具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

靶向性三展示噬菌体phage-SV-MP-DE的特征在于P53蛋白三个表位多肽SV、MP及DE分别展示在丝状噬菌体的PIII蛋白、PVIII及PVI蛋白，其基因组序列如下：

AACGCTACTACCATTAGTAGAATTGATGCCACCTTTTCAGCTCGCGCCCCAAATGAAAATATAGCTAAACAGGTTATTGACCATTTGCGAAATGTATCTAATGGTCAAACTAAATCTACTCGTTCGCAGAATTGGGAATCAACTGTTACATGGAATAAAACTTCCAGACACCGTACTTTAGTTGCATATTTAAAACATGTTGAACTACAGCACCAGATTCAGCAATTAAGCTCTAAGCCATCCGCAAAAATGACCTCTTATCAAAAGGAGCAATTAAAGGTACTGTCTAATCCTGACCTGTTGGAATTTGCTTCCGGTCTGGTTCGCTTTGAGGCTCGAATTAAAACGCGATATTTGAAGTCTTTCGGGCTTCCTCTTAATCTTTTTGATGCAATTCGCTTTGCTTCTGACTATAATAGACAGGGTAAAGACCTGATTTTTGATTTATGGTCATTCTCTTTTTCTGAACTGTTTAAAGCATTTGAGGGGGATTCAATGAATATTTATGACGATTCCGCAGTATTGGACGCTATCCAGTCTAAACATTTTACAATTACCCCCTCTGGCAAAACTTCCTTTGCAAAAGCCTCTCGCTATTTTGGTTTCTATCGTCGTCTGGTTAATGAGGGTTATGATAGTGTTGCTCTTACCATGCCTCGTAATTCCTTTTGGCGTTATGTATCTGCATTAGTTGAGTGTGGTATTCCTAAATCTCAATTGATGAATCTTTCCACCTGTAATAATGTTGTTCCGTTAGTTCGTTTTATTAACGTAGATTTTTCCTCCCAACGTCCTGACTGGTATAATGAGCCAGTTCTTAAAATCGCATAAGGTAATTCAAAATGATTAAAGTTGAAATTAAACCATCTCAAGCGCAATTTACTACCCGTTCTGGTGTTTCTCGTCAGGGCAAGCCTTATTCACTGAATGAGCAGCTTTGTTACGTTGATTTGGGTAATGAATATCCGGTGCTTGTCAAGATTACTCTCGACGAAGGTCAGCCAGCGTATGCGCCTGGTCTGTACACCGTGCATCTGTCCTCGTTCAAAGTTGGTCAGTTCGGTTCTCTTATGATTGACCGTCTGCGCCTCGTTCCGGCTAAGTAACATGGAGCAGGTCGCGGATTTCGACACAATTTATCAGGCGATGATACAAATCTCCGTTGTACTTTGTTTCGCGCTTGGTATAATCGCTGGGGGTCAAAGATGAGTGTTTTAGTGTATTCTTTCGCCTCTTTCGTTTTAGGTTGGTGCCTTCGTAGTGGCATTACGTATTTTACCCGTTTAATGGAAACTTCCTCATGAAAAAGTCTTTAGTCCTCAAAGCCTCCGTAGCCGTTGCTACCCTCGTTCCGATGCTGTCTTTCGCTATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCCCGCAAAAGCGGCCTTTAACTCCCTGCAAGCCTCAGCGACCGAATATATCGGTTATGCGTGGGCGATGGTTGTTGTCATTGTCGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTGTTTAAGAAATTCACCTCGAAAGCAAGCTGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTGTCGACTAACGAGGGCAAATCATGAAATACCTATTGCCTACGGCGGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCATCAGACCTATGGAAACTACTTCCTGAAAACAACGTTGGCCCGGGAGGCCTGTCTCTAGAAGCCGAAACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACCTCATACAGAAAATTCATTTACTAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAGATCGTTACGCTAACTATGAGGGCTGTCTGTGGAATGCTACAGGCGTTGTGGTTTGTACTGGTGACGAAACTCAGTGTTACGGTACATGGGTTCCTATTGGGCTTGCTATCCCTGAAAATGAGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGTACTAAACCTCCTGAGTACGGTGATACACCTATTCCGGGCTATACTTATATCAACCCTCTCGACGGCACTTATCCGCCTGGTACTGAGCAAAACCCCGCTAATCCTAATCCTTCTCTTGAGGAGTCTCAGCCTCTTAATACTTTCATGTTTCAGAATAATAGGTTCCGAAATAGGCAGGGTGCATTAACTGTTTATACGGGCACTGTTACTCAAGGCACTGACCCCGTTAAAACTTATTACCAGTACACTCCTGTATCATCAAAAGCCATGTATGACGCTTACTGGAACGGTAAATTCAGAGACTGCGCTTTCCATTCTGGCTTTAATGAGGATCCATTCGTTTGTGAATATCAAGGCCAATCGTCTGACCTGCCTCAACCTCCTGTCAATGCTGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTTCTGGTGGCGGCTCTGAGGGTGGCGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCCGGTGGCGGCTCCGGTTCCGGTGATTTTGATTATGAAAAAATGGCAAACGCTAATAAGGGGGCTATGACCGAAAATGCCGATGAAAACGCGCTACAGTCTGACGCTAAAGGCAAACTTGATTCTGTCGCTACTGATTACGGTGCTGCTATCGATGGTTTCATTGGTGACGTTTCCGGCCTTGCTAATGGTAATGGTGCTACTGGTGATTTTGCTGGCTCTAATTCCCAAATGGCTCAAGTCGGTGACGGTGATAATTCACCTTTAATGAATAATTTCCGTCAATATTTACCTTCTTTGCCTCAGTCGGTTGAATGTCGCCCTTATGTCTTTGGCGCTGGTAAACCATATGAATTTTCTATTGATTGTGACAAAATAAACTTATTCCGTGGTGTCTTTGCGTTTCTTTTATATGTTGCCACCTTTATGTATGTATTTTCGACGTTTGCTAACATACTGCGTAATAAGGAGTCTTAATCATGCCAGTTCTTTTGGGTATTCCGTTATTATTGCGTTTCCTCGGTTTCCTTCTGGTAACTTTGTTCGGCTATCTGCTTACTTTCCTTAAAAAGGGCTTCGGTAAGATAGCTATTGCTATTTCATTGTTTCTTGCTCTTATTATTGGGCTTAACTCAATTCTTGTGGGTTATCTCTCTGATATTAGCGCACAATTACCCTCTGATTTTGTTCAGGGCGTTCAGTTAATTCTCCCGTCTAATGCGCTTCCCTGTTTTTATGTTATTCTCTCTGTAAAGGCTGCTATTTTCATTTTTGACGTTAAACAAAAAATCGTTTCTTATTTGGATTGGGATAAAGATATTGAACAATGGTTCACTGAATAAATATGGCTGTTTATTTTGTAACTGGCAAATTAGGCTCTGGAAAGACGCTCGTTAGCGTTGGTAAGATTCAGGATAAAATTGTAGCTGGGTGCAAAATAGCAACTAATCTTGATTTAAGGCTTCAAAACCTCCCGCAAGTCGGGAGGTTCGCTAAAACGCCTCGCGTTCTTAGAATACCGGATAAGCCTTCTATTTCTGATTTGCTTGCTATTGGTCGTGGTAATGATTCCTACGACGAAAATAAAAACGGTTTGCTTGTTCTTGATGAATGCGGTACTTGGTTTAATACCCGTTCATGGAATGACAAGGAAAGACAGCCGATTATTGATTGGTTTCTTCATGCTCGTAAATTGGGATGGGATATTATTTTTCTTGTTCAGGATTTATCTATTGTTGATAAACAGGCGCGTTCTGCATTAGCTGAACACGTTGTTTATTGTCGCCGTCTGGACAGAATTACTTTACCCTTTGTCGGCACTTTATATTCTCTTGTTACTGGCTCAAAAATGCCTCTGCCTAAATTACATGTTGGTGTTGTTAAATATGGTGATTCTCAATTAAGCCCTACTGTTGAGCGTTGGCTTTATACTGGTAAGAATTTATATAACGCATATGACACTAAACAGGCTTTTTCCAGTAATTATGATTCAGGTGTTTATTCATATTTAACCCCTTATTTATCACACGGTCGGTATTTCAAACCATTAAATTTAGGTCAGAAGATGAAATTAACTAAAATATATTTGAAAAAGTTTTCTCGCGTTCTTTGTCTTGCGATAGGATTTGCATCAGCATTTACATATAGTTATATAACCCAACCTAAGCCGGAGGTTAAAAAGGTAGTCTCTCAGACCTATGATTTTGATAAATTCACTATTGACTCTTCTCAGCGTCTTAATCTAAGCTATCGCTATGTTTTCAAGGATTCTAAGGGAAAATTAATTAATAGCGACGATTTACAGAAGCAAGGTTATTCCATCACATATATTGATTTATGTACTGTTTCAATTAAAAAAGGTAATTCAAATGAAATTGTTAAATGTAATTAATTTTGTTTTCTTGATGTTTGTTTCATCATCTTCTTTTGCTCAAGTAATTGAAATGAATAATTCGCCTCTGCGCGATTTCGTGACTTGGTATTCAAAGCAAACAGGTGAATCTGTTATTGTCTCACCTGATGTTAAAGGTACAGTGACTGTATATTCCTCTGACGTTAAGCCTGAAAATTTACGCAATTTCTTTATCTCTGTTTTACGTGCTAATAATTTTGATATGGTTGGCTCTAATCCTTCCATAATTCAGAAATATAACCCAAATAGTCAGGATTATATTGATGAATTGCCATCATCTGATATTCAGGAATATGATGATAATTCCGCTCCTTCTGGTGGTTTCTTTGTTCCGCAAAATGATAATGTTACTCAAACATTTAAAATTAATAACGTTCGCGCAAAGGATTTAATAAGGGTTGTAGAATTGTTTGTTAAATCTAATACATCTAAATCCTCAAATGTATTATCTGTTGATGGTTCTAACTTATTAGTAGTTAGCGCCCCTAAAGATATTTTAGATAACCTTCCGCAATTTCTTTCTACTGTTGATTTGCCAACTGACCAGATATTGATTGAAGGATTAATTTTCGAGGTTCAGCAAGGTGATGCTTTAGATTTTTCCTTTGCTGCTGGCTCTCAGCGCGGCACTGTTGCTGGTGGTGTTAATACTGACCGTCTAACCTCTGTTTTATCTTCTGCGGGTGGTTCGTTCGGTATTTTTAACGGCGATGTTTTAGGGCTATCAGTTCGCGCATTAAAGACTAATAGCCATTCAAAAATATTGTCTGTGCCTCGTATTCTTACGCTTTCAGGTCAGAAGGGTTCTATTTCTGTTGGCCAGAATGTCCCTTTTATTACTGGTCGTGTAACTGGTGAATCTGCCAATGTAAATAATCCATTTCAGACAATTGAGCGTCAAAATGTTGGTATTTCTATGAGTGTTTTTCCCGTTGCAATGGCTGGCGGTAATATTGTTTTAGATATAACCAGTAAGGCCGATAGTTTGAGTTCTTCTACTCAGGCAAGTGATGTTATTACTAATCAAAGAAGTATTGCGACAACGGTTAATTTGCGTGATGGTCAGACTCTTTTGCTCGGTGGCCTCACTGATTACAAAAACACTTCTCAAGATTCTGGTGTGCCGTTCCTGTCTAAAATCCCTTTAATCGGCCTCCTGTTTAGCTCCCGTTCTGATTCTAACGAGGAAAGCACGTTGTACGTGCTCGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCTCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGATCTCGGGAAAAGCGTTGGTGACCAAAGGTGCCTTTTATCATCACTTTAAAAATAAAAAACAATTACTCAGTGCCTGTTATAAGCAGCAATTAATTATGATTGATGCCTACATCACAACAAAAACTGATTTAACAAATGGTTGGTCTGCCTTAGAAAGTATATTTGAACATTATCTTGATTATATTATTGATAATAATAAAAACCTTATCCCTATCCAAGAAGTGATGCCTATCATTGGTTGGAATGAACTTGAAAAAATTAGCCTTGAATACATTACTGGTAAGGTAAACGCCATTGTCAGCAAATTGATCCAAGAGAACCAACTTAAAGCTTATGATGATGATGTGCTTAAAAACTTACTCAATGGCTGGTTTATGCATATCGCAATACATGCGAAAAACCTAAAAGAGCTTGCCGATAAAAAAGGCCAATTTATTGCTATTTACCGCGGCTTTTTATTGAGCTTGAAAGATAAATAAAATAGATAGGTTTTATTTGAAGCTAAATCTTCTTTATCGTAAAAAATGCCCTCTTGGGTTATCAAGAGGGTCATTATATTTCGCGGAATAAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTTGTTGACAAAGGGAATCATAGATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCTCCAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCACAACTAACCCGGCCTATTCTTTTGATTTATAAGGATTTTTGTCATTTTCTGCTTACTGGTTAAAAAATAAGCTGATTTAACAAATATTTAACGCGAAATTTAACAAAACATTAACGTTTACAATTTAAATATTTGCTTATACAATCATCCTGTTTTTGGGGCTTTTCTGATTATCAATCGGGGTACATATGATTGACATGCTAGTTTTACGATTACCGTTCATCGATTCTCTTGTTTGCTCCAGACTTTCAGGTAATGACCTGATAGCCTTTGTAGACCTCTCAAAAATAGCTACCCTCTCCGGCATGAATTTATCAGCTAGAACGGTTGAATATCATATTGACGGTGATTTGACTGTCTCCGGCCTTTCTCACCCGTTTGAATCTTTGCCTACTCATTACTCCGGCATTGCATTTAAAATATATGAGGGTTCTAAAAATTTTTATCCCTGCGTTGAAATTAAGGCTTCACCAGCAAAAGTATTACAGGGTCATAATGTTTTTGGTACAACCGATTTAGCTTTATGCTCTGAGGCTTTATTGCTTAATTTTGCTAACTCTCTGCCTTGCTTGTACGATTTATTGGATGTT；SEQ ID NO.1。

