用0.14mL PBS重悬免疫磁珠分离复合物，提取总RNA，利用RT-qPCR进行检测，确定PAMAM-biotin-mAb的最优量，结果如图2所示，最优量为40μg。
2)将1mL PBS分别加入5支离心管中，加2μL诺如病毒样本，分别加入优化浓度40μg的PAMAM-biotin-mAb，将离心管置于摇床37℃分别反应5min、15min、25min、35min、45min，转速180r/min，再加入120μg SA-MNP于37℃反应1h，进行孵育，将离心管置于磁力架上磁分离5min，吸出上清液，取0.14mL PBS重悬免疫磁珠分离复合物，提取总RNA，利用RT-qPCR进行检测，确定最佳免疫时间，结果如图3所示，最佳免疫时间是15-45min。
3)在5支含1mL PBS离心管中加2μL诺如病毒样本，分别加入优化浓度40μg的PAMAM-biotin-mAb，将离心管置于摇床37℃于优化免疫时间15min下反应，转速180r/min。再分别加入40μg、60μg、80μg、100μg、120μg SA-MNP于37℃反应1h，进行孵育。将离心管置于磁力架上磁分离5min，吸出上清液，用0.14mL PBS重悬免疫磁珠分离复合物，上清液提取总RNA，利用RT-qPCR进行检测，确定SA-MNP最佳用量，结果如图4所示，最佳用量范围是60～120μg。
4)将1mL PBS分别加入5支离心管中，加2μL诺如病毒样本，分别加入优化浓度40μg的PAMAM-biotin-mAb，将离心管置于摇床37℃反应15min，转速180r/min，再加入60μgSA-MNP于37℃反应时间分别为10min、20min、30min、40min、50min，进行孵育。将离心管置于磁力架上磁分离5min，吸出上清液，用0.14mL PBS重悬免疫磁珠分离复合物，提取复合物总RNA，利用RT-qPCR进行检测，确定最佳孵育时间，结果如图5所示，最佳孵育时间是20～50min。
试验结果：
基于PAMAM介导的生物素放大的磁富集分离方法中，PAMAM-biotin-mAb最佳用量为40μg，最佳免疫时间为15min，SA-MNP最佳用量为60μg，最佳孵育时间为20min。
实施例2：基于PAMAM介导的生物素/链霉素级联放大免疫磁富集牡蛎中诺如病毒方法的应用评价
具体步骤如下：
1)将44只牡蛎样本撬开贝壳，取下消化腺组织，并用手持均质机均质，每只牡蛎分成3份约1.5g左右的小份，用加入1mL DEPC处理的PBS(pH 7.2)均质，将均质后的组织充分混合。吸取后组织匀浆物约1mL，3000×g 4℃离心10min，取800μL上清液至另一个EP管中，此上清液为牡蛎提取液。
2)取PAMAM-biotin-mAb 40μg加入800μL牡蛎提取液中，置于摇床37℃孵育15分钟，转速180r/min，再加入SA-MNP 60μg于37℃孵育20分钟。最后将离心管置于磁力架上磁分离5min，吸弃上清液，用0.14mL PBS重悬免疫磁珠分离复合物。同时使用实验室已建立的传统免疫磁富集方法(磁珠直接偶联抗体)，SA-biotin免疫磁富集方法对样本进行富集，进行结果比较。
3)利用High Pure Viral RNA Mini Kit试剂盒提取三种富集方法得到的磁珠复合物中总RNA，采用一步法Taqman探针法荧光定量RT-PCR试剂盒进行检测，其中包括上游引物QNIF2d(5'ATG TTC AGR TGG ATG AGR TTC TCW GA 3')0.4μL，下游引物COG2R(5'TCGACG CCA TCT TCA TTC ACA 3')0.4μL，探针QNIFs(5'FAM-AGC ACG TGG GAG GGG ATC G-TAMRA)0.8μL，RNA 2μL，并设置阴性对照(模板以超纯水代替)。反应参数：42℃300s，95℃10s，95℃5s，60℃20s，共45个循环。最后通过标准曲线公式计算三种富集方法捕获样本的拷贝量。
试验结果：
表1三种免疫富集方法检测牡蛎中诺如病毒的结果比较
试验结论：三种富集方法对牡蛎中诺如病毒检测结果如表1所示，传统免疫富集方法的检出率为15.90％(7/44)，SA-biotin免疫富集方法检出率为18.80％(8/44)，而本发明中的PAMAM介导的生物素/链霉素级联放大免疫磁富集法(本发明)检出率为25％(11/44)，高于其他两种方法，不但缩短了检测时间，而且提高了检出率。
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