其中，在SEQ ID NO.1中，第1301-1369位所示核苷酸序列是编码PVIII蛋白的信号肽；第1370-1393位所示核苷酸序列是编码P53蛋白表位多肽MP的核苷酸序列；第1394-1525位所示核苷酸序列是编码PVIII蛋白的核苷酸序列；第1592-1657位所示核苷酸序列是编码PIII蛋白的信号肽；第1658-1693位所示核苷酸序列是编码P53蛋白表位多肽SV的核苷酸序列；第1694-1717位所示核苷酸序列是Linker；第1718-2935位所示核苷酸序列是编码PIII蛋白的核苷酸序列；第2941-3276位所示核苷酸序列是编码PVI蛋白的核苷酸序列；第3277-3300位所示核苷酸序列是编码P53蛋白表位多肽DE的核苷酸序列。靶向性三展示噬菌体phage-SV-MP-DE的制备步骤(示意图见图1)如下：(一)重组噬菌体载体fADL-le-SV的构建

1)噬菌体载体fADL-le(载体图谱见图2)的提取

利用Axygen的质粒小量提取试剂盒提取商业化的噬菌体载体fADL-le(AntibodyDesign laboratories，Catalog number：PD020)，具体步骤如下：

(1)取6ml在LB培养基中过夜培养的转化有载体fADL-le的菌液JM109，12000×g离心1min，弃尽上清；

(2)加250μl Buffer S1，悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块；

(3)加250μl Buffer S2，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液；

(4)加350μl Buffer S3，温和并充分地上下翻转6-8次，12000×g离心10min；

(5)吸取步骤(4)中离心后的上清，并转移到制备管中，12000×g离心1min，弃滤液；

(6)将制备管放回离心管，加500μl Buffer W1，12000×g离心1min，弃滤液；

(7)将制备管放回离心管，加700μl Buffer W2，12000×g离心1min，弃滤液；以同样的方法再用700μl Buffer W2洗涤一次，弃滤液；

(8)将制备管放回2ml离心管，12000×g离心1min；

(9)将制备管移入到新的1.5ml离心管中，在制备管的膜中央加50μlEluent溶液，室温静置1min，12000×g离心1min。

2)酶切fADL-le

Bgl I酶切载体fADL-le，具体酶切反应体系如下：

酶切反应条件为37℃水浴2h。噬菌体载体fADL-le的PIII基因经Bgl I酶切后，结果见图3。fADL-le载体主要以环状和线状的形式存在，酶切后均变为线性，初步证明酶切成功。

3)酶切载体的回收

对琼脂糖凝胶电泳证明酶切完全的载体进行切胶回收，按照DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN，Cat.No.AP-GX-50)的说明进行操作，具体如下：

(1)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎，计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积；

(2)加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热，间断混合，直至凝胶完全融化；

(3)加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀；

(4)吸取步骤(3)中的混合液，转移到DNA制备管中，12000×g离心1min，弃滤液；

(5)将制备管放回2ml离心管，加入500μl Buffer W1，12000×g离心1min，弃滤液；

(6)将制备管放回离心管，加700μl Buffer W2，12000×g离心1min，弃滤液；以同样的方法再用700μl Buffer W2洗涤一次，弃滤液；

(7)将制备管放回2ml离心管，12000×g离心1min；

(8)将制备管移入到新的1.5ml离心管中，在制备管的膜中央加10μl Eluent溶液，室温静置1min，12000×g离心1min。

4)噬菌体展示表位的合成

合成编码P53蛋白N端第20-31位氨基酸SDLWKLLPENNV(SEQ ID NO.2；简称SV)的两个互补DNA片段：

5’-CGGCCATGGCATCAGACCTATGGAAACTACTTCCTGAAAACAACGTTGGCCCGGG-3’；SEQ IDNO.3；

5’-GGGCCAACGTTGTTTTCAGGAAGTAGTTTCCATAGGTCTGATGCCATGGCCGGCT-3’；SEQ IDNO.4；

两种片段溶解后等摩尔混合，94℃变性5min后58℃复性4min，使两条片段互补结合成双链。

5)目的片段与fADL-le酶切载体的连接形成fADL-le-SV

将合成的目的片段与fADL-le酶切后载体连接，16℃反应过夜，连接反应体系如下：

6)重组载体fADL-le-SV转化大肠杆菌JM109感受态细胞

(1)在大肠杆菌JM109感受态细胞中加入10μl的连接产物，混匀，冰浴30min；

(2)42℃，热击90s；

(3)立即放置到冰上，冰浴10min；

(4)加入800μl LB培养基，37℃，100rpm，45min；

(5)将转化产物均匀涂在含有卡那霉素的LB固体培养基上面，完全吸收后，倒置于37℃培养箱中，过夜培养12h；

(6)挑取重组载体fADL-le-SV阳性克隆，进行PCR鉴定。

7)菌液PCR鉴定

挑单克隆，转入5ml含有卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm，8h，分别吸取1μl菌液作为模板进行菌液PCR鉴定，引物和扩增条件如下：

上游引物(PF1)：5’-ccgtgcatctgtcctcgttcaa-3’；SEQ ID NO.5；

下游引物(PR1)：5’-GTTTTCAGGAAGTAGTTTCCATAGGTC-3’；SEQ ID NO.6；

在载体fADL-le的pIII基因插入位点上游大约700bp处设计上游引物PF1，利用插入片段的反义链作为下游引物进行PCR验证，阳性克隆经PCR后会在700bp处出现特异性目的带，阴性克隆经PCR后无特异性条带的出现。

PCR反应体系如下：

PCR反应程序为：94℃预变性8min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min。

反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳，结果见图4；PCR结果显示，在500bp-750bp之间出现一条特异性目的条带，初步证明外源肽SV的编码片段被成功插入到噬菌体的pIII基因中。

将筛选到的阳性克隆送到上海生工生物技术服务有限公司进行测序，重组载体fADL-le-SV测序结果如下：

测序结果表明，目的片段(黑色加粗加下划线部分和图5)被成功克隆到噬菌体载体fADL-le的PIII基因中，且与连接的原始序列完全一致，表明重组载体fADL-le-SV构建成功。

(二)重组噬菌体载体fADL-le-SV-MP的构建

以构建好的噬菌体载体fADL-le-SV为模板，利用点突变试剂盒(Vazyme，货号：C215)将肽MP(编码P53蛋白N端第1-8位氨基酸MEEPQSDP，SEQ ID NO.8；简称MP)定向克隆到噬菌体的PVIII基因中，构建出重组噬菌粒fADL-le-SV-MP，具体步骤如下：

1)载体fADL-le-SV的扩增

利用试剂盒自带试剂进行PCR扩增，反应体系如下：

扩增反应所用引物PF2、PR2序列如下：

上游引物(PF2)：5’-atggaggagccgcagtcagatcccGCAAAAGCGGCC-3’；SEQ ID NO.9；

下游引物(PR2)：5’-tgactgcggctcctccatAGCGAAAGACAGCATCGGAA-3’；SEQ IDNO.10；

其中，小写字母为编码外源肽MP的部分序列，并用于后期同源重组形成环状重组噬菌粒fADL-le-SV-MP，大写字母用于扩增载体fADL-le-SV序列。

2)扩增产物Dpn I消化

因上一步的扩增产物中包含原始模板质粒，为防止其在转化后形成假阳性转化子，PCR扩增反应结束后加入1μl Dpn I，37℃消化2h，去除甲基化模板质粒。

3)重组反应形成fADL-le-SV-MP

重组反应体系如下(37℃反应30min)：

4)fADL-le-SV-MP转化大肠杆菌JM109细胞

(1)在大肠杆菌JM109感受态细胞中加入10μl的重组产物，混匀，冰浴30min；

(2)42℃，热击90s；

(3)立即放置到冰上，冰浴10min；

(4)加入800μl LB培养基，37℃，100rpm，45min；

(5)将转化产物均匀涂在含有卡那霉素的LB固体培养基上面，完全吸收后，倒置于37℃培养箱中，过夜培养12h；

(6)挑取重组载体fADL-le-SV-DP阳性克隆，将筛选到的阳性克隆送到上海生工生物技术服务有限公司进行测序。

测序结果如下：

测序结果表明，编码肽MP的目的片段(黑色加粗加下划线部分和图6)被成功克隆到噬菌体载体fADL-le-SV的PVIII基因中，且与连接的原始序列完全一致，表明重组噬菌体载体fADL-le-SV-MP构建成功。

(三)重组噬菌体载体fADL-le-SV-MP-DE的构建

以构建好的噬菌体载体fADL-le-SV-MP为模板，利用点突变试剂盒(Vazyme，货号：C215)将肽DE(编码P53蛋白N端第49-56位氨基酸DIEQWFTE，SEQ ID NO.12；简称DE)定向克隆到噬菌体的PVI基因中，构建获得重组噬菌体载体fADL-le-SV-MP-DE，整个操作过程与重组噬菌体载体fADL-le-SV-MP的构建一致，所用的扩增引物如下：

上游引物(PF3)：5’-attgaacaatggttcactgaaTAAATATGGCTGTTTATTTTGTAACTGG-3’；SEQ ID NO.13；

下游引物(PR3)：5’-cagtgaaccattgttcaatatcTTTATCCCAATCCAAATAAGAAACG-3’；SEQ ID NO.14；

其中，小写字母为编码外源肽DE的部分序列，并用于后期同源重组形成环状重组噬菌粒fADL-le-SV-MP-DE，大写字母用于扩增载体fADL-le-SV序列。

测序结果如下：

测序结果表明，编码肽DE的目的片段(黑色加粗加下划线部分和图7)被成功克隆到噬菌体载体fADL-le-SV-MP的PVI基因中，且与连接的原始序列完全一致，表明重组噬菌体载体fADL-le-SV-MP-DE构建成功，可用于下一步噬菌体的制备。

(四)噬菌体phage-SV-MP-DE的制备及原子力显微镜(AFM)观察分析

1)噬菌体phage-SV-MP-DE的制备

(1)将200μl测序正确的转化fADL-le-SV-MP-DE的JM109接种到含有100ml LB液体培养基(100μg/ml Kar⁺)的试管中，37℃剧烈震荡10h；

(2)8000rpm，10min，4℃，留上清；

(3)加入六分之一体积的PEG/NaCl溶液，涡旋，4℃过夜；

(4)12000rpm离心15min，用1ml TBS溶解噬菌体沉淀；

(5)将溶液转移至1.5ml EP管中，14000rpm离心1min，小心将上清转移至1.5ml EP管中，每个EP管中加入150μl PEG/NaCl，混匀后4℃过夜；

(6)14000rpm离心15min，用100μl TBS溶解噬菌体沉淀，4℃冰箱保存。

2)原子力显微镜(AFM)观察phage-SV-MP-DE

将噬菌体phage-SV-MP-DE用PBS缓冲液稀释到10⁷/ml，吸取20μl滴加到云母片上，低速旋涂1min，然后用AFM进行观察。

AFM的结果显示(图8)，靶向性三展示噬菌体phage-SV-MP-DE大约长900nm、宽7nm，具有相对柔性的结构，外源肽的展示对其形态结构无影响。

(四)噬菌体phage-SV-MP-DE检测癌症患者血清P53抗体的结果

(1)phage-SV-MP-DE-ELISA

以phage-SV-MP-DE为检测抗原，利用ELISA方法对60例乳腺癌患者及60例健康人(阴性对照)进行血清P53抗体的检测，具体步骤如下：

1)以phage-SV-MP-DE作为包被抗原(简称phage-SV-MP-DE-ELISA)包被96孔酶标板，浓度为60μg/ml，每孔50μl，放置湿盒中4℃过夜；

2)第二天，先用PBST缓冲液洗涤3次，每次3min，再用PBS溶液洗涤两次，每次3min；

3)每孔加入200μl封闭液封闭，37℃，1h；

4)洗涤后加入按照1:200稀释的乳腺癌患者或健康人血清，每孔50μl，37℃反应1h；

5)重复洗涤后加入1:5000倍稀释的HRP标记的山羊抗人IgG二抗，每孔50μl，37℃温育45min；

6)重复洗涤后加入100μl底物显色液TMB，室温避光反应12min，每孔加入50μl 2M的硫酸终止反应；

7)利用酶标仪检测OD450nm处的吸光值。每个样本的检测均为平行复孔，结果取检查结果的平均值。

(2)P53-ELISA

以重组P53蛋白(购自Abcam，Catalog number:ab82201)作为包被抗原检测血清53抗体的方法简称为P53-ELISA。除了酶标板上面包被的抗原为重组P53蛋白且浓度为5μg/ml外，整个实验流程与phage-SV-MP-DE-ELISA完全相同。

(3)cut-off值的确立

根据之前确立的phage-SV-MP-DE-ELISA及P53-ELISA检测体系，分别检测60例健康人血清，采用平均值+2SD的方法分别确立每种检测方法的cut-off值。

结果如图9所示，60例乳腺癌患者中，phage-SV-MP-DE检测到15例P53抗体阳性患者血清，检出率为25％，高于重组P53蛋白的检测效率(21.67％)，两种检测方法的特异性分别为95％(phage-SV-MP-DE-ELISA)、95.00％(P53-ELISA)。该结果表明，phage-SV-MP-DE在检测乳腺癌患者血清P53抗体方面，具有特异性强、灵敏度高且制备简单等优点，可用于乳腺癌患者血清P53抗体的检测应用研究。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 新乡学院

<120> 一种靶向性三展示噬菌体及其制备方法和应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8054

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

aacgctacta ccattagtag aattgatgcc accttttcag ctcgcgcccc aaatgaaaat 60

atagctaaac aggttattga ccatttgcga aatgtatcta atggtcaaac taaatctact 120

cgttcgcaga attgggaatc aactgttaca tggaataaaa cttccagaca ccgtacttta 180

gttgcatatt taaaacatgt tgaactacag caccagattc agcaattaag ctctaagcca 240

tccgcaaaaa tgacctctta tcaaaaggag caattaaagg tactgtctaa tcctgacctg 300

ttggaatttg cttccggtct ggttcgcttt gaggctcgaa ttaaaacgcg atatttgaag 360

tctttcgggc ttcctcttaa tctttttgat gcaattcgct ttgcttctga ctataataga 420

cagggtaaag acctgatttt tgatttatgg tcattctctt tttctgaact gtttaaagca 480

tttgaggggg attcaatgaa tatttatgac gattccgcag tattggacgc tatccagtct 540

aaacatttta caattacccc ctctggcaaa acttcctttg caaaagcctc tcgctatttt 600

ggtttctatc gtcgtctggt taatgagggt tatgatagtg ttgctcttac catgcctcgt 660

aattcctttt ggcgttatgt atctgcatta gttgagtgtg gtattcctaa atctcaattg 720

atgaatcttt ccacctgtaa taatgttgtt ccgttagttc gttttattaa cgtagatttt 780

tcctcccaac gtcctgactg gtataatgag ccagttctta aaatcgcata aggtaattca 840

aaatgattaa agttgaaatt aaaccatctc aagcgcaatt tactacccgt tctggtgttt 900

ctcgtcaggg caagccttat tcactgaatg agcagctttg ttacgttgat ttgggtaatg 960

aatatccggt gcttgtcaag attactctcg acgaaggtca gccagcgtat gcgcctggtc 1020

tgtacaccgt gcatctgtcc tcgttcaaag ttggtcagtt cggttctctt atgattgacc 1080

gtctgcgcct cgttccggct aagtaacatg gagcaggtcg cggatttcga cacaatttat 1140

caggcgatga tacaaatctc cgttgtactt tgtttcgcgc ttggtataat cgctgggggt 1200

caaagatgag tgttttagtg tattctttcg cctctttcgt tttaggttgg tgccttcgta 1260

gtggcattac gtattttacc cgtttaatgg aaacttcctc atgaaaaagt ctttagtcct 1320

caaagcctcc gtagccgttg ctaccctcgt tccgatgctg tctttcgcta tggaggagcc 1380

gcagtcagat cccgcaaaag cggcctttaa ctccctgcaa gcctcagcga ccgaatatat 1440

cggttatgcg tgggcgatgg ttgttgtcat tgtcggcgca actatcggta tcaagctgtt 1500

taagaaattc acctcgaaag caagctgata aaccgataca attaaaggct ccttttggag 1560

cctttttttt gtcgactaac gagggcaaat catgaaatac ctattgccta cggcggccgc 1620

tggattgtta ttactcgcgg cccagccggc catggcatca gacctatgga aactacttcc 1680

tgaaaacaac gttggcccgg gaggcctgtc tctagaagcc gaaactgttg aaagttgttt 1740

agcaaaacct catacagaaa attcatttac taacgtctgg aaagacgaca aaactttaga 1800

tcgttacgct aactatgagg gctgtctgtg gaatgctaca ggcgttgtgg tttgtactgg 1860

tgacgaaact cagtgttacg gtacatgggt tcctattggg cttgctatcc ctgaaaatga 1920

gggtggtggc tctgagggtg gcggttctga gggtggcggt tctgagggtg gcggtactaa 1980

acctcctgag tacggtgata cacctattcc gggctatact tatatcaacc ctctcgacgg 2040

cacttatccg cctggtactg agcaaaaccc cgctaatcct aatccttctc ttgaggagtc 2100

tcagcctctt aatactttca tgtttcagaa taataggttc cgaaataggc agggtgcatt 2160

aactgtttat acgggcactg ttactcaagg cactgacccc gttaaaactt attaccagta 2220

cactcctgta tcatcaaaag ccatgtatga cgcttactgg aacggtaaat tcagagactg 2280

cgctttccat tctggcttta atgaggatcc attcgtttgt gaatatcaag gccaatcgtc 2340

tgacctgcct caacctcctg tcaatgctgg cggcggctct ggtggtggtt ctggtggcgg 2400

ctctgagggt ggcggctctg agggtggcgg ttctgagggt ggcggctctg agggtggcgg 2460

ttccggtggc ggctccggtt ccggtgattt tgattatgaa aaaatggcaa acgctaataa 2520

gggggctatg accgaaaatg ccgatgaaaa cgcgctacag tctgacgcta aaggcaaact 2580

tgattctgtc gctactgatt acggtgctgc tatcgatggt ttcattggtg acgtttccgg 2640

ccttgctaat ggtaatggtg ctactggtga ttttgctggc tctaattccc aaatggctca 2700

agtcggtgac ggtgataatt cacctttaat gaataatttc cgtcaatatt taccttcttt 2760

gcctcagtcg gttgaatgtc gcccttatgt ctttggcgct ggtaaaccat atgaattttc 2820

tattgattgt gacaaaataa acttattccg tggtgtcttt gcgtttcttt tatatgttgc 2880

cacctttatg tatgtatttt cgacgtttgc taacatactg cgtaataagg agtcttaatc 2940

atgccagttc ttttgggtat tccgttatta ttgcgtttcc tcggtttcct tctggtaact 3000

ttgttcggct atctgcttac tttccttaaa aagggcttcg gtaagatagc tattgctatt 3060

tcattgtttc ttgctcttat tattgggctt aactcaattc ttgtgggtta tctctctgat 3120

attagcgcac aattaccctc tgattttgtt cagggcgttc agttaattct cccgtctaat 3180

gcgcttccct gtttttatgt tattctctct gtaaaggctg ctattttcat ttttgacgtt 3240

aaacaaaaaa tcgtttctta tttggattgg gataaagata ttgaacaatg gttcactgaa 3300

taaatatggc tgtttatttt gtaactggca aattaggctc tggaaagacg ctcgttagcg 3360

ttggtaagat tcaggataaa attgtagctg ggtgcaaaat agcaactaat cttgatttaa 3420

ggcttcaaaa cctcccgcaa gtcgggaggt tcgctaaaac gcctcgcgtt cttagaatac 3480

cggataagcc ttctatttct gatttgcttg ctattggtcg tggtaatgat tcctacgacg 3540

aaaataaaaa cggtttgctt gttcttgatg aatgcggtac ttggtttaat acccgttcat 3600

ggaatgacaa ggaaagacag ccgattattg attggtttct tcatgctcgt aaattgggat 3660

gggatattat ttttcttgtt caggatttat ctattgttga taaacaggcg cgttctgcat 3720

tagctgaaca cgttgtttat tgtcgccgtc tggacagaat tactttaccc tttgtcggca 3780

ctttatattc tcttgttact ggctcaaaaa tgcctctgcc taaattacat gttggtgttg 3840

ttaaatatgg tgattctcaa ttaagcccta ctgttgagcg ttggctttat actggtaaga 3900

atttatataa cgcatatgac actaaacagg ctttttccag taattatgat tcaggtgttt 3960

attcatattt aaccccttat ttatcacacg gtcggtattt caaaccatta aatttaggtc 4020

agaagatgaa attaactaaa atatatttga aaaagttttc tcgcgttctt tgtcttgcga 4080

taggatttgc atcagcattt acatatagtt atataaccca acctaagccg gaggttaaaa 4140

aggtagtctc tcagacctat gattttgata aattcactat tgactcttct cagcgtctta 4200

atctaagcta tcgctatgtt ttcaaggatt ctaagggaaa attaattaat agcgacgatt 4260

tacagaagca aggttattcc atcacatata ttgatttatg tactgtttca attaaaaaag 4320

gtaattcaaa tgaaattgtt aaatgtaatt aattttgttt tcttgatgtt tgtttcatca 4380

tcttcttttg ctcaagtaat tgaaatgaat aattcgcctc tgcgcgattt cgtgacttgg 4440

tattcaaagc aaacaggtga atctgttatt gtctcacctg atgttaaagg tacagtgact 4500

gtatattcct ctgacgttaa gcctgaaaat ttacgcaatt tctttatctc tgttttacgt 4560

gctaataatt ttgatatggt tggctctaat ccttccataa ttcagaaata taacccaaat 4620

agtcaggatt atattgatga attgccatca tctgatattc aggaatatga tgataattcc 4680

gctccttctg gtggtttctt tgttccgcaa aatgataatg ttactcaaac atttaaaatt 4740

aataacgttc gcgcaaagga tttaataagg gttgtagaat tgtttgttaa atctaataca 4800

tctaaatcct caaatgtatt atctgttgat ggttctaact tattagtagt tagcgcccct 4860

aaagatattt tagataacct tccgcaattt ctttctactg ttgatttgcc aactgaccag 4920

atattgattg aaggattaat tttcgaggtt cagcaaggtg atgctttaga tttttccttt 4980

gctgctggct ctcagcgcgg cactgttgct ggtggtgtta atactgaccg tctaacctct 5040

gttttatctt ctgcgggtgg ttcgttcggt atttttaacg gcgatgtttt agggctatca 5100

gttcgcgcat taaagactaa tagccattca aaaatattgt ctgtgcctcg tattcttacg 5160

ctttcaggtc agaagggttc tatttctgtt ggccagaatg tcccttttat tactggtcgt 5220

gtaactggtg aatctgccaa tgtaaataat ccatttcaga caattgagcg tcaaaatgtt 5280

ggtatttcta tgagtgtttt tcccgttgca atggctggcg gtaatattgt tttagatata 5340

accagtaagg ccgatagttt gagttcttct actcaggcaa gtgatgttat tactaatcaa 5400

agaagtattg cgacaacggt taatttgcgt gatggtcaga ctcttttgct cggtggcctc 5460

actgattaca aaaacacttc tcaagattct ggtgtgccgt tcctgtctaa aatcccttta 5520

atcggcctcc tgtttagctc ccgttctgat tctaacgagg aaagcacgtt gtacgtgctc 5580

gtcaaagcaa ccatagtacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt 5640

tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt 5700

cccttccttt ctcgccacgt tctccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggatctc 5760

gggaaaagcg ttggtgacca aaggtgcctt ttatcatcac tttaaaaata aaaaacaatt 5820

actcagtgcc tgttataagc agcaattaat tatgattgat gcctacatca caacaaaaac 5880

tgatttaaca aatggttggt ctgccttaga aagtatattt gaacattatc ttgattatat 5940

tattgataat aataaaaacc ttatccctat ccaagaagtg atgcctatca ttggttggaa 6000

tgaacttgaa aaaattagcc ttgaatacat tactggtaag gtaaacgcca ttgtcagcaa 6060

attgatccaa gagaaccaac ttaaagctta tgatgatgat gtgcttaaaa acttactcaa 6120

tggctggttt atgcatatcg caatacatgc gaaaaaccta aaagagcttg ccgataaaaa 6180

aggccaattt attgctattt accgcggctt tttattgagc ttgaaagata aataaaatag 6240

ataggtttta tttgaagcta aatcttcttt atcgtaaaaa atgccctctt gggttatcaa 6300

gagggtcatt atatttcgcg gaataaacca attaaccaat tctgattaga aaaactcatc 6360

gagcatcaaa tgaaactgca atttattcat atcaggatta tcaataccat atttttgaaa 6420

aagccgtttc tgtaatgaag gagaaaactc accgaggcag ttccatagga tggcaagatc 6480

ctggtatcgg tctgcgattc cgactcgtcc aacatcaata caacctatta atttcccctc 6540

gtcaaaaata aggttatcaa gtgagaaatc accatgagtg acgactgaat ccggtgagaa 6600

tggcaaaagc ttatgcattt ctttccagac ttgttcaaca ggccagccat tacgctcgtc 6660

atcaaaatca ctcgcatcaa ccaaaccgtt attcattcgt gattgcgcct gagcgagacg 6720

aaatacgcga tcgctgttaa aaggacaatt acaaacagga atcgaatgca accggcgcag 6780

gaacactgcc agcgcatcaa caatattttc acctgaatca ggatattctt ctaatacctg 6840

gaatgctgtt ttcccgggga tcgcagtggt gagtaaccat gcatcatcag gagtacggat 6900

aaaatgcttg atggtcggaa gaggcataaa ttccgtcagc cagtttagtc tgaccatctc 6960

atctgtaaca tcattggcaa cgctaccttt gccatgtttc agaaacaact ctggcgcatc 7020

gggcttccca tacaatcgat agattgtcgc acctgattgc ccgacattat cgcgagccca 7080

tttataccca tataaatcag catccatgtt ggaatttaat cgcggcctcg agcaagacgt 7140

ttcccgttga atatggctca taacacccct tgtattactg tttatgtaag cagacagttt 7200

tattgttcat gatgatatat ttttatcttg tgcaatgtaa catcagagat tttgagacac 7260

aacgtggctt ttgttgacaa agggaatcat agatcccttt agggttccga tttagtgctt 7320

tacggcacct cgacctccaa aaacttgatt tgggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc 7380

cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct 7440

tgttccaaac tggaacaaca ctcacaacta acccggccta ttcttttgat ttataaggat 7500

ttttgtcatt ttctgcttac tggttaaaaa ataagctgat ttaacaaata tttaacgcga 7560

aatttaacaa aacattaacg tttacaattt aaatatttgc ttatacaatc atcctgtttt 7620

tggggctttt ctgattatca atcggggtac atatgattga catgctagtt ttacgattac 7680

cgttcatcga ttctcttgtt tgctccagac tttcaggtaa tgacctgata gcctttgtag 7740

acctctcaaa aatagctacc ctctccggca tgaatttatc agctagaacg gttgaatatc 7800

atattgacgg tgatttgact gtctccggcc tttctcaccc gtttgaatct ttgcctactc 7860

attactccgg cattgcattt aaaatatatg agggttctaa aaatttttat ccctgcgttg 7920

aaattaaggc ttcaccagca aaagtattac agggtcataa tgtttttggt acaaccgatt 7980

tagctttatg ctctgaggct ttattgctta attttgctaa ctctctgcct tgcttgtacg 8040

atttattgga tgtt 8054

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val

1 5 10

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

cggccatggc atcagaccta tggaaactac ttcctgaaaa caacgttggc ccggg 55

<210> 4

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gggccaacgt tgttttcagg aagtagtttc cataggtctg atgccatggc cggct 55

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ccgtgcatct gtcctcgttc aa 22

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

gttttcagga agtagtttcc ataggtc 27

<210> 7

<211> 626

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

acaatttatc aggcgatgat acaaatctcc gttgtacttt gtttcgcgct tggtataatc 60

gctgggggtc aaagatgagt gttttagtgt attctttcgc ctctttcgtt ttaggttggt 120

gccttcgtag tggcattacg tattttaccc gtttaatgga aacttcctca tgaaaaagtc 180

tttagtcctc aaagcctccg tagccgttgc taccctcgtt ccgatgctgt ctttcgctgc 240

tgagggtgac gatcccgcaa aagcggcctt taactccctg caagcctcag cgaccgaata 300

tatcggttat gcgtgggcga tggttgttgt cattgtcggc gcaactatcg gtatcaagct 360

gtttaagaaa ttcacctcga aagcaagctg ataaaccgat acaattaaag gctccttttg 420

gagccttttt tttgtcgact aacgagggca aatcatgaaa tacctattgc ctacggcggc 480

cgctggattg ttattactcg cggcccagcc ggccatggca tcagacctat ggaaactact 540

tcctgaaaac aacgttggcc cgggaggcct gtctctagaa gccgaaactg ttgaaagttg 600

tttagcaaaa cctcatacag aaaatc 626

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 8

Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro

1 5

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

atggaggagc cgcagtcaga tcccgcaaaa gcggcc 36

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

tgactgcggc tcctccatag cgaaagacag catcggaa 38

<210> 11

<211> 688

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

tacaaatctc cgttgtactt tgtttcgcgc ttggtataat cgctgggggt caaagatgag 60

tgtttagtgt attctttcgc ctctttcgtt ttaggttggt gccttcgtag tggcattacg 120

tattttaccc gtttaatgga aacttcctca tgaaaaagtc tttagtcctc aaagcctccg 180

tagccgttgc taccctcgtt ccgatgctgt ctttcgctat ggaggagccg cagtcagatc 240

ccgcaaaagc ggcctttaac tccctgcaag cctcagcgac cgaatatatc ggttatgcgt 300

gggcgatggt tgttgtcatt gtcggcgcaa ctatcggtat caagctgttt aagaaattca 360

cctcgaaagc aagctgataa accgatacaa ttaaaggctc cttttggagc cttttttttg 420

tcgactaacg agggcaaatc atgaaatacc tattgcctac ggcggccgct ggattgttat 480

tactcgcggc ccagccggcc atggcatcag acctatggaa actacttcct gaaaacaacg 540

ttggcccggg aggcctgtct ctagaagccg aaactgttga aagttgttta gcaaaacctc 600

atacagaaaa ttcatttact aacgtctgga aagacgacaa aactttagat cgttacgcta 660

actatgaggg ctgtctgtgg aatgctac 688

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 12

Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu

1 5

<210> 13

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

attgaacaat ggttcactga ataaatatgg ctgtttattt tgtaactgg 49

<210> 14

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

cagtgaacca ttgttcaata tctttatccc aatccaaata agaaacg 47

<210> 15

<211> 460

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

tttcattgtt tcttgctctt attattgggc ttaactcaat tcttgtgggt tatctctctg 60

atattagcgc acaattaccc tctgattttg ttcagggcgt tcagttaatt ctcccgtcta 120

atgcgcttcc ctgtttttat gttattctct ctgtaaaggc tgctattttc atttttgacg 180

ttaaacaaaa aatcgtttct tatttggatt gggataaaga tattgaacaa tggttcactg 240

aataaatatg gctgtttatt ttgtaactgg caaattaggc tctggaaaga cgctcgttag 300

cgttggtaag attcaggata aaattgtagc tgggtgcaaa atagcaacta atcttgattt 360

aaggcttcaa aacctcccgc aagtcgggag gttcgctaaa acgcctcgcg ttcttagaat 420

accggataag ccttctattt ctgatttgct tgctattggt 460